決明子蒽醌苷通過Nrf2/ARE信號通路抑制冠心病大鼠心肌損傷

馬永，趙斌，王明崗，金愛蓮*

（1商丘市第一人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，商丘 476000；2商丘市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，商丘 476000；3商丘市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，商丘 476000；4商丘市第一人民醫(yī)院心臟重癥監(jiān)護(hù)室，商丘 47600）

冠心病是威脅人類生命健康的主要疾病之一。冠心病病情加重可導(dǎo)致心肌梗死、腦卒中等不良心血管事件的發(fā)生[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，炎癥、氧化應(yīng)激及心肌細(xì)胞凋亡與冠心病發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[2]。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）激活后可進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化元件（antioxidant response element，ARE）結(jié)合，影響缺氧誘導(dǎo)因子 -1α（hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α）及抗氧化、抗炎相關(guān)因子表達(dá)，來參與細(xì)胞應(yīng)激性損傷及凋亡過程，而有望成為冠心病治療的新靶點(diǎn)[3,4]。

決明子蒽醌苷（anthraquinone glycoside from cassia, AQGC）是決明子中的主要有效成分。近來臨床報(bào)道發(fā)現(xiàn)，其對非酒精性脂肪肝病[5]、高血壓及心肌損傷[6]患者有較好的療效，由此提示AQGC也可能是緩解冠心病進(jìn)一步發(fā)生發(fā)展的潛在藥物。本研究建立大鼠冠心病模型，對此進(jìn)行探究驗(yàn)證，以期為AQGC的臨床推廣及應(yīng)用，奠定實(shí)驗(yàn)及理論基礎(chǔ)。

材料及方法

1 材料

SD大鼠70只，雄性，健康，清潔級，體重200～220 g，購自安徽豐原藥業(yè)股份有限公司，批號：SYXK（皖）2020-003。所有大鼠于本院動物房中飼養(yǎng)。本研究經(jīng)本院動物倫理委員會批準(zhǔn)同意，批號為IACUC-01（20201017）。AQGC（批號：20200211004，陜西元朗生物工程有限公司）；脂肪乳（貨號：rc1020，上海熱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司）；維生素D3（貨號：30056387，深圳海思安生物技術(shù)有限公司）；垂體后葉素（貨號：TJ8199，杭州肽佳生物科技有限公司）；Nrf2抑制劑-全反式維甲酸（ATRA）（貨號：302-79-4，上海聯(lián)碩生物科技有限公司）；缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor, HIF-1α）抑制劑-2-甲氧雌二醇（2ME2）（貨號：T2220，南京賽泓瑞生物科技有限公司）；HE及TUNEL染色試劑盒（貨號：SY2022，YT2205，北京伊塔生物科技有限公司）；總膽固醇ELISA試劑盒（貨號：YS04424B，上海雅吉生物科技有限公司）、活性氧簇（ROS）ELISA試劑盒（貨號：R32034，上海圻明生物科技有限公司）、丙二醛（MDA）ELISA試劑盒（貨號：lisa385，上海廣銳生物科技有限公司）；兔源Nrf2（貨號：ab31163）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）（貨號：ab138491）、超氧化歧化酶2（SOD2）（貨號：ab68155）、內(nèi)脂素（visfatin）（貨號：ab236873）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（貨號：ab109322）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）（貨號：ab181095）、白細(xì)胞介素-18（IL-18）（貨號：ab191860）、HIF-1α（貨號：ab179483）、E1B相互作用蛋白3（BNIP3）（貨號：ab109362）、半胱天冬酶-1（Caspase-1）（ab179515）抗體和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（貨號：ab6721）均購自英國Abcam公司。

2 大鼠冠心病模型建立及分組處理

參照文獻(xiàn)[7]方法，取大鼠每日腹腔注射60萬單位 / kg的維生素D3+灌胃10 mL / kg的脂肪乳，連續(xù)12周，建立大鼠冠心病模型，造模結(jié)束前3 d，每日腹腔注射30萬單位 / kg垂體后葉素，共3次后，用心電圖檢測PR段基線J點(diǎn)位移，以J點(diǎn)變化幅度超過0.1 mV，視為造模成功，共造模成功50只（10只未成功），隨機(jī)分為模型組、AQGC組、Nrf2抑制劑組、AQGC+Nrf2抑制劑組和缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）抑制劑組，每組10只；另取10只健康大鼠，在相同時(shí)間條件下灌胃及注射生理鹽水，作為正常對照組。

AQGC組參照文獻(xiàn)[5]經(jīng)腹腔注射給藥20 mg /kg，1次 / d，連續(xù)2周；Nrf2抑制劑組根據(jù)文獻(xiàn)[8]經(jīng)腹腔注射7 mg / kg的Nrf2抑制劑-全反式維甲酸（ATRA），2次 / d；HIF-1α抑制劑組參照文獻(xiàn)[9]經(jīng)腹腔注射15 mg / kg的HIF-1α抑制劑-2-甲氧雌二醇（2ME2），2次/ d；AQGC+Nrf2抑制劑組同時(shí)腹腔注射Nrf2抑制劑及AQGC進(jìn)行干預(yù)；模型組及對照組給予等劑量的生理鹽水進(jìn)行干預(yù)。

3 超聲心動圖檢測心功能變化

各組大鼠給藥結(jié)束后，用超聲心動圖檢測心功指標(biāo)左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS），以評價(jià)心功能變化。

4 ELISA法檢測總膽固醇及心肌組織氧化應(yīng)激產(chǎn)物

麻醉大鼠后，取腹主動脈血2 mL，按ELISA試劑盒法檢測血清總膽固醇水平。斷頭處死大鼠，解剖取心臟組織，剪取心尖組織約0.5 g，機(jī)械粉碎勻漿后，取勻漿液，按ELISA試劑盒法測氧化應(yīng)激產(chǎn)物ROS及MDA水平。剩余心肌組織分成兩部分，一部分置于-80 ℃保存?zhèn)溆茫硪徊糠盅杆僦糜?%多聚甲醛中固定24 h后，制成5 μm的石蠟切片，備用。

5 HE及TUNEL染色觀察大鼠心肌組織損傷及凋亡狀況

取心肌組織石蠟切片，脫蠟水化及抗原修復(fù)處理后，按HE及TUNEL染色液說明書方法染色處理后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。TUNEL染色切片隨機(jī)取5個(gè)視野，以Image-Pro Plus 6.0軟件分析每視野下凋亡細(xì)胞（陽性染色為紅棕色）數(shù)目，根據(jù)公式凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目×100%，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

6 免疫組織化學(xué)染色

取相同部位心肌組織切片，脫蠟、脫水、透化后，在4 ℃孵育盒中滴加1∶100的抗Nrf2一抗（1∶100）孵育過夜，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1∶1000）室溫孵育及DAB顯色后，光鏡下觀察拍照，每個(gè)切片隨機(jī)取5個(gè)視野，Image-Pro Plus 6.0軟件分析每視野下Nrf2免疫反應(yīng)性（平均光密度值）。

7 Western blot

取冰凍心肌組織，4 ℃解凍及機(jī)械勻漿處理后，取勻漿液，提取胞質(zhì)及胞核蛋白，BCA法測蛋白濃度，取80 μg蛋白樣品行電泳及轉(zhuǎn)膜處理，加入1 ∶ 1200 的 Nrf2、GST、SOD2、visfatin、TNF-α、MCP-1、IL-18、HIF-1α、BNIP3、Caspase-1 一抗抗體，及1∶1500的內(nèi)參蛋白β-actin一抗抗體，4 ℃孵育過夜后，加入1∶1000的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗溶液，室溫孵育1.5 h后，發(fā)光試劑盒法顯色，化學(xué)發(fā)光儀采集照片，Image-J軟件分析蛋白條帶光密度，以各目的蛋白條帶光密度值與內(nèi)參蛋白條帶光密度值的比值為相應(yīng)目的蛋白相對表達(dá)水平。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS22.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，兩組比較、組間比較及組間多重比較，分別用t檢驗(yàn)、單因素方差分析及snk-q檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 Nrf2抑制劑阻斷決明子蒽醌苷對冠心病大鼠心功能損傷的改善

與正常對照組相比，模型組大鼠心功能 LVEF及LVFS降低；與模型組相比，AQGC組及HIF-1α抑制劑組大鼠LVEF及LVFS升高；Nrf2抑制劑組LVEF及LVFS進(jìn)一步降低；與AQGC組相比，決明子+Nrf2抑制劑組LVEF及LVFS降低（表1）。

表1 決明子蒽醌苷和Nrf2抑制劑對冠心病大鼠心功能影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Tab.1 Statistical analysis for the effect of anthraquinone glycoside from cassia and Nrf2 inhibitor on cardiac function of rats with coronary heart disease

2 Nrf2抑制劑阻斷決明子蒽醌苷對冠心病大鼠心肌組織損傷及細(xì)胞凋亡的抑制

正常對照組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊、染色均勻，無炎性浸潤；模型組大鼠心肌細(xì)胞肥大、胞質(zhì)染色不均勻、胞核變形，細(xì)胞間間隙變寬，心肌纖維萎縮且排列紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤明顯，TUNEL染色可見紅棕色陽性染色的凋亡細(xì)胞比例明高于正常對照組；AQGC組及HIF-1α抑制劑組心肌組織細(xì)胞上述病理損傷較模型組減輕，細(xì)胞凋亡率低于模型組；Nrf2抑制劑組心肌組織細(xì)胞上述病理損傷最嚴(yán)重，細(xì)胞凋亡率較模型組升高；與AQGC組相比，AQGC+Nrf2抑制劑組心肌組織細(xì)胞損傷嚴(yán)重，心肌細(xì)胞凋亡升高（圖1，表2）。

表2 決明子蒽醌苷和Nrf2抑制劑對冠心病大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率影響的定量分析Tab.2 Quantitative analysis for the effect of anthraquinone glycoside from cassia and Nrf2 inhibitor on apoptosis rate in the myocardial tissue of the rats with coronary heart disease

3 Nrf2抑制劑阻斷決明子蒽醌苷對冠心病大鼠血脂及心肌組織氧化應(yīng)激產(chǎn)物的降低

與正常對照組相比，模型組大鼠血脂-血清總膽固醇水平、心肌組織氧化應(yīng)激產(chǎn)物ROS及MDA水平升高；與模型組相比，AQGC組及HIF-1α抑制劑組大鼠血清總膽固醇水平、心肌組織ROS及MDA水平降低；Nrf2抑制劑組血清總膽固醇水平、心肌組織ROS及MDA水平進(jìn)一步升高；與AQGC組相比，AQGC+Nrf2抑制劑組血清總膽固醇水平、心肌組織ROS及MDA水平升高（表3）。

4 Nrf2抑制劑阻斷決明子蒽醌苷對冠心病大鼠Nrf2及其下游抗氧化應(yīng)激蛋白表達(dá)的上調(diào)

免疫組織化學(xué)染色顯示，模型組大鼠心肌組織細(xì)胞中Nrf2呈強(qiáng)陽性表達(dá)。與正常對照組相比，模型組大鼠心肌組織Nrf2陽性表達(dá)、蛋白表達(dá)均升高，其下游抗氧化酶活性蛋白GST及SOD2表達(dá)降低；與模型組相比，AQGC及HIF-1α抑制劑組大鼠Nrf2表達(dá)進(jìn)一步升高，其下游抗氧化酶活性蛋白GST及SOD2表達(dá)升高；Nrf2抑制劑組Nrf2及GST及SOD2表達(dá)降低。與AQGC組相比，AQGC+Nrf2抑制劑組Nrf2及GST及SOD2表達(dá)降低（圖2，表4）。

表4 決明子蒽醌苷和Nrf2抑制劑對冠心病大鼠心肌組織Nrf2及其下游抗氧化應(yīng)激蛋白表達(dá)影響的定量分析Tab.4 Quantitative analysis for the effect of anthraquinone glycoside from cassia and Nrf2 inhibitor on the expression of Nrf2 and its downstream antioxidant stress proteins in the myocardial tissue of the rats with coronary heart disease

圖2 決明子蒽醌苷和Nrf2抑制劑對冠心病大鼠心肌組織Nrf2及其下游抗氧化應(yīng)激蛋白表達(dá)的影響。A，Nrf2表達(dá)的代表性免疫組織化學(xué)檢測；比例尺，100 μm。B，Nrf2、SOD、GST水平的代表性Western blot檢測Fig.2 Effect of anthraquinone glycoside from cassia and Nrf2 inhibitor on the expression of Nrf2 and its downstream antioxidant stress proteins in the myocardial tissue of the rats with coronary heart disease.Scale bar, 100 μm

5 Nrf2抑制劑阻斷決明子蒽醌苷對冠心病大鼠心肌組織炎性反應(yīng)相關(guān)蛋白表達(dá)的下調(diào)

與正常對照組相比，模型組大鼠心肌組織visfatin、TNF-α、MCP-1、IL-18蛋白表達(dá)升高；與模型組相比，AQGC組及HIF-1α抑制劑組大鼠visfatin、TNF-α、MCP-1、IL-18表達(dá)降低；Nrf2抑制劑組大鼠心肌組織visfatin、TNF-α、MCP-1、IL-18蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高。與AQGC組相比，AQGC+Nrf2抑制劑組大鼠visfatin、TNF-α、MCP-1、IL-18蛋白表達(dá)升高（圖3）。

圖3 決明子蒽醌苷和Nrf2抑制劑對冠心病大鼠心肌組織炎性反應(yīng)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。A， visfatin、TNF-α、MCP-1和IL-18水平的代表性Western blot檢測；B—E，visfatin、TNF-α、MCP-1和IL-18水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與正常對照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與AQGC組相比，cP＜0.05；n=10Fig.3 Effect of anthraquinone glycoside from cassia and Nrf2 inhibitor on the expression of inflammatory response-related proteins in the myocardial tissue of the rats with coronary heart disease; A, representative Western blot detection of levels of visfatin, TNF-α, MCP-1 and IL-18; B to E, statistical analysis of levels of visfatin, TNF-α, MCP-1 and IL-18; aP＜0.05, compared with the normal control group; bP＜0.05, compared with the model group;cP＜0.05, compared with AQGC group; n=10

6 Nrf2抑制劑阻斷決明子蒽醌苷對冠心病大鼠心肌組織凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)的下調(diào)

與正常對照組相比，模型組大鼠心肌組織HIF-1α、BNIP3、caspase-1蛋白表達(dá)升高；與模型組相比，AQGC組及HIF-1α抑制劑組大鼠HIF-1α、BNIP3、caspase-1表達(dá)降低；Nrf2抑制劑組大鼠心肌組織HIF-1α、BNIP3、caspase-1蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高。與AQGC組相比，AQGC+Nrf2抑制劑組大鼠HIF-1α、BNIP3、caspase-1蛋白表達(dá)升高（圖4）。

圖4 決明子蒽醌苷和Nrf2抑制劑對冠心病大鼠心肌組織凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。A， HIF-1α、BNIP3和caspase-1水平的代表性Western blot檢測；B—D，HIF-1α、BNIP3和caspase-1水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與正常對照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與AQGC組相比，cP＜0.05；n=10Fig.4 Effect of anthraquinone glycoside from cassia and Nrf2 inhibitor on the expression of apoptosis pathway-related proteins in the myocardial tissue of the rats with coronary heart disease; A, representative Western blot detection of levels of HIF-1α, BNIP3 and caspase-1; B to D, statistical analysis of levels of HIF-1α, BNIP3 and caspase-1; aP＜0.05, compared with the normal control group; bP＜0.05, compared with the model group; cP＜0.05,compared with AQGC group; n=10

討 論

冠心病常由血脂沉積、冠脈狹窄等引起的心肌缺血缺氧性損傷[10]。缺血缺氧誘導(dǎo)心肌組織壞死的同時(shí)，也會誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞浸潤并釋放促炎因子而導(dǎo)致組織應(yīng)激性損傷[11]。本研究用脂肪乳灌胃+注射維生素D3模擬血脂沉積及冠脈狹窄法復(fù)制冠心病模型后發(fā)現(xiàn)，大鼠血脂-總膽固醇升高的同時(shí)，還隨著心功能下降，心肌細(xì)胞變形、炎癥浸潤及凋亡等病理損傷現(xiàn)象，提示造模成功。決明子中的提取物蒽醌苷對血脂有調(diào)節(jié)作用[12]，決明子蒽醌苷（AQGC）還可對酒精性脂肪肝病具有一定的治療效果[13]。且宋云梅[14]發(fā)現(xiàn)AQGC對糖尿病引發(fā)的腎損傷和心肌損傷有較好的改善作用。另外，李玉晶[5]及于海榮[6]等臨床報(bào)道發(fā)現(xiàn)AQGC對脂肪肝病和高血壓等引起的肝損傷和心肌細(xì)胞損傷等有較好的改善作用。本研究給予冠心病模型大鼠一定劑量的AQGC進(jìn)行干預(yù)治療后，發(fā)現(xiàn)大鼠血脂指標(biāo)-總膽固醇降低，心功能下降，心肌細(xì)胞變形、炎癥浸潤及凋亡等病理損傷明顯緩解，證實(shí)AQGC對冠心病有潛在的治療作用。本研究對其治療作用的相關(guān)機(jī)制，進(jìn)行進(jìn)一步探究。

炎性及氧化應(yīng)激反應(yīng)，均可導(dǎo)致心肌細(xì)胞及動脈內(nèi)皮細(xì)胞釋放大量氧自由基，并導(dǎo)致清除氧自由基的酶如SOD活性降低，氧自由基蓄積后與細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸反應(yīng)而產(chǎn)生MDA，來破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，引發(fā)冠心病的進(jìn)一步發(fā)展[15,16]。易德茂等[17]發(fā)現(xiàn)冠心病患者血清SOD降低，氧自由基ROS及氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA水平明顯高于正常健康人群，并認(rèn)為提高SOD活性，可有效清除ROS及MDA水平，提高患者抗氧化應(yīng)激損傷。Zheng等[18]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟脂肪細(xì)胞分泌的新型脂肪細(xì)胞因子visfatin，可通過促進(jìn)炎癥通路-核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）活化，來促進(jìn)TNF-α、MCP-1分泌，引起ROS釋放效應(yīng)擴(kuò)大，微血管堵塞加重，最終導(dǎo)致冠心病患者缺氧惡化。本研究也在冠心病模型大鼠心肌組織中檢測到visfatin、TNF-α、MCP-1、ROS及MDA水平的升高，SOD抗氧化活性的降低，進(jìn)一步證實(shí)造模成功。

Nrf2是調(diào)控機(jī)體抗氧化應(yīng)激、抗炎反應(yīng)的關(guān)鍵通路。文獻(xiàn)研究證實(shí)，Nrf2可與ARE結(jié)合，上調(diào)抗氧化酶GST及SOD2等活性，來抑制內(nèi)源性和外源性ROS導(dǎo)致的細(xì)胞損傷；另外，Nrf2還可激活細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)程序，抑制NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3炎癥小體活化，降低細(xì)胞內(nèi)caspase-1和IL-18等的成熟分泌，來抵抗炎癥反應(yīng)[19]。近來也有研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2活性的改變，也可誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)，來上調(diào)促凋亡蛋白如BNIP3表達(dá)而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Baba等[20]研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α升高，可通過抑制Maf與Nrf2的結(jié)合，而抑制Nrf2的活性，來啟動細(xì)胞凋亡程序。郭坤等[7]發(fā)現(xiàn)，抑制HIF-1α表達(dá)，可降低促凋亡細(xì)胞因子BNIP3表達(dá)，來改善冠心病大鼠心肌組織炎癥反應(yīng)及凋亡水平。

本研究發(fā)現(xiàn)，冠心病模型大鼠心肌組織抗氧化酶GST及SOD2活性降低，Nrf2呈代償性升高，HIF-1α及BNIP3促細(xì)胞凋亡因子表達(dá)也隨之升高，用Nrf2抑制劑抑制Nrf2活性后，HIF-1α-BNIP3促凋亡活性進(jìn)一步升高，Nrf2下游抗氧化酶GST及SOD2活性進(jìn)一步降低，促炎反應(yīng)IL-18表達(dá)進(jìn)一步升高，大鼠表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的心功能下降及心肌損傷凋亡現(xiàn)象，反之給予HIF-1α抑制劑阻斷HIF-1α-BNIP3促凋亡反應(yīng)的同時(shí)，Nrf2及其下游抗氧化酶活性升高，IL-18炎性反應(yīng)減弱，大鼠心功能下降及心肌損傷凋亡現(xiàn)象得到顯著改善，提示Nrf2通路活化在冠心病心肌氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及凋亡過程中發(fā)揮保護(hù)作用，抑制Nrf2活化，可加重冠心病的發(fā)展，阻斷HIF-1α活化，可促進(jìn)Nrf2活化發(fā)揮保護(hù)作用。AQGC組大鼠心肌組織細(xì)胞中Nrf2活性被促進(jìn)，HIF-1α-BNIP3促凋亡活化被抑制，Nrf2調(diào)控的抗氧化酶活性、抗炎反應(yīng)被激活，提示AQGC改善冠心病大鼠心肌氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)損傷及凋亡作用，可能與促進(jìn)Nrf2活化有關(guān)。AQGC與Nrf2抑制劑聯(lián)合應(yīng)用后，AQGC的促進(jìn)Nrf2活化、改善冠心病大鼠心肌氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)損傷及凋亡等作用被削弱，進(jìn)一步證實(shí)AQGC可通過促進(jìn)Nrf2活化，發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激及抗凋亡作用，來改善冠心病大鼠病理癥狀。