腎缺血再灌注損傷小鼠腎內(nèi)纖維化和膽綠素還原酶陽性巨噬細(xì)胞增加

胡芝芝，裴廣暢，曾銳*，徐鋼

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腎內(nèi)科，武漢430030）

膽綠素還原酶（biliverdin reductase, BVR）是在亞鐵血紅素代謝途徑中將膽綠素轉(zhuǎn)化成膽紅素的一種酶，分為BVR-A和BVR-B兩個亞型。兩個亞型都能夠產(chǎn)生膽紅素，只有BVR-A能夠降低膽綠素轉(zhuǎn)化成抗氧化分子膽紅素[1]。BVR以二聚體形式結(jié)合在DNA上，核定位信號和核輸出信號具備一致性，以便BVR將活化信號ERK1/2進(jìn)行傳遞[2]。作為亮氨酸-拉鏈樣轉(zhuǎn)錄因子，BVR結(jié)合到Ap-1位點，可以激活HO-1啟動子轉(zhuǎn)錄，也可以抑制tlr4基因表達(dá)[3]。另外，BVR還具有絲氨酸/蘇氨酸激酶和酪氨酸激酶活性，可以激活I(lǐng)GF-1和MARK途徑[1]。在神經(jīng)元中敲除BVR可以導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平升高，降低神經(jīng)元活性，增加caspase活性和促進(jìn)凋亡[3]。我們的前期研究證實BVR能夠利用酪氨酸蛋白激酶活性，激活PI3K/Akt信號途徑，參與缺氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT過程[4]。

巨噬細(xì)胞既是免疫效應(yīng)細(xì)胞也是抗原呈遞細(xì)胞，具有連接天然免疫和獲得性免疫的作用。巨噬細(xì)胞可以分為M1亞型（經(jīng)典激活）和M2亞型（選擇激活）巨噬細(xì)胞。在不同的環(huán)境中，巨噬細(xì)胞可以分化成不同亞型，呈現(xiàn)表型的異質(zhì)性和多樣性，發(fā)揮促炎和抗炎兩種截然不同的作用。在急性腎損傷早期，巨噬細(xì)胞參與組織損傷，在隨后的慢性修復(fù)期，巨噬細(xì)胞則呈現(xiàn)組織修復(fù)和促進(jìn)纖維化的雙重作用[5-7]。在缺血再灌注損傷模型中，通過注射氯膦酸鹽脂質(zhì)體清除巨噬細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)腎巨噬細(xì)胞浸潤減少和纖維化減輕[8]。

腎小管間質(zhì)纖維化是慢性腎病發(fā)生發(fā)展過程中重要病理特征，而腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤與腎損傷密切相關(guān)[9]。在RAW264.7巨噬細(xì)胞中，膽綠素（biliverdin, BV）刺激可以抑制TLR4的表達(dá)和促炎因子的釋放，穩(wěn)定敲除BVR則導(dǎo)致TLR4和TNF-α表達(dá)升高[10]，由此提示BVR陽性巨噬細(xì)胞可能調(diào)節(jié)腎臟纖維化，參與腎纖維化病變過程。本文利用腎缺血再灌注損傷模型，檢測腎缺血再灌注損傷時腎組織中BVR的表達(dá)與巨噬細(xì)胞的關(guān)系。

材料與方法

1 動物及主要試劑

16只體重20~25 g C57BL/6雄性小鼠購于北京華阜康公司；兔抗小鼠BVR多克隆抗體購自美國Stressgen公司；兔抗小鼠α-SMA多克隆抗體、兔抗小鼠collagen I 多克隆抗體、大鼠抗小鼠F4/80多克隆抗體購自英國Abcam公司；兔抗小鼠 CD45-precp-cy5.5 抗體、兔抗小鼠 F4/80-PE 抗體、兔抗小鼠 CD11b-APC 抗體購自eBioscience公司；Alexa Fluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG、Cy3標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG和DAPI染色劑均購自碧云天公司；RT-PCR引物由美國Invitrogen公司合成，Trizol試劑購于美國Invitrogen公司；免疫組織化學(xué)試劑盒、生物素標(biāo)記二抗和DAB顯色液購于上?；蚩萍脊?；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Promega公司，PCR試劑盒購于德國Qiagen公司。

2 主要儀器

正置顯微鏡（CX23，Olympus），激光掃描共聚焦顯微鏡（FV3000，Olympus），RT-PCR儀（Roche LightCycler 480），流式細(xì)胞儀（FACSCanto II，BD）。

3 動物分組與模型建立

16只 C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組（Sham組）和腎缺血再灌注模型組（IRI組）2組，每組8只小鼠。以1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（0.2 mL/100g）模型組小鼠，背部備皮，消毒，行背部正中切口，暴露左側(cè)腎臟，分離腎包膜，夾閉左側(cè)腎蒂30 min。30 min后松開動脈夾，縫合皮膚及組織。

4 標(biāo)本留取

Sham組、IRI組小鼠常規(guī)飼養(yǎng)5 d、10 d后，經(jīng)小鼠眼內(nèi)眥靜脈取血，取手術(shù)側(cè)腎臟稱重，用生理鹽水灌洗腎臟，至腎臟發(fā)白，留取1/4腎臟固定于4%多聚甲醛，用于制備石蠟切片，留取1/4腎臟行流式細(xì)胞術(shù)，其余組織-80 ℃保存。

5 組織化學(xué)染色

模型制作5 d和10 d后處死Sham組和IRI組小鼠，取新鮮腎，去除包膜，以4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，3 μm 切片，進(jìn)行過蘇木素-伊紅（HE) 染色、Masson三色法染色和天狼星紅（Sirius Red）染色。光鏡下觀察腎小球硬化及間質(zhì)損害程度。

6 免疫組織化學(xué)染色

SABC法免疫組織化學(xué)染色：新鮮腎去除包膜后，以4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，3 μm切片，60 ℃烤片30 min，脫蠟、水化，PBS漂洗，0.3%過氧化氫-甲醇室溫孵育15 min，PBS洗 3 次。將切片浸泡于含枸櫞酸緩沖液的抗原修復(fù)盒中，微波爐高火5 min，中火15 min 后自然晾干，PBS 洗3次。以含10%胎牛血清的PBS 37 ℃封閉30 min。以兔抗鼠α-SMA（1∶ 200）、 兔抗鼠 PDGFR-β（1∶200）、兔抗鼠collagen IV（1∶200）4 ℃過夜，再37 ℃孵育30 min，PBS洗3次。加入生物素標(biāo)記的二抗（1∶200）室溫 1h ，用 PBS 洗5min；以辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液 37℃孵育 30 min，PBS洗3次，DAB顯色，蒸餾水洗3次。蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，照相。

免疫熒光雙重染色：脫蠟、入水后的切片以含10%胎牛血清的PBS 37 ℃封閉30 min，分別以兔抗小鼠BVR抗體（1∶300稀釋于封閉液中）、大鼠抗小鼠F4/80多克隆抗體（1∶50稀釋于封閉液中）4℃過夜，再37℃孵育30 min，PBS洗3次。分別以Alexa Fluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體、Cy3標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG抗體37℃孵育30 min，PBS洗3次；滴加DAPI避光孵育5 min，進(jìn)行核復(fù)染，用PBS浸洗多余的DAPI，熒光保護(hù)劑封片，共聚焦熒光顯微鏡下觀察、拍照，Alexa Fluor488綠色熒光指示F4/80定位，Cy3紅色熒光為BVR定位，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核。Alexa Fluor488 的吸收峰是495 nm，發(fā)射峰是519 nm，Cy3的吸收峰是550 nm，發(fā)射峰是570 nm。

7 定量 RT-PCR

按Trizol試劑說明書提取腎組織總RNA，用分光光度計檢測RNA純度與濃度，然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)試劑說明書（德國Qiagen）及預(yù)實驗確定的反應(yīng)時間與溫度進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增?？偡磻?yīng)體系25 μL，PCR反應(yīng)條件：多聚酶活化 95 ℃ 5 min，95 ℃10 s，60 ℃ 20 s，40個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，建立熔解曲線，以檢驗擴(kuò)增的特異性。循環(huán)閾值用內(nèi)源性GAPDH來校正。目的基因mRNA的相對表達(dá)量=2△△Ct。Ct是熒光達(dá)到熒光閾值的循環(huán)數(shù)；△△Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組- (Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequences

8 流式細(xì)胞術(shù)

手術(shù)后5 d、10 d分別取小鼠的眼部內(nèi)眥靜脈血液100 μL，取小鼠手術(shù)側(cè)腎臟，剪碎；加入膠原酶，37 ℃ 消化 60 min； 將懸液依次通過 70 μm 和40 μm 尼龍篩濾過；2000 r/min 離心5 min，去上清；剪開股骨和脛骨的骨骺，暴露髓腔，5 mL注射器吸取PBS，沖洗骨髓腔，直至骨骼顏色變?yōu)樯n白；收集懸液，充分吹打混勻以吹散細(xì)胞團(tuán)塊，200目過濾，1000 r/min×10 min，棄上清；用無菌紅細(xì)胞裂解液3 mL裂解3 min，PBS洗2遍，細(xì)胞離心棄上清，100 μL PBS重懸細(xì)胞。BVR流式細(xì)胞學(xué)需用間接熒光法標(biāo)記，先用兔抗小鼠的BVR抗體37 ℃孵育1 h，PBS洗2遍離心去上清，100 μL PBS重懸，然后加入兔抗小鼠的FITC二抗孵育30 min；CD45， F4/8，CD11b流式細(xì)胞學(xué)使用直接標(biāo)記法，直接在PBS重懸細(xì)胞中加入抗小鼠CD45-precp-cy5.5抗體、抗小鼠F4/80-PE抗體、抗小鼠CD11b-APC孵育30 min，上機(jī)檢測。細(xì)胞先以FSC和SSC的散點圖圈定細(xì)胞大小，再從CD45的散點圖中把F4/80和CD11b細(xì)胞圈出，隨后繼續(xù)在F4/80和CD11b的散點圖中把BVR陽性的細(xì)胞團(tuán)圈出，確定CD45+F4/80+CD11b+BVR+細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比。

9 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計數(shù)資料數(shù)據(jù)以百分?jǐn)?shù)表示，采用卡方檢驗；計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 缺血再灌注損傷腎組織纖維化明顯

HE染色結(jié)果顯示，與Sham組相比，IRI組腎組織損傷明顯，腎小球硬化明顯，系膜細(xì)胞增生，腎小管管腔擴(kuò)張，小管上皮細(xì)胞腫脹或發(fā)生空泡變性、細(xì)胞脫落、基膜裸露；Masson染色顯示IRI組腎間質(zhì)膠原染色范圍明顯增大；天狼星紅染色顯示，IRI組顯示腎間質(zhì)膠原明顯增加（圖1）。

圖1 腎缺血再灌注小鼠腎組織病理學(xué)改變的HE、Masson和天狼星紅染色檢測。比例尺，100 μmFig.1 HE, Masson and Sirius Red staining examination of pathological changes in the mouse kidneys with renal ischemia/reperfusion.Scale bar, 100 μm

2 缺血再灌注損傷腎組織內(nèi)纖維化蛋白免疫反應(yīng)性增強(qiáng)

免疫組織化學(xué)染色顯示，α-SMA主要表達(dá)于腎小管間質(zhì)中，腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)中也有少許表達(dá)；PDGFR-β和collagen IV主要表達(dá)于腎小管間質(zhì)中。與Sham組相比，缺血再灌注小鼠腎組織中α-SMA、PDGFR-β和collagen IV等纖維化蛋白免疫反應(yīng)性明顯增強(qiáng)（圖2）。

圖2 腎缺血再灌注小鼠腎臟組織α-SMA、PDGFR-β和collagen IV表達(dá)變化的免疫組織化學(xué)檢測。比例尺，100 μmFig.2 Immunohistochemical examination for expression changes of α-SMA, PDGFR-β and collagen IV in the mouse kidneys with renal ischemia/reperfusion.Scale bar, 100 μm

3 缺血再灌注損傷小鼠腎組織內(nèi)纖維化蛋白和腎損傷蛋白mRNA表達(dá)增加

熒光定量RT-PCR檢測顯示，在缺血再灌注模型中，α-SMA、fibronectin、collagen I和KIM-1的mRNA表達(dá)明顯增加，其中，α-SMA mRNA水平是對照組的8倍，fibronectin mRNA水平是對照組的40倍，collagen I mRNA水平是對照組的43倍，反映腎損傷的蛋白KIM-1 的mRNA水平是對照組的2000倍（圖3）。

圖3 腎缺血再灌注小鼠腎組織α-SMA、Fibronectin（FN）、collagen I、KIM-1 mRNA表達(dá)變化的定量RT-PCR檢測。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；n=8Fig.3 qRT-PCR analysis for the mRNA expression of α-SMA, fibronectin, collagen I and KIM-1 in the mouse kidneys with renal ischemia/reperfusion.*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；n=8

4 腎缺血再灌注損傷小鼠BVR陽性的巨噬細(xì)胞表達(dá)增加

手術(shù)后第5 d和第10 d取小鼠內(nèi)眥靜脈血、小鼠手術(shù)側(cè)腎臟、小鼠股骨和脛骨骨髓進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，Sham組血液中BVR陽性巨噬細(xì)胞（CD45+F4/80+CD11b+BVR+）占 4.79%±0.65%，IRI手術(shù)組術(shù)后5 d血液中BVR陽性巨噬細(xì)胞（CD45+F4/80+CD11b+BVR+） 占 6.73%±0.55%，IRI手術(shù)組術(shù)后10 d血液中BVR陽性巨噬細(xì)胞(CD45+F4/80+CD11b+BVR+)占 11.92%±1.05%，即缺血再灌注小鼠血液中BVR陽性巨噬細(xì)胞(CD45+F4/80+CD11b+BVR+)表達(dá)明顯增加。Sham組腎臟組織中BVR陽性巨噬細(xì)胞(CD45+F4/80+CD-11b+BVR+)占1.05%±0.1%，IRI手術(shù)組術(shù)后5 d腎臟組織中BVR陽性巨噬細(xì)胞(CD45+F4/80+CD11b+BVR+)占1.17%±0.21%；IRI手術(shù)組術(shù)后10 d腎臟組織中BVR陽性巨噬細(xì)胞(CD45+F4/80+CD11b+B-VR+)占4.81%±0.55%，即缺血再灌注小鼠腎臟中BVR陽性巨噬細(xì)胞(CD45+F4/80+CD11b+BVR+)表達(dá)明顯增加；Sham組骨髓中BVR陽性巨噬細(xì)胞 (CD45+F4/80+CD11b+BVR+)占 29.2%±0.78%，IRI手術(shù)組術(shù)后5 d骨髓中BVR陽性巨噬細(xì)胞(CD45+F4/80+CD11b+BVR+)占 33.76%±1.77%，IRI手術(shù)組術(shù)后10 d骨髓中BVR陽性巨噬細(xì)胞(CD45+F4/80+CD11b+BVR+)占 21.14%±0.32%，即缺血再灌注小鼠骨髓中BVR陽性巨噬細(xì)胞(CD45+F4/80+CD11b+BVR+)表達(dá)明顯增加。

5 缺血再灌注損傷腎組織中BVR陽性巨噬細(xì)胞增加

免疫熒光雙標(biāo)監(jiān)測顯示：Sham組腎組織中BVR+F4/80+細(xì)胞（BVR陽性巨噬細(xì)胞）極少，而缺血再灌注損傷5 d小鼠腎組織中BVR+F4/80+細(xì)胞明顯增加（圖5）。

圖5 免疫雙染熒光檢測腎缺血再灌注損傷小鼠腎組織BVR陽性巨噬細(xì)胞表達(dá)。IRI，缺血再灌注損傷5 d小鼠腎組織；綠色熒光，F(xiàn)4/80陽性免疫染色；紅色熒光示BVR陽性免疫染色；箭頭，BVR+F4/80+雙標(biāo)細(xì)胞。比例尺，100 μmFig.5 Double immunofluorescence staining for detection of expression of BVR positive macrophages in the kidney tissues of the mice with renal ischemia/reperfusion injury.IRI，renal tissue of mice with ischemia reperfusion injury for 5 days; green, F4/80 positive immunostaining; red, BVR positive immuniostaining; arrow head, BVR+F4/80+ double staining cell.Scale bar, 100 μm

討 論

缺血再灌注損傷是指組織或者器官在缺血后重獲血流灌注或氧供后造成的損傷[11]。腎臟是血液供應(yīng)非常豐富的器官，對缺血再灌注損傷尤其敏感，是影響急性腎功能損傷恢復(fù)程度的重要因素。因此如何保護(hù)腎臟免受缺血再灌注損傷具有重要的臨床意義。近年的研究表明，腎臟間質(zhì)病變較腎小球病變與慢性腎功能衰竭進(jìn)展關(guān)系更為密切。目前發(fā)現(xiàn)腎臟纖維化的過程主要包括：①單核/巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤；②致纖維化的細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)；③由于基質(zhì)蛋白合成增加和基質(zhì)降解受到抑制的綜合作用導(dǎo)致纖維化形成。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，腎小管間質(zhì)纖維化程度決定著慢性腎臟病患者的預(yù)后[12]。膽綠素還原酶（BVR）是膽紅素抗氧化系統(tǒng)的重要組分，對氧化應(yīng)激介導(dǎo)的疾病如自身免疫性腦脊髓炎和腦缺血，BVR能夠上調(diào)，對抗氧自由基的損害[13-15]。

圖4 腎缺血再灌注損傷小鼠腎、血液、骨髓中CD45+F4/80+CD11b+BVR+細(xì)胞變化的流式細(xì)胞術(shù)分析。*P＜0.05，**P＜0.01；n=4Fig.4 Flow cytometry analysis for the change of CD45+F4/80+CD11b+BVR+ cells in the kidney, blood, and bone marrow of the mice with renal ischemia/reperfusion.*P＜0.05, **P＜0.01; n=4

巨噬細(xì)胞在腎臟發(fā)育，各種急慢性腎損傷和修復(fù)以及腎移植排斥反應(yīng)中都具有重要作用[16]。隨著腎臟纖維化的加重，腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤增加[17]。我們以前的研究表明，BVR主要表達(dá)在腎小管細(xì)胞胞質(zhì)中[18]，隨著腎臟纖維化加重，腎小管中BVR表達(dá)增加[19,20]；BVR通過GM-CSF，M-CSF和LPS刺激巨噬細(xì)胞參與調(diào)節(jié)IL-10的分泌[21]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，在腎缺血再灌注模型中，腎組織內(nèi)α-SMA、fibronectin、collagen I、PDGFR-β、collagen IV、BVR和KIM-1的表達(dá)明顯升高，說明急性腎損傷時，腎臟纖維化和損傷都明顯加重，BVR參與腎臟損傷的過程。同時，在小鼠血液、骨髓和腎臟組織中BVR免疫反應(yīng)陽性巨噬細(xì)胞明顯增多，說明在急性腎損傷時，血液、骨髓和腎臟組織中BVR免疫反應(yīng)陽性巨噬細(xì)胞數(shù)量隨著腎臟纖維化的加重而明顯增加。因此，BVR陽性巨噬細(xì)胞廣泛存在于腎、血液、骨髓等組織中，并積極參與腎臟纖維化的過程。本研究為進(jìn)一步研究腎臟纖維化過程中巨噬細(xì)胞和BVR的作用及探索腎纖維化的治療方法提供了重要思路。