中國(guó)南瓜×印度南瓜種間雜交自交系及組合的遺傳多樣性分析

宋 慧，古斌權(quán)，張香琴

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 蔬菜研究所，寧波市瓜菜育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315040)

利用表型和分子標(biāo)記技術(shù)分析生物遺傳多樣性，是作物育種的重要環(huán)節(jié)[1-2]，是資源鑒定和品種親緣關(guān)系評(píng)價(jià)的重要手段[3-4]。方法成熟，報(bào)道較多[5-9]，主要開(kāi)展自然群體關(guān)聯(lián)分析[10]、作物品種指紋圖譜構(gòu)建[11]和地方種質(zhì)資源多樣性分析[12-13]等研究。但這類(lèi)報(bào)道多停留在為育種實(shí)踐提供理論依據(jù)的層面，對(duì)進(jìn)一步通過(guò)引種、種間雜交或誘變等育種手段，拓寬作物遺傳多樣性的研究較少；進(jìn)而利用表型和分子標(biāo)記技術(shù)，比較和分析育種后代與現(xiàn)有資源的遺傳多樣性的報(bào)道就更少。

目前，市場(chǎng)暢銷(xiāo)的食用南瓜類(lèi)型主要有中國(guó)南瓜的蜜本南瓜、香芋南瓜類(lèi)型，印度南瓜的貝貝南瓜、板栗南瓜、貴族南瓜類(lèi)型，以及美洲南瓜的長(zhǎng)條筍瓜、圓形筍瓜和小菊瓜等。近年來(lái)，相同類(lèi)型的南瓜品種，商品名稱(chēng)更換很快，但是同質(zhì)性很強(qiáng)[14]，推陳出新的后勁不足。有學(xué)者從南瓜商品種鑒定分類(lèi)的角度，對(duì)各地搜集的商品種進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中國(guó)南瓜、印度南瓜和美洲南瓜3個(gè)種之間的差異大，種內(nèi)的遺傳相似度高[15]，相似系數(shù)為0.830～1.000[16-17]。地域來(lái)源相同的商品種通常會(huì)聚為一類(lèi)[18-19]，但是張?zhí)烀鞯萚20]研究卻發(fā)現(xiàn)，由于當(dāng)今種子市場(chǎng)繁榮，各地區(qū)相互引種育種，導(dǎo)致同質(zhì)遺傳型品種再組合，品種(系)間遺傳多態(tài)性降低，地域差異趨同[14，16]。周琳等[21]曾利用SSR分子標(biāo)記對(duì)路易斯安那鳶尾品種、雜交后代和誘變材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，誘變材料與親本遺傳差異大。種間雜交也是拓寬南瓜遺傳多樣性的有效手段[22-25]。為此本研究院前期通過(guò)中國(guó)南瓜(Cucurbitamoschata)×印度南瓜(Cucurbitamaxima)種間遠(yuǎn)緣雜交和胚胎拯救技術(shù)，獲得種間雜種[26]，并經(jīng)過(guò)回交和多代自交，獲得耐熱的自交系[27]?，F(xiàn)通過(guò)與骨干親本配制雜交組合，選育南瓜新品種。

為了進(jìn)一步揭示種間雜種與現(xiàn)有南瓜商品種和核心親本具有明顯差別，本研究對(duì)目前市售的食用南瓜商品種、本研究院長(zhǎng)期積累的骨干親本、以及中印南瓜種間雜交自交系及其新配組合，進(jìn)行遺傳多樣性分析。系統(tǒng)評(píng)價(jià)現(xiàn)有食用南瓜品種和育種材料的親緣關(guān)系，明確中印南瓜種間雜種自交系及其新配組合的聚類(lèi)地位，在表型和分子層面分析南瓜種間雜種拓寬南瓜遺傳背景的可能性。此外，有關(guān)南瓜植物學(xué)性狀調(diào)查的報(bào)道較多，從種子形態(tài)、果實(shí)形態(tài)以及植株長(zhǎng)勢(shì)等多方面，調(diào)查指標(biāo)多達(dá)70余項(xiàng)[28]。繁瑣的調(diào)查條目，不利于育種材料的高效調(diào)查與分析。為此，本研究擬利用主成分分析方法，解析30個(gè)表型性狀的主成分構(gòu)成，簡(jiǎn)化食用南瓜評(píng)價(jià)表型指標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

供試材料53份，包括32份印度南瓜、5份中國(guó)南瓜和1份美洲南瓜，以及15份本研究院前期獲得的中印南瓜遠(yuǎn)緣雜交自交系及自配雜交組合(表1)。其中商品種10份，農(nóng)家種3份，骨干親本25份，自配組合15份。商品種涵蓋市場(chǎng)暢銷(xiāo)的各種食用南瓜，涉及中國(guó)南瓜的蜜本南瓜香芋南瓜類(lèi)型，印度南瓜的貝貝南瓜、板栗南瓜、貴族南瓜類(lèi)型，以及美洲南瓜的小菊瓜。試驗(yàn)在寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)基地和瓜菜育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。每份材料定植15株，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3次，常規(guī)栽培管理。

表1 供試南瓜名稱(chēng)、類(lèi)型和部分表型性狀Tab.1 The name，type and partial morphological traits of pumpkins tested

表1(續(xù))

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物學(xué)性狀調(diào)查 參照蔡寶炎[28]和褚盼盼[29]制定的南瓜植物學(xué)性狀調(diào)查表，結(jié)合本試驗(yàn)制定南瓜形態(tài)學(xué)性狀調(diào)查內(nèi)容和賦值標(biāo)準(zhǔn)(表2)。分別在植株伸蔓期、開(kāi)花期、結(jié)果期和采收期，調(diào)查植株和果實(shí)的30個(gè)表型性狀。需要特別說(shuō)明調(diào)查時(shí)期和記載標(biāo)準(zhǔn)的表型性狀見(jiàn)表3，其中，果實(shí)口感評(píng)價(jià)，按照尹玲等[30]報(bào)道的南瓜感官評(píng)價(jià)方法進(jìn)行。

表3 部分南瓜形態(tài)學(xué)性狀調(diào)查時(shí)期和記載標(biāo)準(zhǔn)Tab.3 Investigation time and method of partial pumpkins morphological traits

1.2.2 遺傳多樣性分析 利用孔凡洲等[31]通過(guò)Excel建立的生物多樣性指數(shù)計(jì)算軟件，計(jì)算30個(gè)統(tǒng)計(jì)性狀的Berger-Parker指數(shù)(d)、Margalef指數(shù)(dMa)、和Shannon指數(shù)(He′)。其中Berger-Parker指數(shù)用來(lái)表示遺傳多樣性的優(yōu)勢(shì)度，Margalef 指數(shù)用來(lái)表示豐富度，Shannon 指數(shù)用來(lái)測(cè)定群落多樣性的高低。3個(gè)指數(shù)數(shù)值越大，表明群體多樣性越豐富。

1.2.3 表型聚類(lèi)和主成分分析 利用SPSS 19.0軟件[23]，采用聚類(lèi)功能，各樣本間的距離用卡方距離進(jìn)行度量，對(duì)30組表型數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)。利用SPSS 19.0軟件，對(duì)53份南瓜材料的30個(gè)統(tǒng)計(jì)性狀進(jìn)行主成分分析，根據(jù)累計(jì)貢獻(xiàn)率≥85%原則，篩選主成分因子。在每個(gè)主成分因子中，30個(gè)統(tǒng)計(jì)性狀的特征向量排序不同，每個(gè)因子中特征性向量絕對(duì)值較大的1～2個(gè)性狀，是該主成分因子代表的主要特征。利用這些主成分因子對(duì)53份南瓜材料進(jìn)行二次表型聚類(lèi)分析。如果二次表型聚類(lèi)與分子聚類(lèi)具有較高符合度，則這些主成分因子可作為簡(jiǎn)化表型性狀統(tǒng)計(jì)的指標(biāo)。

1.2.4 SSR分子標(biāo)記擴(kuò)增與聚類(lèi)圖繪制 在植株伸蔓期，取莖尖幼葉，液氮儲(chǔ)運(yùn)。利用EasyPure?Plant Genomic DNA Kit試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取樣品DNA。利用K5600超微量分光光度計(jì)(北京凱奧科技發(fā)展公司)和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度。參照Gong等[32]報(bào)道，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成南瓜SSR引物。選擇在前期南瓜SSR標(biāo)記擴(kuò)增試驗(yàn)中，帶型清晰、多態(tài)性穩(wěn)定的引物23對(duì)，進(jìn)行標(biāo)記擴(kuò)增。

參照宋慧等[33]的報(bào)道，采用康為世紀(jì)生物科技有限公司2×Taq MasterMix(Day)PCR混合液，按照說(shuō)明書(shū)調(diào)整反應(yīng)體系為10 μL：5 μL 2×Taq MasterMix(Day)、0.4 μL 引物(10 mmol/L)、1 μL DNA(10 μg/μL)，加ddH2O至10 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min。PCR產(chǎn)物使用5% Yeasen高分辨率瓊脂糖凝膠(上海翊圣生物科技有限公司)電泳。上樣量為1.1 μL，電壓90 V，電流100 mA，時(shí)間3 h。凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增產(chǎn)物。

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，統(tǒng)計(jì)條帶清晰、樣品間有多態(tài)性的位點(diǎn)，相同遷移位點(diǎn)擴(kuò)增出條帶的記為“1”，無(wú)條帶記為“0”，建立0和1矩陣。計(jì)算標(biāo)記多態(tài)信息量，多態(tài)性比例=(多態(tài)性位點(diǎn)/擴(kuò)增位點(diǎn))×100%。利用NTSYS-pc2.10e軟件處理數(shù)據(jù)，繪制聚類(lèi)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型結(jié)果

2.1.1 南瓜形態(tài)學(xué)性狀的遺傳多樣性 圖1展示了3種南瓜測(cè)試組合30個(gè)形態(tài)學(xué)性狀的3個(gè)遺傳多樣性指數(shù)，結(jié)果顯示，3種南瓜組合分別為10個(gè)南瓜商品種、10個(gè)商品種+28份骨干親本以及10個(gè)商品種+28份骨干親本+15份中印南瓜雜交種后代。結(jié)果顯示，隨著育種材料的加入，供試南瓜的3個(gè)遺傳多樣性指數(shù)均增加。He′的增幅較小(均值2.09～3.72)，d和dMa的增幅明顯(均值6.84～31.42和2.77～9.92)。結(jié)果表明，供試10份南瓜商品種之間的表型已經(jīng)存在不同之處，商品種的選擇具有代表性；骨干親本和中印南瓜雜交種后代的加入，在株型、生長(zhǎng)勢(shì)和分枝分蘗等生長(zhǎng)習(xí)性，以及果實(shí)皮色、果型等多方面使得商品種群體多態(tài)性豐富度提高。由于增加的材料均以選育食用南瓜為目標(biāo)，因此，在果實(shí)口感、果肉厚度等方面的性狀與商品種育種目標(biāo)一致，測(cè)試材料在這幾方面的多態(tài)性豐富度變化不大。

圖1 30個(gè)形態(tài)學(xué)性狀的3個(gè)遺傳多樣性指數(shù)在3種供試南瓜組合中的平均數(shù)的變化Fig.1 The changes of three genetic diversity index average value in three tested pumpkin combinations

2.1.2 53份南瓜材料表型聚類(lèi)分析 采用SPSS軟件，根據(jù)30個(gè)形態(tài)學(xué)性狀在53份南瓜材料間的不同表現(xiàn)進(jìn)行聚類(lèi)，結(jié)果見(jiàn)圖2。在距離22的位置，將供試材料聚為三大類(lèi)群。第一類(lèi)包含20份南瓜材料，主要是中印南瓜遠(yuǎn)緣雜交的親本及后代組合；第二類(lèi)有30份南瓜材料，包含印度南瓜商品種及所有印度南瓜骨干親本；第三類(lèi)包含3份中國(guó)南瓜(10、20、1)。這3個(gè)類(lèi)群中，中印南瓜遠(yuǎn)緣雜交材料與印度南瓜遺傳距離相近。中印南瓜遠(yuǎn)緣雜交材料拉近了中國(guó)南瓜和印度南瓜的遺傳距離，有望成為中印南瓜種間雜交的育種橋。

在遺傳距離20的位置，可以將第二類(lèi)群細(xì)分為2個(gè)亞群。一個(gè)亞群是以2-錦栗為代表的印度南瓜

圖2 53份南瓜材料形態(tài)學(xué)性狀聚類(lèi)Fig.2 Dendrogram of 53 pumpkins derived from clustering analysis based on phenotypic traits

親本；另一個(gè)亞群是以3-翠栗6號(hào)、5-貝栗4號(hào)、4-翠栗318、8-綠亨銀栗和9-新紅板栗等為代表的印度南瓜親本。由此可見(jiàn)，供試骨干親本與市售品種遺傳距離較接近，對(duì)于改良同一類(lèi)型南瓜品種有一定作用，但是培育突破性品種，難度較大。

2.2 分子聚類(lèi)結(jié)果

2.2.1 差異引物的多態(tài)性分析 試驗(yàn)共使用23對(duì)SSR標(biāo)記，擴(kuò)增61個(gè)位點(diǎn)，平均每個(gè)引物擴(kuò)增2.7個(gè)條帶。篩選到20個(gè)SSR標(biāo)記，在53份南瓜材料中擴(kuò)增出55個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性比例為90%(圖3)。

2.2.2 53份南瓜材料分子聚類(lèi)分析 NTSYS軟件通過(guò)計(jì)算53份材料間的遺傳相似系數(shù)繪制聚類(lèi)圖(圖4)。材料間遺傳相似系數(shù)在0.520～1.000，以0.680為閾值，可以將供試材料分作3個(gè)類(lèi)群，與南瓜傳統(tǒng)分類(lèi)的3個(gè)種對(duì)應(yīng)，分別為中國(guó)南瓜(1、10、17、20、21、47)、美洲南瓜(7)和印度南瓜(剩余材料)。這3個(gè)種間，中國(guó)南瓜與美洲南瓜親緣關(guān)系最近，印度南瓜與中國(guó)南瓜和美洲南瓜親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)。

M.Marker(Marker L 50～500 bp)。

在閾值為0.840處，中國(guó)南瓜類(lèi)群可以細(xì)分為3個(gè)亞群(圖4)。第1個(gè)亞群包括2個(gè)供試中國(guó)南瓜商品種，1-金鉤和10-香芋南瓜，與骨干親本21-PG10，三者相似系數(shù)為0.958～0.982，親緣關(guān)系近。第2個(gè)亞群包含親本20-GSH和47-MO，其中47-MO是中印南瓜遠(yuǎn)緣雜交種的母本，第2個(gè)亞群與第1個(gè)亞群的相似系數(shù)為0.88，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。第3個(gè)亞群是17-B5×PG10，這是中印南瓜遠(yuǎn)緣雜種自交系B5與中國(guó)南瓜親本PG10配置的雜交組合。從聚類(lèi)結(jié)果來(lái)看，17-B5×PG10與47-MO相近，與21-PG10較遠(yuǎn)，但是17-B5×PG10未與MO或者PG10聚在一起，表明利用中印南瓜遠(yuǎn)緣雜交后代與中國(guó)南瓜雜交，會(huì)在遺傳組成上創(chuàng)造較大變異，產(chǎn)生與現(xiàn)有中國(guó)南瓜材料有差別的新組合。

在閾值為0.840處，印度瓜類(lèi)群被細(xì)分為2個(gè)亞群(圖4)，第一亞群包含31份南瓜材料，主要是印度南瓜商品種和印度南瓜骨干親本；第二亞群包含15份材料，主要是中印南瓜遠(yuǎn)緣雜交自交系及其父本印度南瓜MA以及自交系自配雜交組合。2個(gè)亞群在相似系數(shù)0.890的位置被明顯分開(kāi)。在第一亞群中，供試的印度南瓜商品種，2-錦栗和9-新紅板栗、3-翠栗6號(hào)和4-翠栗318，兩兩差異不大；6-小甘龍、5-貝栗4號(hào)和8-綠亨銀栗，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。印度南瓜骨干親本23、35、39和41為姊妹系，相似度太高，沒(méi)有區(qū)分開(kāi)，它們與2-錦栗和9-新紅板栗相似。14、32和26與小甘龍近緣；22、27、33、34、38、40、43、36、11和24與5-貝栗4號(hào)相似；42、37和45與8-綠亨銀栗相似。對(duì)于與市售品種相似的親本，應(yīng)盡量選擇不同類(lèi)型、遺傳相似系數(shù)大的親本相互配組，最大程度地利用雜種優(yōu)勢(shì)，改良現(xiàn)有品種。在第二亞群中，中印南瓜遠(yuǎn)緣雜交自交系29-B5和28-B3與父本印度南瓜MA聚在一起；自交系30-B7和31-B9聚在另外一個(gè)亞群中，凡與B7雜交的組合，都被聚在這里。

圖4 53份南瓜材料SSR分子標(biāo)記聚類(lèi)Fig.4 Dendrogram of 53 pumpkins derived from clustering analysis based on SSR molecular markers

2.3 分子聚類(lèi)與表型聚類(lèi)的結(jié)果比較

53份南瓜材料的分子聚類(lèi)結(jié)果和表型聚類(lèi)結(jié)果有相同之處。首先，2種聚類(lèi)方法都將中印南瓜遠(yuǎn)緣雜交后代及組合聚為一類(lèi)，將印度南瓜商品種及印度南瓜骨干親本聚為一類(lèi)，中國(guó)南瓜類(lèi)型與這兩類(lèi)被顯著地區(qū)分開(kāi)。根據(jù)這個(gè)聚類(lèi)結(jié)果，結(jié)合30個(gè)形態(tài)學(xué)性狀分析發(fā)現(xiàn)，中國(guó)南瓜類(lèi)群表現(xiàn)出果型特異性，如長(zhǎng)條蜜本、長(zhǎng)條香芋等；中印南瓜遠(yuǎn)緣雜交后代及組合類(lèi)群表現(xiàn)為果實(shí)皮色特異性，如粉彩綠、橘黃色等；印度南瓜商品種和骨干親本表現(xiàn)為果實(shí)大小和果皮顏色的特異性。表明三者之間無(wú)論在分子層面還是表型層面都具有顯著差異。通過(guò)南瓜屬種間雜交，增加了現(xiàn)有南瓜品種和育種材料的遺傳多樣性。其次，2種聚類(lèi)方法都將供試印度南瓜骨干親本與印度南瓜商品種進(jìn)行了比對(duì)歸類(lèi)。比如，3-翠栗6號(hào)、4-翠栗318和5-貝栗4號(hào)，在表型聚類(lèi)和分子聚類(lèi)中都比較相近。這些結(jié)果都表明，供試印度南瓜商品種和印度南瓜骨干親本相似度較高，同質(zhì)化嚴(yán)重，對(duì)于培育特色品種缺乏異質(zhì)基因。此外，對(duì)于中印南瓜遠(yuǎn)緣雜交后代及組合的聚類(lèi)，2種聚類(lèi)方法得到結(jié)果非常一致，即B7和B9以及與B7雜交的組合都被聚在一起，B3和B5及其雜交組合被聚為一類(lèi)。B3、B5、B7和B9是中印南瓜雜交種不同株系的自交系，B3和B5相近，B7和B9相近，在育種實(shí)踐中，2種類(lèi)型2個(gè)株系擇其一使用即可。同時(shí)，分子聚類(lèi)與表型聚類(lèi)的結(jié)果也存在不同之處。首先表型聚類(lèi)不能把美洲南瓜7-皇貝貝和中國(guó)南瓜47-MO與印度南瓜區(qū)分開(kāi)；其次表型聚類(lèi)和分子聚類(lèi)對(duì)骨干親本與南瓜商品種的歸類(lèi)也不完全相同。

2.4 表型性狀主成分分析

根據(jù)53份南瓜材料30個(gè)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，前6個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為88.17%，30個(gè)復(fù)雜的表型性狀簡(jiǎn)化為6個(gè)主要因子(表4)。第一主成分特征值為15.98，貢獻(xiàn)率為36.09%，其特征向量凝聚的生物學(xué)信息主要是子房和老果皮色。第二主成分特征值為9.58，貢獻(xiàn)率為18.56%，其性狀特征值較大的性狀為子房和老果的條斑網(wǎng)格。第三主成分特征值為5.22，貢獻(xiàn)率為12.42%，果型指數(shù)的特征值較大。第四主成分特征值為3.33，貢獻(xiàn)率為8.05%，老果皮色和條斑網(wǎng)格是該主成分的特征，綜合了第一和第二主成分的老果表皮的生物學(xué)信息。第五主成分特征值為2.54，貢獻(xiàn)率為7.73%，果實(shí)口感評(píng)價(jià)的特征值較大。第六主成分特征值為1.29，貢獻(xiàn)率為5.32%，其性狀特征值較大的性狀為分枝和萌蘗習(xí)性。由此可見(jiàn)，本研究涉及的30個(gè)表型性狀中，幼果和成熟果實(shí)的皮色、果實(shí)表面的條斑網(wǎng)格、果型指數(shù)、口感和植株分枝萌蘗等性狀是區(qū)別53份材料的最主要的特征。

表4 53份南瓜材料30個(gè)表型數(shù)據(jù)的主成分分析結(jié)果Tab.4 The results of principal component analysis derived from 30 morphological traits of 53 pumpkins

2.5 利用主要因子對(duì)53份南瓜材料進(jìn)行二次聚類(lèi)

利用主要因子對(duì)53份南瓜材料進(jìn)行二次聚類(lèi)的結(jié)果見(jiàn)圖5。在距離15.5的位置，供試材料被聚為8大類(lèi)群。其中第Ⅰ類(lèi)、第Ⅱ類(lèi)和第Ⅵ類(lèi)包含所有的中印南瓜遠(yuǎn)緣雜交后代(16份)，B7和B9被單獨(dú)聚在第Ⅱ類(lèi)。第Ⅲ類(lèi)、第Ⅳ類(lèi)和第Ⅴ類(lèi)包含所有的印度南瓜骨干親本及商品種。5份中國(guó)南瓜(1、10、20、21、47)和1份老果皮色為草綠色、肉質(zhì)水質(zhì)絲滑的印度南瓜FG1-1，被聚類(lèi)到第Ⅶ類(lèi)。17-B5×PG10被單獨(dú)聚在第Ⅷ類(lèi)。

二次聚類(lèi)的結(jié)果與第一次利用30個(gè)表型性狀進(jìn)行聚類(lèi)的結(jié)果相比更加準(zhǔn)確，與分子聚類(lèi)結(jié)果符合度更高。首先，第一次表型聚類(lèi)的第Ⅱ類(lèi)“印度南瓜骨干親本”中，包含中國(guó)南瓜47-MO，二次聚類(lèi)將它分離出來(lái)，與中國(guó)南瓜聚在一起，更符合分子聚類(lèi)結(jié)果(圖4)。其次，兩次聚類(lèi)結(jié)果中16份中印南瓜遠(yuǎn)緣雜交后代，分布基本相同，但是二次聚類(lèi)將B7和B9單獨(dú)聚為第Ⅱ類(lèi)，將B5×PG10單獨(dú)聚為第Ⅷ類(lèi)，與分子聚類(lèi)結(jié)果更吻合。此外，二次聚類(lèi)將印度南瓜骨干親本及商品種分為第Ⅲ類(lèi)、第Ⅳ類(lèi)和第Ⅴ類(lèi)，這三類(lèi)與第一次表型聚類(lèi)的第Ⅱ類(lèi)的2個(gè)亞類(lèi)分布不同。與分子聚類(lèi)結(jié)果更符合的是二次聚類(lèi)結(jié)果。主要表現(xiàn)在分子聚類(lèi)將2、9、23、35、39聚為一類(lèi)，這一類(lèi)與其他印度南瓜材料遺傳距離較遠(yuǎn)；這個(gè)結(jié)果與二次聚類(lèi)將37、38、24、35、42、25、27、9、23、36、39、2、14聚為第Ⅳ類(lèi)，與其他材料(第Ⅲ和Ⅴ類(lèi))分開(kāi)的結(jié)果吻合。而第一次表型聚類(lèi)結(jié)果中2、9、23、35、39被分散到第Ⅱ類(lèi)的2個(gè)亞群，區(qū)分不明顯(圖2)。因此，利用主要因子對(duì)53份南瓜材料進(jìn)行二次聚類(lèi)，獲得了與分子聚類(lèi)具有較高符合度的結(jié)果，這些主成分因子可作為簡(jiǎn)化表型性狀統(tǒng)計(jì)的指標(biāo)。

圖5 基于6個(gè)主成分因子的53份南瓜材料形態(tài)學(xué)性狀聚類(lèi)Fig.5 Dendrogram of 53 pumpkins derived from clustering analysis based on the 6 principal component factors

3 結(jié)論與討論

本研究在選擇食用南瓜商品種時(shí)，主要是針對(duì)老熟果蒸煮食用的南瓜品種。對(duì)美洲南瓜類(lèi)型，只選擇食用方式和表型特征與此類(lèi)南瓜相似的7-皇貝貝，而沒(méi)有選擇長(zhǎng)條筍瓜和圓形筍瓜的品種。主要是考慮到長(zhǎng)條或者圓形筍瓜，以食用嫰果為主，且筍瓜材料種間遺傳組成差異較大[34]，筍瓜與中國(guó)南瓜和印度南瓜差異較大[35]，因此，增加筍瓜類(lèi)型，會(huì)使供試材料生物多樣性指數(shù)和遺傳相似系數(shù)異常，不利于本研究數(shù)據(jù)分析。

供試材料的分子聚類(lèi)與第一次利用30個(gè)表型性狀進(jìn)行聚類(lèi)的結(jié)果不完全統(tǒng)一的主要原因，可能是由于試驗(yàn)中使用的分子標(biāo)記，雖然是在前期SSR擴(kuò)增試驗(yàn)中具有穩(wěn)定多態(tài)性的引物，但是數(shù)目有限，不能完全代表供試材料廣泛的遺傳背景[36]，同時(shí)，這些分子標(biāo)記與30個(gè)表型性狀也不能完全對(duì)應(yīng)[37]，因此導(dǎo)致二者的聚類(lèi)結(jié)果不能統(tǒng)一。主成分分析被廣泛應(yīng)用于作物表型性狀的核心指標(biāo)篩選[38]，提高表型聚類(lèi)與分子聚類(lèi)的吻合度[39]，是現(xiàn)代育種的重要方法。從30個(gè)表型性狀的主成分分析中，根據(jù)貢獻(xiàn)率得到6個(gè)主成分，包括子房和成熟果實(shí)的皮色、果實(shí)表面的條斑網(wǎng)格、果型指數(shù)、口感和植株分枝萌蘗等8個(gè)性狀。利用這8個(gè)性狀對(duì)53份南瓜材料進(jìn)行二次表型聚類(lèi)，得到了與分子聚類(lèi)符合度更高的結(jié)果。其原因可能在于，不同表型性狀對(duì)主成分因子貢獻(xiàn)率不同[38]。剔除葉色、株型、株高、花期等在供試材料間表現(xiàn)較為一致、貢獻(xiàn)率較低的表型特征，減少表型聚類(lèi)的干擾因素，突出貢獻(xiàn)率較大的主成分因子，最終獲得較為準(zhǔn)確的聚類(lèi)結(jié)果。這樣，一方面解決了表型聚類(lèi)與分子聚類(lèi)結(jié)果不統(tǒng)一的問(wèn)題，另一方面為今后食用南瓜性狀調(diào)查簡(jiǎn)化了調(diào)查指標(biāo)，避免了性狀間相互作用造成的重復(fù)選擇。

本研究的3次聚類(lèi)結(jié)果均表明，現(xiàn)有印度南瓜品種及育種材料在表型和分子層面親緣關(guān)系較近，存在同質(zhì)化。周秦等[14]對(duì)26份南瓜種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，也發(fā)現(xiàn)同樣問(wèn)題，并且指出，同質(zhì)型南瓜親本或者品種即便再組合，也還會(huì)和原始親本聚在一起。高斌等[40]在對(duì)北方花生育成品種以及骨干親本進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定和系譜分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)相同的花生骨干親本在不同地區(qū)被反復(fù)利用，導(dǎo)致花生品種間相似度升高。研究指出，加大相對(duì)封閉地區(qū)的南瓜材料引種，以及利用種間雜交，能夠拓寬南瓜遺傳多樣性[41]。3次聚類(lèi)都將中印南瓜種間雜交自交系及其新配組合聚為一類(lèi)，與供試印度南瓜商品種及骨干親本明顯區(qū)分開(kāi)。這與王瑞等[24]得到的結(jié)果相同。他們?cè)谘芯?5份南瓜資源親緣關(guān)系的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)緣雜交中間類(lèi)型被聚在一起，形成一個(gè)分枝。這些都顯示了種間雜交對(duì)增加南瓜遺傳多樣性的有效性。通過(guò)種間雜種，為培育特色南瓜新品種提供異質(zhì)基因，推陳出新。供試材料中，18-ZVF和48-ZVG是利用中印南瓜遠(yuǎn)緣雜種自交系與骨干親本自配雜交組合，植株耐熱，果肉粉香，淀粉含量高；在參加2021年新疆昌吉中國(guó)園藝學(xué)會(huì)南瓜研究分會(huì)南瓜新品種展示會(huì)時(shí)，受到承辦方的好評(píng)。