牦牛KIF2A基因克隆及其在卵泡與卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程的表達(dá)規(guī)律

楊滿珍，閔星宇，，楊璐瑜，于海玲，，胡宇磊，，朱艷錦，潘幫婷，李 鍵，，熊顯榮，

(1.西南民族大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.青藏高原動(dòng)物遺傳育種資源保護(hù)與利用國(guó)家教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；3.動(dòng)物科學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

Aizawa等[1]在小鼠腦組織首次發(fā)現(xiàn)KIF1-5，成功完成了前體cDNA的克隆和測(cè)序，并通過(guò)Northern Blot分析表明，KIF1、KIF3、KIF5只在小鼠腦組織表達(dá)、而KIF2和KIF4在腦和其他組織表達(dá)。Debernardi等[2]揭示了人和鼠驅(qū)動(dòng)蛋白的酶促活性區(qū)域的空間結(jié)構(gòu)域后，含有驅(qū)動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)被逐漸發(fā)現(xiàn)，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)及功能的不同被劃分為14個(gè)家族[3]。KIF2A(Kinesin family member 2A，KIF2A)、KIF2B、KIF2C(也稱MCAK)、KIF24同屬于驅(qū)動(dòng)蛋白超家族-13(Kinesin superfamily of proteins 13)，該家族的共性是含有一個(gè)極保守的動(dòng)力結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是微管動(dòng)態(tài)變化的重要調(diào)控者[4]。在高等真核生物的細(xì)胞分裂中，微管的伸長(zhǎng)和收縮對(duì)紡錘體尺寸、染色體的運(yùn)動(dòng)十分重要[5-6]。KIF2A具有微管解聚活性，其通過(guò)增加或減少微管末端的蛋白亞基調(diào)節(jié)神經(jīng)元的發(fā)育、參與機(jī)體物質(zhì)運(yùn)輸、調(diào)控紡錘體的組裝[7-9]。在有絲分裂中，KIF2A定位于紡錘體負(fù)末端，與位于正末端的MCAK相互配合維持紡錘體的雙極性[10]。Bufe等[11]研究表明，Wnt信號(hào)通路在有絲分裂過(guò)程中調(diào)控KIF2A與PLK1的活性以確保紡錘體定位和染色體排列正確。

基于KIF2A在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中的功能研究和發(fā)現(xiàn)，近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，KIF2A與細(xì)胞分裂相關(guān)因子相互作用，共同調(diào)控減數(shù)分裂過(guò)程中紡錘體形成和染色體運(yùn)動(dòng)。Chen等[12]研究表明，紡錘絲或紡錘體異常會(huì)影響甚至破壞卵母細(xì)胞的正常分裂和第一極體的排出速率。Eagleson等[13]研究表明，非洲爪蟾早期胚胎中KIF2A耗盡會(huì)導(dǎo)致紡錘體形成缺陷，早期胚胎胞質(zhì)分裂失敗抑制胚胎發(fā)育。除此之外，研究表明，KIF2A在人類胎兒生殖細(xì)胞(Fetal germ cells，F(xiàn)GCS)4個(gè)重要發(fā)育階段，以及人卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中3個(gè)關(guān)鍵時(shí)期差異表達(dá)，KIF2A通過(guò)紡錘體的組裝調(diào)控染色體排列對(duì)人卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育有重要作用[14]。Xu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠卵母細(xì)胞中KIF2A主要定位于紡錘體，利用siRNA干擾小鼠卵母細(xì)胞KIF2A的表達(dá)后，紡錘體組裝和染色體聯(lián)會(huì)異常，小鼠卵母細(xì)胞微絲帽的形成受損。Chen等[16]研究表明，下調(diào)小鼠卵母細(xì)胞中KIF2A的表達(dá)后，會(huì)出現(xiàn)染色體排列紊亂，異常的不對(duì)稱分裂等現(xiàn)象；檢查點(diǎn)蛋白BubR1被激活，使小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育阻滯于MⅠ期，最終導(dǎo)致第一極體排出的速率降低。綜上，KIF2A基因?qū)?xì)胞分裂、卵母細(xì)胞成熟等過(guò)程具有重要作用。

牦牛(Bosgrunniens)作為高原地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種群，具有耐寒、耐粗飼、抗病和抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，其有“高原之舟”的美譽(yù)，是高原地區(qū)牧民主要的生產(chǎn)生活資料和經(jīng)濟(jì)來(lái)源[17-18]，但與平原牛種相比，牦牛性成熟晚、發(fā)情率低、空懷率高，繁殖性能低[19-20]。KIF2A基因可能與牦牛雌性繁殖力相關(guān)，但目前關(guān)于KIF2A基因的研究主要集中在人和小鼠上，尚未見牦牛KIF2A基因的相關(guān)研究報(bào)道，KIF2A基因是否參與調(diào)控牦牛卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟尚不清楚。

本研究擬通過(guò)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增牦牛KIF2A基因，分析其序列結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特征，并利用RT-qPCR檢測(cè)KIF2A在牦牛各組織中的表達(dá)模式；通過(guò)免疫組織化學(xué)染色分析該基因在牦牛卵巢組織中的表達(dá)定位；利用RT-qPCR檢測(cè)在不同發(fā)育程度卵泡顆粒細(xì)胞和不同成熟階段卵母細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律，旨為進(jìn)一步挖掘KIF2A在牦牛雌性繁殖方面的調(diào)控作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品的采集和處理

試驗(yàn)樣品采自成都市青白江區(qū)屠宰場(chǎng)，母牦牛屠宰后，立即采集卵巢、心、肝、脾、肺、腎、胃、子宮(n=5)，使用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗后，剪成0.5 cm3的組織塊，裝入凍存管并標(biāo)記，放入液氮罐中保存。完整卵巢組織用含有1%雙抗的PBS沖洗數(shù)遍，隨機(jī)取3個(gè)用4%多聚甲醛固定液固定用于免疫組織化學(xué)染色，其余的卵巢投入含1%雙抗的37 ℃生理鹽水保溫瓶中用于細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2 主要儀器與試劑、

二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))；光學(xué)顯微鏡(Laika，意大利)；激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss，德國(guó))；熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國(guó))；超純水系統(tǒng)(MILLI-Q，法國(guó))高通量組織研磨器(新芝，中國(guó))；紫外分光光度計(jì)(Biospec-nano，日本)。RNA isolater、PCR相關(guān)試劑盒(諾唯贊)；TAE緩沖液、DEPC水(碧云天)；感受態(tài)細(xì)胞DH5α、DNA膠回收試劑盒(天根生化)；Rabbit Anti-KIF2A antibody(博奧森)；透明質(zhì)酸酶、瓊脂糖購(gòu)(索萊寶)；胎牛血清(FBS)、DMEM/F12培養(yǎng)基、Medium 199培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))。

1.3 卵母細(xì)胞的分離培養(yǎng)

使用PBS沖洗卵巢組織3次，使用6號(hào)針頭注射器將小、中、大卵泡中的卵泡液抽出，分別置于60 mm培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下用撿卵針(2.5 mm×2.0 mm×100.0 mm玻璃細(xì)管拉制)收集卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(Cumulus-oocytecomplexes，COCs)。同時(shí)將剩余卵泡液中的COCs撿去，分別收集到1.5 mL離心管中并標(biāo)記，3 000 r/min離心5 min后棄上清，PBS清洗3次，沉淀加1 mL培養(yǎng)液(10%FBS、89% DMEM/F12、1%雙抗)得到顆粒細(xì)胞備用。使用培養(yǎng)箱37 ℃平衡6 h的卵母細(xì)胞成熟液(10% FBS、89% Medium 199、1%雙抗1 μg/mL EGF、0.05 IU/mL FSH、0.05 IU/mL LH、0.5 μg/mL 17β-E2)將COCs清洗3次，取50枚置于0.5%透明質(zhì)酸酶溶液中處理2 min，使顆粒細(xì)胞脫去后收集GⅤ期卵母細(xì)胞。剩余COCs轉(zhuǎn)入卵母細(xì)胞成熟液培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱(二氧化碳5%、38.5 ℃)中培養(yǎng)12，24 h后，分別收集培養(yǎng)到MⅠ期和MⅡ期的卵母細(xì)胞。

1.4 cDNA的獲取及cDNA合成

各組織樣用高通量組織研磨器研磨后加入1 mL RNA isolater，使組織、細(xì)胞充分溶解，經(jīng)氯仿離心取上清、異丙醇沉淀、75%乙醇清洗、DEPC水促溶獲得所有樣品總RNA，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度，選取OD260/280值介于1.8～2.0的RNA樣本，將上述RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書分別反轉(zhuǎn)合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物設(shè)計(jì)合成與克隆

根據(jù)GenBank中預(yù)測(cè)的野牦牛(Bosmutus)KIF2A基因序列(XM_014479690.1)及內(nèi)參基因序列GAPDH(XM_014482068.1)，運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。以卵巢cDNA(200 ng/μL)為模板，使用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增KIF2A序列，擴(kuò)增體系為50 μL，2 × Phanta?Max Master Mix(Dye Plus)25 μL，ddH2O 19 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，模板2 μL。程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，59 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃徹底延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物通過(guò)濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳分析，將目的條帶切下，產(chǎn)物純化回收，連接轉(zhuǎn)化后隨機(jī)篩選數(shù)個(gè)陽(yáng)性菌種送生工生物工程(成都)有限公司測(cè)序。

1.6 牦牛KIF2A基因生物信息學(xué)分析

牦牛KIF2A基因生物信息學(xué)分析工具參見表2。

1.7 KIF2A表達(dá)分析

利用RT-qPCR技術(shù)，GAPDH作為內(nèi)參基因，檢測(cè)分析KIF2AmRNA在牦牛各組織、不同直徑大小卵泡顆粒細(xì)胞以及不同發(fā)育程度卵母細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)體系：2 × AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，ddH2O 8.2 μL，模板(200 ng/μL) 1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，50×ROX Reference Dye 1 0.4 μL。RT-qPCR反應(yīng)程序

表1 PCR引物序列及產(chǎn)物信息Tab.1 PCR primer sequences and products information

表2 生物信息學(xué)分析內(nèi)容和工具Tab.2 Bioinformatics analysis contentsand tools

如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線為60～95 ℃ 每10 s增加0.5 ℃。

1.8 免疫組織化學(xué)染色分析

從4%多聚甲醛固定液中取出卵巢，PBS沖洗后制作石蠟切片，切片放入二甲苯、梯度酒精、純水中依次洗滌，置于EDTA(pH值9.0)溶液中于烤箱內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)15 min，PBS洗滌3次，每次5 min。用紙巾輕輕擦拭組織周圍殘留的PBS，3% H2O2覆蓋避光孵育25 min；3%BSA覆蓋室溫封閉30 min；滴加一抗(單克隆兔抗KIF2A，1∶200稀釋，博奧森)，用封口膜蓋住防止干燥，4 ℃孵育過(guò)夜；移去封口膜，滴加二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記)室溫閉關(guān)孵育1 h，滴加DAB顯色液顯色，鏡下觀察顯色程度，純水沖洗切片終止顯色；蘇木精復(fù)染；梯度酒精、二甲苯脫水晾干封片；使用共聚焦顯微鏡拍照。

1.9 數(shù)據(jù)分析

利用2-ΔΔCt法對(duì)RT-qPCR結(jié)果進(jìn)行分析，通過(guò)SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，用一般線性模型對(duì)各個(gè)組織及顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞中KIF2A的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行比較，當(dāng)P<0.05時(shí)差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛KIF2A基因的克隆和序列分析

以卵巢cDNA為模板，PCR擴(kuò)增KIF2A基因后，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示目的條帶清晰，片段與預(yù)期大小一致(圖1-A)。經(jīng)測(cè)序獲得牦牛KIF2A基因全長(zhǎng)為1 964 bp，CDS為1 530 bp，編碼509個(gè)氨基酸(圖1-B)。利用DNAMAN 6.0軟件將測(cè)定序列的CDS與NCBI上黃牛KIF2A基因(NM_001077073.1)的CDS核苷酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)657 bp位點(diǎn)和1 073 bp位點(diǎn)上存在堿基突變，其中657 bp堿基突變(C→G)導(dǎo)致該位點(diǎn)的氨基酸由Gly變?yōu)锳rg(圖1-C)。

A：M.DL2000 DNA Marker，1.KIF2A基因；B.牦牛KIF2A基因預(yù)測(cè)序列及推測(cè)的氨基酸序列；C.測(cè)定序列與黃牛KIF2A編碼區(qū)序列差異。A： M.DL2000 DNA Marker，1.KIF2A gene；B. Predicted sequence of KIF2A gene and predicted amino acid sequence of yak;C. The difference between the determination sequence and the KIF2A coding region sequence of cattle.

2.2 牦牛KIF2A基因生物信息學(xué)分析

通過(guò)DNAMAN將預(yù)測(cè)的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列后，運(yùn)用表2所列工具分析預(yù)測(cè)KIF2A蛋白的理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)分子式為：C2534H4075N727O781S25，分子質(zhì)量為58.023 ku，脂肪指數(shù)81.41，等電點(diǎn)為6.32，帶正、負(fù)電荷殘基總數(shù)分別為73，77個(gè)，整體帶負(fù)電。KIF2A在哺乳動(dòng)物未完全成熟的紅細(xì)胞(體外)、酵母和大腸桿菌(體內(nèi))的半衰期分別為30，20，10 h。KIF2A含量較高的氨基酸Leu(L)有47個(gè)占比為9.2%，含量較低的氨基酸Arg(W)有2個(gè)占比0.4%。KIF2A蛋白質(zhì)中有15種氨基酸親水性數(shù)值小于0，總親疏水性平均值為-0.68，該蛋白為疏水性蛋白(圖2-A)。KIF2A蛋白共有90個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，其中潛在的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)最多48個(gè)(圖2-B)。通過(guò)STRING在線預(yù)測(cè)，與KIF2A互作的蛋白主要有CENPE、KIF18A、TMED10、PLK1等(圖2-C)。

A.牦牛KIF2A蛋白親疏水性分析；B.牦牛KIF2A蛋白磷酸化位點(diǎn)分析；C.牦牛KIF2A蛋白互作蛋白預(yù)測(cè)。A.Hydrophilic and hydrophobic analysis of yak KIF2A protein；B.Phosphorylation site analysis of yak KIF2A protein；C.Prediction of yak KIF2A protein interaction protein.

2.3 牦牛KIF2A蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)分析

KIF2A蛋白分子具有一個(gè)Kinesin動(dòng)力結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有水解ATP、運(yùn)輸物質(zhì)和微管解聚功能，位于700～1 700 bp(圖3-A)。牦牛KIF2A蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的無(wú)規(guī)則卷曲占比最大為49.96%，其次是α-螺旋占23.81%，再次是延伸連和β-轉(zhuǎn)角占比分別為18.54%，9.69%(圖3-B)。KIF2A蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)中主要由α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈纏繞而成，延伸鏈介于α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲之間(圖3-C)。

2.4 牦牛KIF2A基因同源性分析與進(jìn)化樹

利用NCBI同源性比對(duì)不同物種間KIF2A氨基酸序列，結(jié)果顯示，牦牛與野牛(XM_010845503.1)、瘤牛(XM_027520446.1)和綿羊(XM_015101285.2)的同源性較高，分別為99.87%，99.48%，98.67%，與小鼠(XM_036157878.1)的同源性較低為91.02%(圖4-A)。利用MEGA 6.0軟件對(duì)牦牛在內(nèi)的12個(gè)物種KIF2A氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，牦牛與野牛首先聚在一起彼此親緣關(guān)系較近，二者隨后與瘤牛聚在一起，12個(gè)物種中最后與小鼠聚在一起，說(shuō)明牦牛與小鼠親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4-B)。綜上可知，KIF2A基因在不同物種間進(jìn)化過(guò)程中較為保守。

2.5 牦牛KIF2A基因在各個(gè)組織中的表達(dá)差異分析

以GAPDH作為內(nèi)參，利用RT-qPCR檢測(cè)KIF2A在卵巢、心、肝、脾、肺、腎、胃、子宮中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，KIF2AmRNA在牦牛各個(gè)組織中均有表達(dá)，其在心臟和卵巢組織表達(dá)水平差異不顯著，但二者的表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)，在胃中的表達(dá)量最低(圖5)。

A.牦牛KIF2A蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析；B.牦牛KIF2A二級(jí)結(jié)構(gòu)；C.牦牛KIF2A蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。A.Functional domain analysis of yak KIF2A protein；B.The secondary structure of yak KIF2A protein；C.The tertiary structure of yak KIF2A protein.

A.不同物種間KIF2A同源性分析；B.牦牛KIF2A系統(tǒng)發(fā)育樹。A.Homology analysis of KIF2A among different species；B.Phylogenetic tree of yak KIF2A.

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖7同。Different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05).The same as Fig.7.

2.6 KIF2A在牦牛卵巢中的表達(dá)定位

通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)牦牛卵巢中KIF2A表達(dá)及定位，如圖6所示，KIF2A在牦牛各級(jí)卵泡中都有表達(dá)；其中有腔卵泡顆粒細(xì)胞的陽(yáng)性信號(hào)最強(qiáng)，卵泡膜細(xì)胞和周圍組織中有少量陽(yáng)性信號(hào)，說(shuō)明KIF2A主要定位于顆粒細(xì)胞中。

A.牦牛卵巢概覽圖；B.有腔卵泡；C.有腔卵泡局部放大：GC.壁層顆粒細(xì)胞，TC.膜細(xì)胞。A.General picture of yak ovary；B.Antral follicle，C.Local enlargement of antral follicle： GC.Granular cell，TC.Theca cells.

2.7 KIF2A在卵泡顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞的表達(dá)分析

以GAPDH作為內(nèi)參，使用RT-qPCR檢測(cè)KIF2A基因在牦牛不同直徑大小(小、中、大)卵泡顆粒細(xì)胞、不同成熟階段卵母細(xì)胞(GⅤ、MⅠ、MⅡ)中的表達(dá)量。結(jié)果顯示，KIF2A基因的相對(duì)表達(dá)水平伴隨著卵泡發(fā)育呈上升趨勢(shì)，在大卵泡中的表達(dá)水平顯著高于小、中卵泡(P<0.05，圖7-A)。KIF2A在牦牛卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，其表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，GⅤ期表達(dá)水平顯著高于MⅠ期和MⅡ期(P<0.05，圖7-B)。

A.小、中、大卵泡顆粒細(xì)胞KIF2A的相對(duì)表達(dá)水平；B.不同時(shí)期卵母細(xì)胞KIF2A的相對(duì)表達(dá)水平。A.Relative expression levels of KIF2A in small，medium and large follicular granulosa cells；B.Relative expression levels of KIF2A in oocytes at different stages.

3 結(jié)論與討論

雌性哺乳動(dòng)物生殖發(fā)育是繁衍后代的重要生理過(guò)程，其中最為重要的事件即卵泡發(fā)育。雖然卵巢在胎兒時(shí)期就已經(jīng)產(chǎn)生，出生前數(shù)百萬(wàn)個(gè)卵原細(xì)胞增殖分裂成初級(jí)卵母細(xì)胞，但直到初情期后原始卵泡才被逐漸激活，初級(jí)卵母細(xì)胞從卵泡中排出，減數(shù)分裂后成熟的卵子才具備受精能力[21-23]。細(xì)胞分裂時(shí)細(xì)胞核逐步凝集成染色體，排列于赤道，微管聚集在染色體周圍不斷重排形成紡錘體移向兩極，極微管、動(dòng)力微管連接兩級(jí)紡錘體與動(dòng)力馬達(dá)分子配合，染色體上的動(dòng)粒結(jié)構(gòu)與多根微管結(jié)合，形成微管纖維，核膜解體后，姐妹染色單體分開移向兩極[24-26]，核質(zhì)徹底分裂成2個(gè)子細(xì)胞。研究表明，紡錘絲或紡錘體異常會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，進(jìn)而導(dǎo)致不孕或流產(chǎn)[27-28]。在細(xì)胞分裂過(guò)程中PLK1被激活并結(jié)合MRN、KIF2A構(gòu)成復(fù)合物，磷酸化KIF2A增強(qiáng)其解聚活性，調(diào)控卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中微管細(xì)胞骨架、微絲的長(zhǎng)度，確保紡錘體的生成、促進(jìn)染色體分離[29]。因此，探究KIF2A在卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中表達(dá)規(guī)律具有重要意義。

為了探究牦牛KIF2A基因與卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟的相關(guān)性，本試驗(yàn)克隆了牦牛KIF2A基因，并獲得完整的CDS全長(zhǎng)1 530 bp，編碼509個(gè)氨基酸。本研究發(fā)現(xiàn)，牦牛KIF2A蛋白共有90個(gè)磷酸化位點(diǎn)，早期的研究表明，KIF2A微管解聚的活性是由一些蛋白激酶在特定位點(diǎn)磷酸化后被激活的[30-31]。通過(guò)物種間基因進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，KIF2A基因與黃牛、野牛的同源性較高，且親緣關(guān)系較近，提示該基因在物種進(jìn)化過(guò)程中高度保守。Gao等[32]研究表明，KIF2A在昆蟲類與小鼠之間高度保守[33]，其同家族基因KIF2C在人和斑馬魚之間也高度保守。另外測(cè)序所得牦牛KIF2A基因CDS序列與NCBI上黃牛CDS序列相比有2個(gè)堿基突變，其中1個(gè)導(dǎo)致了氨基酸改變，這種差異可能與牦牛長(zhǎng)期生活在高原地區(qū)有關(guān)，但該氨基酸的突變是否影響到KIF2A蛋白的功能，而影響牦牛的繁殖性能還需要進(jìn)一步研究。在功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)分析過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，牦牛KIF2A富含豐富的螺旋結(jié)構(gòu)域，在700～1 700 bp處具有一個(gè)Kinesin動(dòng)力結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有水解ATP、運(yùn)輸物質(zhì)和微管解聚功能。有研究表明，其他KIFs的動(dòng)力結(jié)構(gòu)域在N端或C端，KIF2A的動(dòng)力結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)的中心部分[34]，該結(jié)構(gòu)域是精子鞭毛運(yùn)動(dòng)[35]、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、紡錘體組裝、染色體的聯(lián)會(huì)[36-37]動(dòng)力來(lái)源之一。因此，推測(cè)KIF2A基因?qū)﹃笈Ｂ雅莅l(fā)育以及卵母細(xì)胞的成熟有重要作用。

隨著卵泡發(fā)育，卵泡膜分內(nèi)外2層，卵泡腔內(nèi)主要是壁顆粒細(xì)胞、卵丘顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞，顆粒細(xì)胞合成分泌黏多糖包裹卵母細(xì)胞，顆粒細(xì)胞膜的突起是為卵母細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和傳遞信息的重要樞紐[38-40]。免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，KIF2A在牦牛卵巢組織各級(jí)卵泡中均有表達(dá)，陽(yáng)性信號(hào)隨著卵泡直徑增加逐漸增強(qiáng)，主要定位于顆粒細(xì)胞中，提示KIF2A可能是通過(guò)顆粒細(xì)胞發(fā)揮其生物學(xué)功能。顆粒細(xì)胞與卵泡膜細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子、分泌蛋白以及類固醇激素等調(diào)控卵泡發(fā)育以及卵母細(xì)胞的成熟[41]。Zhang等[42]發(fā)現(xiàn)，KIF2A的同家族基因Oocyte-G1在不同年齡段小鼠卵巢組織中差異表達(dá)，在卵泡中主要定位于卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及其周圍一些顆粒細(xì)胞中，且過(guò)表達(dá)Oocyte-G1會(huì)使小鼠卵泡發(fā)育遲緩。綜上，推斷KIF2A可能通過(guò)顆粒細(xì)胞參與調(diào)控牦牛卵巢卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟。

為了進(jìn)一步探究KIF2A在牦牛雌性生殖細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律，本研究通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)牦牛不同發(fā)育程度卵泡顆粒細(xì)胞、不同成熟階段卵母細(xì)胞KIF2A基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示，KIF2A在小、中、大卵泡顆粒細(xì)胞中差異表達(dá)，KIF2A在牦牛不同成熟階段卵母細(xì)胞時(shí)序表達(dá)，其在GⅤ期的表達(dá)量顯著高于MⅠ、MⅡ期。隨著卵泡的發(fā)育，卵泡中顆粒細(xì)胞KIF2A的表達(dá)增加，可能是由于大卵泡時(shí)期卵母細(xì)胞需要積累大量營(yíng)養(yǎng)，顆粒細(xì)胞分泌大量類固醇激素、細(xì)胞因子和蛋白[41-43]，為減數(shù)第二次分裂做準(zhǔn)備，因此，這一時(shí)期的卵母細(xì)胞對(duì)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)男枰葹槠惹?，大量的酶被逐漸激活，尤其是卵泡發(fā)育與卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中所需的蛋白因子；而KIF2A的Kinesin動(dòng)力結(jié)構(gòu)域可能為這一時(shí)期卵泡內(nèi)諸多細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸、分裂分化提供動(dòng)力。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞內(nèi)Kinesin、Dynein和Myosin共同承擔(dān)了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)娜蝿?wù)[44]，KIFs的Kinesin動(dòng)力結(jié)構(gòu)域和豐富的螺旋結(jié)構(gòu)域使得其易于折疊和改變形狀，滿足細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)的運(yùn)輸需求。而卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中KIF2A表達(dá)量逐漸下降的原因，可能與CyclinB1的降解和MPF活性(Maturation-Promoting Factor，MPF)的缺失有相關(guān)性，研究表明，卵母細(xì)胞從初級(jí)卵母細(xì)胞發(fā)育到次級(jí)卵母細(xì)胞必然會(huì)使CyclinB1降解和MPF活性缺失[45-46]。因此，推測(cè)KIF2A的表達(dá)下降可能是由MPF的上調(diào)導(dǎo)致的，但具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究克隆得到牦牛KIF2A基因CDS序列全長(zhǎng)1 964 bp，其中CDS為1 530 bp，編碼509個(gè)氨基酸。KIF2A在物種進(jìn)化過(guò)程中高度保守；KIF2AmRNA在牦牛各組織中廣泛表達(dá)，并且在牦牛不同發(fā)育程度卵泡顆粒細(xì)胞、不同成熟階段卵母細(xì)胞中時(shí)序表達(dá)。提示，該基因可能參與調(diào)控牦牛卵泡發(fā)育與卵母細(xì)胞成熟。以上研究結(jié)果可為牦牛卵泡生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)理及功能的研究提供可靠的理論依據(jù)。