草莓白粉病菌LAMP可視化快速檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

賁海燕，郝永娟，霍建飛，姚玉榮，高 葦，王萬(wàn)立

(天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，天津 300381)

草莓白粉病是保護(hù)地草莓發(fā)病面積較大、發(fā)病頻率較高的草莓病害之一，其病原菌是子囊菌亞門真菌羽衣草單囊殼菌(Sphaerothecaaphanis)，主要危害草莓的葉片和果實(shí)，有時(shí)還會(huì)危害草莓的花梗和葉柄，匍匐莖上很少發(fā)生[1]。草莓白粉病的發(fā)生貫穿草莓生長(zhǎng)的各個(gè)階段，并且該病在世界各地均有分布，我國(guó)較為寒冷的華北平原地區(qū)草莓白粉病發(fā)病較為嚴(yán)重[2-3]。近年來(lái)，保護(hù)地尤其是栽培條件良好的大棚更容易發(fā)生草莓白粉病，一旦發(fā)病，整棚的草莓都可能被感染，嚴(yán)重時(shí)病葉率超過(guò)45%，病果率超過(guò)50%，給種植農(nóng)戶帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

目前，施用化學(xué)農(nóng)藥仍然是防治草莓白粉病最主要的措施[5]。紅顏、章姬等品種對(duì)草莓白粉病較為敏感，農(nóng)戶頻繁使用藥劑，導(dǎo)致病菌抗藥性較高、草莓用藥量居高不下，嚴(yán)重威脅著草莓的安全生產(chǎn)。因此，開展草莓白粉病預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)研究對(duì)于科學(xué)防治草莓白粉病具有重要意義。傳統(tǒng)的白粉病早期檢測(cè)方法是根據(jù)發(fā)病組織癥狀、病原菌特征、研究人員的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行識(shí)別。由于白粉病引起的早期褪綠與其他病原引起的癥狀相似，因此，很難得出準(zhǔn)確的判斷[6]。另外，白粉病是專性寄生菌，不能進(jìn)行人工培養(yǎng)，因此，不能簡(jiǎn)單依靠傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、血清鑒定和ELISA等方法進(jìn)行檢測(cè)[7]。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年日本學(xué)者Notomi報(bào)道的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，其能夠識(shí)別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域的4條正反向外引物和正反向內(nèi)引物，利用高活性鏈置換DNA聚合酶，特異、高效地?cái)U(kuò)增靶基因[8]。LAMP反應(yīng)產(chǎn)物不僅可以通過(guò)濁度儀、Real-time PCR儀及凝膠電泳儀進(jìn)行檢測(cè)，還可以通過(guò)SYBR Green Ⅰ、鈣黃綠素、羥基萘酚藍(lán)染色后肉眼識(shí)別[9-10]。由于LAMP反應(yīng)快速、高效，無(wú)需特殊設(shè)備，極適合在基層生產(chǎn)部門推廣應(yīng)用。目前LAMP檢測(cè)主要用于人畜病原物、食品安全和環(huán)境衛(wèi)生相關(guān)微生物的檢測(cè)，在植物病原菌檢測(cè)中也有較多報(bào)道[11-12]，而關(guān)于草莓白粉病菌的LAMP檢測(cè)國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。因此，開發(fā)一種針對(duì)草莓白粉病菌可視化LAMP檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于草莓白粉病的早期診斷、病原菌鑒定，及時(shí)、高效地控制草莓白粉病的發(fā)生和蔓延具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試菌株：草莓白粉病菌(Sphaerothecaaphanis(Wall.) Braun)為天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所蔬菜病害研究室采自感病品種，純化后活體保存的菌株；陰性對(duì)照菌株為其他作物白粉病病原菌及草莓上常見(jiàn)病害病原菌：黃瓜白粉病(單絲殼白粉菌Sphaerothecafuliginea)、辣椒白粉病(辣椒擬粉孢菌Oidiopsistaurica)、番茄白粉病(蓼白粉菌Erysiphepolygoni)、葡萄霜霉病(葡萄生單軸霜霉菌Plasmoparaviticola)、黃瓜霜霉病(古巴假霜霉菌Pseudoperonosporacubensis)、甜瓜白粉病(單囊殼白粉菌Sphaerothecafuliginea)、草莓根腐病(尖孢鐮孢菌Fusariumoxysporum)、草莓灰霉病(灰葡萄孢菌Botrytiscinerea)、草莓炭疽病(膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides)、黃瓜靶斑病(多主棒孢菌Corynesporacassiicola)、番茄灰葉斑病(茄匍柄霉Stemphyliumsolani)和蘿卜黑斑病(蘿卜鏈格孢菌Alternariaraphani)。供試菌株均保存于天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。

供試試劑：ITS4/ITS5(北京擎科生物科技有限公司)、甜菜堿和鈣黃綠素(麥克林生物科技有限公司)、微生物基因組提取試劑盒T5 Direct PCR Kit(北京擎科生物科技有限公司)、Bst DNA polymerase和MgSO4(上海生物化工有限公司)、PCR Mix(北京擎科生物科技有限公司)、dNTP Mixture和DNA Ladder(北京全式金公司)等。

儀器：超凈工作臺(tái)(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)、中型冷凍高速離心機(jī)(德國(guó)艾本德股份公司)、Bio Rad PCR儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(賽默飛世爾科技公司)、電熱恒溫水槽(上海赫田科學(xué)儀器有限公司)和核酸濃度檢測(cè)儀(賽默飛世爾科技公司)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試菌株基因組DNA的快速提取及測(cè)序 病原菌DNA快速提取采用T5 Direct PCR Kit(北京擎科生物科技有限公司)。具體步驟如下：用滅菌牙簽挑取少量草莓白粉病菌菌絲(天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所實(shí)驗(yàn)室保存)放入滅菌PCR管中，加入50 μL Lysis Buffer A溶液，95 ℃溫育10 min后，10 000 r/min離心20 s，取上清液25～30 μL，加入等體積Dilution Buffer B溶液，使用振蕩器振蕩混勻，得到DNA溶液，用核酸濃度檢測(cè)儀測(cè)定DNA濃度后，-20 ℃保存用于LAMP擴(kuò)增試驗(yàn)。全基因組DNA提取過(guò)程用時(shí)15 min左右。提取DNA后進(jìn)行ITS序列的PCR擴(kuò)增，采用真菌通用ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)和ITS5(5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3)。PCR擴(kuò)增體系為：25 μL TaqMaster Mix，DNA模板2 μL，引物各2 μL，dd H2O補(bǔ)足至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩U(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 特異性LAMP引物設(shè)計(jì) 以測(cè)序的羽衣草單囊殼菌的ITS序列為靶標(biāo)，在GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載多種白粉病菌的ITS序列(黃瓜白粉病菌、辣椒白粉病菌和番茄白粉病菌)，同時(shí)下載多種常見(jiàn)的草莓致病菌的ITS序列(草莓根腐病菌、草莓灰霉病菌、草莓炭疽病菌)。根據(jù)LAMP引物設(shè)計(jì)的原則，利用PrimerPremier 5 .0軟件，針對(duì)其6個(gè)特定區(qū)域，設(shè)計(jì)一套草莓白粉病菌特異性LAMP引物組，由1對(duì)外側(cè)引物F3/B3、1對(duì)內(nèi)側(cè)引物FIP/BIP和1對(duì)環(huán)引物L(fēng)F/LB組成，具體信息如表1所示。

表1 用于草莓白粉病菌LAMP測(cè)試設(shè)計(jì)的引物組信息Tab.1 Designed primer set for LAMP detection of strawberry powdery mildew

1.2.3 LAMP實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法的建立及優(yōu)化 LAMP初始檢測(cè)體系建立(25 μL)：10×Isothermal Amplification Buffer 2.5 μL、終濃度為8 mmol/L的MgSO41.5 μL、終濃度為1.4 mmol/L的dNTPs 3.5 μL、終濃度為0.8 mmol/L的甜菜堿0.4 μL、終濃度為80 U/μL的BstDNA聚合酶0.25 μL、DNA模板2.0 μL、鈣黃綠素1 μL、終濃度1.6 μmol/L的FIP和BIP各1 μL、終濃度0.2 μmol/L F3和B3各1 μL、終濃度0.4 μmol/L LoopF和LoopB各1 μL，無(wú)菌去離子水補(bǔ)足25 μL。LAMP反應(yīng)條件：63 ℃溫育1 h，之后80 ℃下滅活5 min。在LAMP反應(yīng)體系反應(yīng)過(guò)程中，每間隔1 min讀取一次熒光，收集熒光信號(hào)。

反應(yīng)結(jié)果判斷根據(jù)實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線和熒光染料目測(cè)觀察評(píng)估檢測(cè)結(jié)果：實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線檢測(cè)。其中，收集到熒光信號(hào)，擴(kuò)增曲線呈“S”形為陽(yáng)性，未收集到擴(kuò)增熒光信號(hào)的呈直線型為陰性；染料顏色反應(yīng)檢測(cè)。在LAMP反應(yīng)體系中，加入1 μL鈣黃綠素?zé)晒馊玖?Loopamp FD)，反應(yīng)結(jié)束后，肉眼觀察反應(yīng)液呈綠色熒光的為陽(yáng)性，反應(yīng)液呈橙色的為陰性。

LAMP檢測(cè)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化：在反應(yīng)初始體系的基礎(chǔ)上，對(duì)關(guān)鍵因素Mg2+、dNTP、甜菜堿和Bst DNA聚合酶的濃度進(jìn)行一系列優(yōu)化；對(duì)反應(yīng)條件包括溫度和時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。各單因素處理試驗(yàn)，在其他成分用量及條件不變的情況下，分別將dNTPs設(shè)為0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mmol/L共6個(gè)終濃度梯度；Mg2+設(shè)為4，6，8，10，12 mmol/L共5個(gè)終濃度梯度；甜菜堿設(shè)為0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mmol/L共7個(gè)終濃度梯度；BstDNA聚合酶設(shè)為40，80，160，320，340 U/mL共5個(gè)終濃度梯度。反應(yīng)條件優(yōu)化：按以上優(yōu)化好的反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度設(shè)置為63，65，67 ℃進(jìn)行LAMP反應(yīng)；實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線出峰最早的時(shí)間即為最佳反應(yīng)時(shí)間。上述單因素試驗(yàn)，均以滅菌ddH2O為模板作為陰性對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線和熒光顯色雙重結(jié)果，確定最佳成分終濃度。

1.2.4 LAMP對(duì)草莓白粉病菌特異性驗(yàn)證 以草莓白粉病菌及12個(gè)對(duì)照菌株(甜瓜白粉病菌、辣椒白粉病菌、番茄白粉病菌、葡萄霜霉病菌、黃瓜霜霉病、甜瓜白粉病菌、草莓根腐病菌、草莓灰霉病菌、草莓炭疽病菌、黃瓜多主棒孢菌、番茄灰葉斑病菌和蘿卜黑斑病菌)的DNA為模板，利用上述建立優(yōu)化的LAMP檢測(cè)體系，在最佳溫度條件下進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。根據(jù)實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線與反應(yīng)液體熒光顯色相結(jié)合的方法評(píng)估LAMP檢測(cè)體系的特異性。

1.2.5 LAMP和普通PCR對(duì)草莓白粉病菌檢測(cè)靈敏度對(duì)比 草莓白粉病菌DNA快速提取后測(cè)定濃度為3.2 ng/μL，用無(wú)菌超純水將原液DNA按10倍系列稀釋至10-6。以不同質(zhì)量濃度的草莓白粉病菌DNA 2 μL為模板進(jìn)行LAMP靈敏度試驗(yàn)，以去離子水代替DNA模板作為陰性對(duì)照，利用建立的LAMP最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，待LAMP反應(yīng)結(jié)束后，采用實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線和熒光染料目測(cè)觀察法雙重結(jié)果確定LAMP檢測(cè)的靈敏度。實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果：呈“S”形為陽(yáng)性，呈直線為陰性；熒光染料目測(cè)結(jié)果：觀察到綠色熒光為陽(yáng)性，橙色為陰性。

應(yīng)用普通PCR 擴(kuò)增檢測(cè)系列稀釋濃度的草莓白粉病菌DNA(與LAMP檢測(cè)的DNA濃度一致)，反應(yīng)體系為 25 μL：Taq PCR Master 混合物 12.5 μL，ITS1和ITS4引物各 1 μL，1.0 μL 模板 DNA，用滅菌水補(bǔ)足體系至 25 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 90 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。取3 μL PCR 擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增條帶大小。

1.2.6 草莓白粉病菌LAMP檢測(cè)方法重復(fù)性驗(yàn)證 在天津市武清區(qū)草莓溫室(該溫室為草莓白粉病自然發(fā)病病圃，草莓白粉病發(fā)病嚴(yán)重，發(fā)病率在70%以上，整個(gè)生育期未進(jìn)行藥劑防控)采集感染白粉病的草莓葉片、果實(shí)及果柄各5份作為陽(yáng)性樣本；在天津市漢沽草莓溫室(該溫室肥水管理良好，前期藥劑預(yù)防較好，幾乎未見(jiàn)草莓白粉病發(fā)生)采集健康未發(fā)病的葉片、果實(shí)及果柄各5份作為陰性樣本；去離子水3份作為陰性對(duì)照。對(duì)發(fā)病組織進(jìn)行1.2.1中快速全基因組DNA提取，通過(guò)1.2.4中建立的LAMP檢測(cè)方法驗(yàn)證其重復(fù)性及可靠性。

1.2.7 利用建立的LAMP可視化檢測(cè)方法對(duì)田間草莓樣品進(jìn)行檢測(cè) 應(yīng)用已建立的草莓白粉病LAMP檢測(cè)方法對(duì)天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院武清基地草莓試驗(yàn)溫室的草莓白粉病菌進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

樣本采集方法：對(duì)植株不同部位、不同發(fā)病程度的樣本進(jìn)行采集。

分別采集發(fā)病很輕(僅葉片背面出現(xiàn)褪綠斑，病斑上未見(jiàn)白色霉層)、較輕(葉背病斑處有少量、稀疏的白色霉層)和嚴(yán)重(葉片正面和背面病斑處已產(chǎn)生大量、厚密的白色霉層)3種發(fā)病程度的葉片各5片，取健康葉片5片作為陽(yáng)性對(duì)照。

分別采集發(fā)病很輕(果實(shí)略有畸形，但未見(jiàn)任何病斑及白色霉層)、較輕(果實(shí)表面有少量稀疏的霉層)和嚴(yán)重(整個(gè)果實(shí)軟爛已被白色霉層包裹)3種發(fā)病程度的果實(shí)各5個(gè)，健康新鮮的果實(shí)5個(gè)作為陽(yáng)性對(duì)照。

果柄分別采集了發(fā)病較輕(果柄處未見(jiàn)白色霉層，但已出現(xiàn)紅褐色)、較重(果柄表面有少量稀疏霉層)及嚴(yán)重(整個(gè)果柄已被白色霉層覆蓋)3種發(fā)病程度的樣本各5份，取健康未發(fā)病的果柄5份作為陽(yáng)性對(duì)照。

對(duì)采集的病組織樣本進(jìn)行DNA快速提取，并應(yīng)用優(yōu)化建立的草莓白粉菌LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓白粉病菌LAMP檢測(cè)體系的優(yōu)化

2.1.1 dNTPs終濃度的優(yōu)化 實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線結(jié)果顯示(圖1-A)，隨著dNTPs終濃度的增加，擴(kuò)增開始時(shí)間越早，峰值度越高，說(shuō)明擴(kuò)增后的模板DNA濃度越高。當(dāng)dNTPs終濃度為1.6 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增效率最優(yōu)，dNTPs終濃度為0.8 mmol/L和陰性對(duì)照在1 h內(nèi)均未擴(kuò)增出曲線。

熒光染料顯色結(jié)果表明(圖1-B)，肉眼觀察終濃度為1.0～1.8 mmol/L均呈綠色，其中1.4～1.8 mmol/L的熒光綠色相對(duì)其他顏色較深，而0.8 mmol/L和陰性對(duì)照呈橘色，結(jié)合雙重判定結(jié)果，確定dNTPs最佳終濃度為1.6 mmol/L。

A.實(shí)時(shí)熒光曲線結(jié)果；B.反應(yīng)液熒光顯色結(jié)果(編號(hào)1—6分別為dNTPs終濃度0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mmol/L；N為陰性對(duì)照)。

2.1.2 Mg2+終濃度的優(yōu)化 如圖2所示，Mg2+終濃度為6～12 mmol/L均能擴(kuò)增出典型的S曲線，其中8 mmol/L擴(kuò)增的檢測(cè)時(shí)間最短，效率最高，而Mg2+終濃度為4 mmol/L未出現(xiàn)S曲線，檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性(圖2-A)；熒光顯色結(jié)果表明，Mg2+終濃度為6 mmol/L～12 mmol/L呈熒光綠色，而處理4 mmol/L和陰性對(duì)照呈橘色，綜合判定最佳Mg2+終濃度為8 mmol/L(圖2-B)。

A.實(shí)時(shí)熒光曲線結(jié)果；B.反應(yīng)液熒光顯色結(jié)果(編號(hào)1～5分別為Mg2+終濃度4，6，8，10，12 mmol/L；N為陰性對(duì)照)。

2.1.3 甜菜堿濃度優(yōu)化結(jié)果 實(shí)時(shí)擴(kuò)增結(jié)果顯示(圖3-A)，甜菜堿不同終濃度處理對(duì)擴(kuò)增開始時(shí)間影響不大，終濃度為0～1.2 mmol/L均能擴(kuò)增出明顯的“S”形曲線，而終濃度為1.2 mmol/L縱坐標(biāo)表現(xiàn)出更強(qiáng)的熒光信號(hào)；熒光染料可視結(jié)果表明(圖3-B)，7個(gè)終濃度處理均呈熒光綠色，陰性對(duì)照為橘色，與擴(kuò)增曲線結(jié)果相應(yīng)證，最終確定甜菜堿最佳終濃度為1.2 mmol/L。

2.1.4 BstDNA聚合酶濃度優(yōu)化結(jié)果 實(shí)時(shí)擴(kuò)增結(jié)果顯示(圖4-A)，BstDNA聚合酶終濃度為40～340 U/mL均能擴(kuò)增出明顯的“S”形曲線，并隨著終濃度的增加，擴(kuò)增開始時(shí)間越早，其中終濃度為320 U/mL和340 U/mL出現(xiàn)曲線時(shí)間接近，擴(kuò)增效率相當(dāng)。

熒光染料可視結(jié)果表明(圖4-B)，5個(gè)終濃度處理均呈熒光綠色，陰性對(duì)照為橘色，與擴(kuò)增曲線結(jié)果相一致，最終確定BstDNA聚合酶最優(yōu)終濃度為320 U/mL。

2.1.5 反應(yīng)溫度的優(yōu)化結(jié)果 實(shí)時(shí)擴(kuò)增結(jié)果顯示(圖5-A)，在63，65，67 ℃溫度條件下，均能出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其中65 ℃擴(kuò)增曲線出現(xiàn)的時(shí)間最早，擴(kuò)增效率最高；熒光染料可視結(jié)果表明(圖5-B)，3個(gè)溫度處理后均呈綠色熒光，65 ℃呈現(xiàn)的顏色更深更亮，陰性對(duì)照為橘色，最終確定65 ℃為最優(yōu)反應(yīng)溫度。

A.實(shí)時(shí)熒光曲線結(jié)果；B.反應(yīng)液熒光顯色結(jié)果(編號(hào)1～7分別為甜菜堿終濃度0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mmol/L；N為陰性對(duì)照)。

A.實(shí)時(shí)熒光曲線結(jié)果；B.反應(yīng)液熒光顯色結(jié)果(編號(hào)1～5分別為BstDNA聚合酶終濃度40，80，160，320，340 U/mL；N為陰性對(duì)照)。

2.1.6 優(yōu)化后的LAMP檢測(cè)體系 根據(jù)以上結(jié)果LAMP檢測(cè)優(yōu)化反應(yīng)體系(25 μL)：10×Isothermal Amplification Buffer 2.5 μL、終濃度為8 mmol/L的MgSO41.5 μL、終濃度為1.6 mmol/L的dNTPs 4.0 μL、終濃度為1.2 mmol/L的甜菜堿0.6 μL、終濃度為320 U/mL的BstDNA聚合酶1 μL、DNA模板2.0 μL、鈣黃綠素1.0 μL、終濃度為1.6 μmol/L的FIP和BIP各1 μL，終濃度為0.2 μmol/L的F3和B3各1 μL，終濃度為0.4 μmol/L的LoopF和LoopB各1 μL，無(wú)菌去離子水補(bǔ)足25 μL。LAMP反應(yīng)條件：65 ℃溫育1 h，之后80 ℃下滅活5 min。在LAMP反應(yīng)體系反應(yīng)過(guò)程中，每間隔1 min讀取一次熒光，收集熒光信號(hào)。

A.實(shí)時(shí)熒光曲線.；B.反應(yīng)液熒光顯色結(jié)果(編號(hào)1～3分別為溫度63，65，67 ℃；N為陰性對(duì)照)。

2.2 草莓白粉病菌LAMP特異性檢測(cè)

實(shí)時(shí)擴(kuò)增結(jié)果顯示(圖6-A)，引物組在近30 min時(shí)僅對(duì)草莓白粉病菌呈現(xiàn)出實(shí)時(shí)擴(kuò)增的“S”形曲線，其他病原菌和陰性對(duì)照均未擴(kuò)增出曲線；熒光顯色觀察結(jié)果顯示(圖6-B)，只有草莓白粉病菌DNA為模板的EP管液體呈現(xiàn)綠色熒光，說(shuō)明樣品中檢測(cè)到草莓白粉病菌，其他病原菌和陰性對(duì)照均為橘色，說(shuō)明樣品中沒(méi)有草莓白粉病菌。這說(shuō)明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的LAMP引物組可以將草莓白粉病菌與其他病原菌區(qū)分開來(lái)，具有種的特異性，可用于草莓白粉病菌的檢測(cè)與鑒定。

2.3 草莓白粉病菌檢測(cè)靈敏度測(cè)定

2.3.1 LAMP檢測(cè)靈敏度測(cè)定結(jié)果 LAMP擴(kuò)增靈敏度檢測(cè)結(jié)果表明(圖7)，3.2，3.2×10-1，3.2×10-2，3.2×10-3，3.2×10-4ng/μL質(zhì)量濃度的草莓白粉病菌基因組DNA顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光，實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線呈典型的“S”形，其他濃度及陰性對(duì)照顯色結(jié)果為橙色，且實(shí)時(shí)擴(kuò)增為直線形。說(shuō)明所設(shè)計(jì)的草莓白粉病菌引物組合物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB通過(guò)優(yōu)化后的LAMP擴(kuò)增，對(duì)草莓白粉病菌的檢測(cè)靈敏度可達(dá)3.2×10-4ng/μL。

A.實(shí)時(shí)熒光曲線結(jié)果；B.反應(yīng)液熒光顯色結(jié)果(編號(hào)1為草莓白粉病菌；2～7依次為對(duì)照菌株辣椒白粉病菌、黃瓜白粉病菌、草莓灰霉病菌、草莓根腐病菌、草莓炭疽病菌、草莓蛇眼病菌；N為陰性對(duì)照)。

A.實(shí)時(shí)熒光曲線結(jié)果；B.反應(yīng)液熒光顯色結(jié)果(編號(hào)1～7草莓病原菌粗體DNA濃度依次為3.2，3.2×10-1，3.2×10-2，3.2×10-3，3.2×10-4 ，3.2×10-5，3.2×10-6 ng/μL；N為陰性對(duì)照)。

2.3.2 普通PCR靈敏度測(cè)定 從圖8可以看出，稀釋后的系列濃度3.2×10-6～3.2×10-1ng/μL DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后，可以清楚地判斷出靶標(biāo)目的片段的有無(wú)，其中3.2×10-1，3.2×10-2ng/μL能檢測(cè)到明顯的條帶，而3.2×10-6～3.2×10-3ng/μL檢測(cè)不到條帶，說(shuō)明普通PCR最低檢測(cè)限為3.2×10-2ng/μL。

圖8 草莓白粉病菌普通PCR擴(kuò)增靈敏度的檢測(cè)結(jié)果Fig.8 Detection results of sensitivity of strawberry powdery mildew by using PCR amplification

2.4 草莓白粉病菌LAMP檢測(cè)方法重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

反應(yīng)體系65 ℃溫育60 min后直接觀察反應(yīng)液顏色變化，結(jié)果顯示(圖9)，所有感染白粉病的陽(yáng)性樣本均能被熒光染料染色，呈現(xiàn)明顯的綠色熒光，而所有健康的陰性樣本及陰性對(duì)照樣本均顯現(xiàn)為橙色，表明未被草莓白粉菌感染，此結(jié)果與采集時(shí)預(yù)先了解的發(fā)病情況和健康情況一致，證明上述建立的草莓白粉病LAMP檢測(cè)方法是可靠的，并且有很好的重復(fù)性。

1.葉片(發(fā)病輕)；2.果實(shí)(發(fā)病輕)；3.果柄(發(fā)病較輕)；4.葉片(發(fā)病嚴(yán)重)；5.果實(shí)(發(fā)病嚴(yán)重)；6.果柄(發(fā)病嚴(yán)重)；7.健康果實(shí)。

2.5 利用建立的LAMP可視化檢測(cè)方法對(duì)田間草莓樣品的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)采集的病組織樣本進(jìn)行DNA快速提取，并應(yīng)用優(yōu)化建立的草莓白粉病菌LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明(圖10)，草莓葉片、果實(shí)和果柄不同采樣部位及不同發(fā)病程度的樣本在LAMP體系檢測(cè)60 min內(nèi)均顯現(xiàn)為綠色熒光，說(shuō)明采集的病葉、果實(shí)和果柄均受到不同程度的侵染；對(duì)于發(fā)病不明顯、未表現(xiàn)出白粉霉層典型癥狀的樣本也能準(zhǔn)確檢測(cè)出白粉病菌的存在。如發(fā)病很輕的葉片，僅在葉背面有褪綠病斑，或者發(fā)病輕的草莓果實(shí)，僅有輕微畸形，組織表面沒(méi)有表征白粉病霉層的任何特征，此時(shí)只是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)判斷是草莓白粉病初期，而經(jīng)過(guò)LAMP快速檢測(cè)可以清楚地判斷其已被草莓白粉病菌侵染和危害；健康葉片及陰性對(duì)照熒光染色后為橘色，說(shuō)明健康葉片和陰性對(duì)照未感染草莓白粉病菌，與實(shí)際樣本情況相符合。

1～7為草莓葉片樣本：1.發(fā)病很輕葉片，2，3.發(fā)病較重，4，5.發(fā)病嚴(yán)重，6，7.健康葉片；8～14.草莓果實(shí)樣本：8，9.發(fā)病較輕，10.發(fā)病較重，11，12.發(fā)病嚴(yán)重，13，14.健康果實(shí)；15～21.草莓果柄樣本：15.發(fā)病較輕，16，17.發(fā)病較重，18，19.發(fā)病嚴(yán)重，20，21.健康果柄。

3 結(jié)論與討論

草莓白粉病俗稱白毛病，是草莓生產(chǎn)上發(fā)生普遍的一種病害，尤其是在保護(hù)地草莓栽培中發(fā)生嚴(yán)重。草莓白粉病一旦發(fā)生很難徹底根除，常會(huì)造成草莓產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降[13]。目前，白粉病的診斷主要通過(guò)白色霉層人工檢驗(yàn)，而未見(jiàn)白色霉層之前所表現(xiàn)的一系列癥狀(如葉片背面出現(xiàn)褪綠斑，果柄、花瓣變?yōu)榧t褐色或者果實(shí)略有畸形等)均可能是草莓白粉病菌潛伏侵染的早期癥狀，再加上草莓白粉病專性寄生的特點(diǎn)不能進(jìn)行人工培養(yǎng)鑒定，經(jīng)常導(dǎo)致該病防治滯后，難以達(dá)到理想的防治效果。因此，針對(duì)草莓白粉病菌開發(fā)一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，對(duì)于病害的早期有效識(shí)別和及時(shí)防治至關(guān)重要。

近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)為病原菌檢測(cè)及鑒定提供了新的手段，為病原菌的早期診斷提供了精準(zhǔn)的預(yù)測(cè)和預(yù)報(bào)[14]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)開展了一些草莓病害病原菌的分子檢測(cè)，方法多為普通PCR檢測(cè)，如Rigotti等[15]采用PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)草莓灰霉病菌進(jìn)行了鑒定；王楠[16]開發(fā)的三重PCR 檢測(cè)，可在田間、植株上同時(shí)檢測(cè)草莓灰霉病菌、炭疽病菌和黃萎病菌3種病原菌；劉雅等[17]應(yīng)用建立的RT-PCR 技術(shù)對(duì)上海地區(qū)137份樣本4種病毒進(jìn)行了分析檢測(cè)，但該方法需要的設(shè)備昂貴，更適宜在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)因其恒溫操作而具有現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的條件，同時(shí)也具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，目前，已經(jīng)成為檢測(cè)病原微生物的重要分子工具。而在草莓病害方面運(yùn)用LAMP擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)較少，僅在草莓輕型黃邊病毒病、枯萎病及炭疽病上進(jìn)行了應(yīng)用[18-19]。本研究建立了草莓白粉病菌LAMP可視化快速檢測(cè)體系，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光曲線與熒光顯色肉眼識(shí)別相結(jié)合的方法，對(duì)體系中主要成分進(jìn)行優(yōu)化，其中Mg2+終濃度為8 mmol/L、dNTPs終濃度為1.6 mmol/L，甜菜堿終濃度為1.2 mmol/L，BstDNA聚合酶終濃度為320 U/mL，靶標(biāo)菌DNA最低檢測(cè)濃度為3.2×10-4ng/μL，65 ℃溫育1 h內(nèi)完成檢測(cè)，濃度較高的靶標(biāo)DNA在25 min左右即可完成檢測(cè)。

為了避免假陽(yáng)性的出現(xiàn)，本研究在體系優(yōu)化的過(guò)程中加入鈣黃綠素?zé)晒馊玖?，?yīng)用熒光定量PCR儀的VIC通道，每間隔1 min讀取一次熒光，收集熒光信號(hào)，擴(kuò)增曲線呈“S”形為陽(yáng)性，未收集到擴(kuò)增熒光信號(hào)的，呈直線型為陰性；反應(yīng)結(jié)束后，肉眼觀察反應(yīng)液，呈綠色熒光為陽(yáng)性，顯橙色為陰性，整個(gè)LAMP反應(yīng)過(guò)程中和反應(yīng)結(jié)束后無(wú)需開蓋，減少了在空氣中暴露的時(shí)間，降低了假陽(yáng)性的出現(xiàn)。而前人報(bào)道的LAMP檢測(cè)方法多是反應(yīng)后加入熒光染料顯色，或是反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的驗(yàn)證，這期間避免不了開蓋，而LAMP極強(qiáng)的擴(kuò)增效率，會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室氣溶膠污染出現(xiàn)假陽(yáng)性[20-21]。因此，采用熒光定量PCR儀實(shí)時(shí)曲線監(jiān)測(cè)、結(jié)合LAMP反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液熒光顯色直接觀察雙重判定結(jié)果的方法，對(duì)于草莓白粉病菌LAMP體系最佳成分及條件的篩選更加精準(zhǔn)、穩(wěn)定。

本研究在檢測(cè)過(guò)程中，DNA采用快速提取的方法，DNA的濃度不是很高，但是應(yīng)用建立的LAMP體系仍能檢測(cè)出來(lái)，檢測(cè)的最低限濃度為3.2×10-4ng/μL，與普通PCR相比，LAMP的檢測(cè)效率是普通PCR的100倍。該結(jié)論再次證明，LAMP的檢測(cè)靈敏度較高，明顯高于普通PCR的檢測(cè)效率。陳柳等[18]應(yīng)用優(yōu)化RT-LAMP 方法能快速、特異地檢測(cè)草莓輕型黃邊病毒，比RT-PCR方法檢測(cè)的靈敏度高100倍，這與本研究LAMP靈敏度的檢出效率相一致。此外，筆者在田間新采集的樣本檢測(cè)中初步驗(yàn)證了草莓白粉病菌LAMP可視化的檢測(cè)效果。將樣本進(jìn)行DNA快速提取15 min左右，模板DNA加入建立的草莓白粉病菌LAMP檢測(cè)體系中，保持65 ℃溫育60 min后，通過(guò)體系反應(yīng)液顯色直接判斷靶標(biāo)病原菌的有無(wú)，初步驗(yàn)證了該方法對(duì)于草莓白粉病田間樣本檢測(cè)的高效性。未來(lái)，筆者將進(jìn)一步驗(yàn)證該方法在田間現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的準(zhǔn)確性和高效性，形成輕簡(jiǎn)化的試劑盒，為草莓產(chǎn)區(qū)、相關(guān)企業(yè)、基層推廣部門進(jìn)行草莓白粉病的預(yù)警預(yù)報(bào)提供高效便捷的檢測(cè)手段，為草莓白粉病的科學(xué)防控奠定重要基礎(chǔ)。