棉花WRKY7基因克隆及其對黃萎病抗性分析

曾焱明，胡 廣，賈 培，唐 葉，王炳婷，武 盼，陸承哲，陳愛民，彭清忠，吳家和

(1.吉首大學(xué) 生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000；2.中國科學(xué)院 微生物研究所，植物基因組學(xué)國家重點實驗室，北京 100101；3.九圣禾種業(yè)股份有限公司,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北內(nèi)陸棉花品種創(chuàng)制重點實驗室，新疆 昌吉 831100)

植物在漫長的發(fā)育歷史中，進化出了應(yīng)對一系列生物脅迫和環(huán)境脅迫的機制。例如，通過結(jié)構(gòu)形態(tài)變化防治病害侵入組織結(jié)構(gòu)抗性[1]；植物相關(guān)組織在病原菌入侵時，通過合成植保素來提高植物抗病性的生理生化抗性[2]；植物防御病原菌入侵及其他損傷因子危害時，通過水楊酸(Salicylic acid，SA)、茉莉酸(Jasmonic acid，JA)等植物激素及其介導(dǎo)的信號通路參與防御反應(yīng)的植物激素介導(dǎo)的抗性[3]；通過病原物模式分子引發(fā)的免疫反應(yīng)(PAMP-triggered immunity，PTI)和效應(yīng)分子引發(fā)的免疫反應(yīng) (Effector-triggered immunity，ETI)來抵御病原菌侵害的抗病基因介導(dǎo)的抗性[4]。

轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor，TF)通過與真核基因啟動子區(qū)域的順式作用元件特異結(jié)合，從而激活或抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄。這些轉(zhuǎn)錄因子主要包括WRKY、MYB、NAC、bZIP等。其中WRKY是植物特有的一個轉(zhuǎn)錄因子大家族，通常由1～2個保守WRKY結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，該結(jié)構(gòu)域的N端為WRKYGQK序列，C端為(C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H或C-X7-C-X23-H-X1-C)鋅指結(jié)構(gòu)。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)的特征，可以分為Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類[5-6]。WRKY一般與靶基因啟動子區(qū)的W-box元件序列(T)TGAC(C/T)結(jié)合，進而調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄[7-8]。

植物WRKY在受到病原菌等刺激時能夠快速表達，調(diào)控下游抗病基因的表達，在生物抗病性方面具有十分關(guān)鍵的作用。在擬南芥中，有許多WRKY轉(zhuǎn)錄因子編碼基因都受到病原菌和抗病激素誘導(dǎo)，主要包括AtWRKY3、AtWRKY4、AtWRKY18、AtWRKY22、AtWRKY27、AtWRKY28、AtWRKY29、AtWRKY30、AtWRKY33、AtWRKY38、AtWRKY40、AtWRKY46、AtWRKY48、AtWRKY53、AtWRKY58、AtWRKY62、AtWRKY70等轉(zhuǎn)錄因子編碼基因[8-10]。在水稻中，同樣存在不少WRKY基因響應(yīng)病原菌誘導(dǎo)，如：OsWRKY7、OsWRKY10、OsWRKY11、OsWRKY17、OsWRKY28、OsWRKY30、OsWRKY32、OsWRKY45、OsWRKY62、OsWRKY64、OsWRKY70、OsWRKY76、OsWRKY82等[11-14]。在棉花中也有一些抗病相關(guān)的WRKY報道[15-19]，但是棉花中抗病WRKY蛋白仍有許多沒有進行研究。因此，探究棉花中WRKY轉(zhuǎn)錄因子的抗病性研究有著重要的理論和實際應(yīng)用價值。

黃萎病作為影響棉花產(chǎn)量和質(zhì)量的主要病害，有“棉花癌癥”的俗稱。我國的黃萎病病原菌主要為大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)，是一種土傳性、植物維管束病害。由于大麗輪枝菌具有復(fù)雜、存活時間長、寄生在植物維管束內(nèi)等特征，因此，目前對其防治手段有限，防治效果不理想。培育抗病品種被認(rèn)為是防治黃萎病最適宜的方法，因此，克隆和鑒定抗病基因成為當(dāng)前抗病育種培育的主要手段。本研究從陸地棉(Gossypiumhirsutum)中分離一個抗病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子WRKY編碼基因，命名為GhWRKY7。GhWRKY7蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi)，受到大麗輪枝菌和抗病激素SA和JA的誘導(dǎo)，GhWRKY7在棉花葉和根中表達明顯高于莖稈中；當(dāng)黃萎病菌侵染棉花時，GhWRKY7沉默植株對大麗輪枝菌抗性明顯低于對照，且其棉花抗病標(biāo)記基因PR1、PR3、PR4、PR5、PDF1.2、PAL1和CYP71B36表達顯著下調(diào)。進一步研究揭示GhWRKY7基因能夠轉(zhuǎn)錄激活GhCYP71B36的表達，促進植保素Camalexin的合成。結(jié)果表明，GhWRKY7基因調(diào)控如植保素Camalexin合成等相關(guān)下游基因的表達，提高棉花植株對大麗輪枝菌的抗性。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

陸地棉材料為中棉所35號和本氏煙草(Nicotianabenthamiana)，保存于中國科學(xué)院微生物研究所植物基因組學(xué)國家重點實驗室。

大腸桿菌菌株(Escherichiacoli)DH5α、根癌農(nóng)桿菌菌株(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101、大麗輪枝菌菌株V991都由本實驗室保存。

煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus，TRV)載體：pYL-156(陰性對照載體)、pYL-156-PDS(陽性對照載體)和pYL-192(輔助載體)以及pCAMBIA1302-GFP載體、pBI121-GUS載體均保存于本實驗室。

植物RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和Master qPCR Mix(SYBR Green Ⅰ with UDG)試劑盒均購自北京擎科生物科技有限公司；各種限制性內(nèi)切酶及其相關(guān)Buffer試劑購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；基因片段克隆PCR反應(yīng)所需試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒及PCR切膠回收試劑盒購自O(shè)mega Bio-Tek；DNA連接酶相關(guān)試劑購自南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗病WRKY序列比對分析及進化樹構(gòu)建 根據(jù)文獻報道，從擬南芥基因庫(https：//www.arabidopsis.org/index.jsp)和水稻基因庫(https：//ricedata.cn/gene/)中下載抗病相關(guān)WRKY氨基酸序列。將下載的抗病AtWRKY和抗病OsWRKY與陸地棉植株中克隆的一個抗病基因GhWRKY7(Gh_D05G2499)編碼蛋白進行氨基酸序列比對，使用MAGE 5.2軟件生成系統(tǒng)進化樹，在線iTOL(https://itol.embl.de/)對進化樹進行修飾。

1.2.2 植物材料培育 濃硫酸脫絨后，選取顆粒飽滿、品相相當(dāng)?shù)拿藁ǚN子浸泡于水中，37 ℃過夜。轉(zhuǎn)移種子至濕紙巾內(nèi)，潮濕黑暗室溫環(huán)境下萌發(fā)。待種子根部長至2～3 cm時，選取長勢一致的幼苗，仔細(xì)去殼后種入混合土壤中(蛭石∶營養(yǎng)土=1∶1)，蓋上保鮮膜，培養(yǎng)箱內(nèi)培育(溫度為25 ℃，照明為光照16 h / 黑暗8 h)；待種子根長達到3 cm左右時，選取長勢相當(dāng)?shù)挠酌?，去殼后轉(zhuǎn)到水培盒中，盒內(nèi)加入B5營養(yǎng)液(每7 d換1次)，并附上保鮮膜，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培育，培育條件同土培，待子葉展開后，去掉保鮮膜。每天定時關(guān)注幼苗生長情況，確保植株正常生長以便用于試驗需要。

將煙草種子撒在一個裝有水分充足混合土壤(營養(yǎng)土 ∶蛭石=1∶1)的小花盆中，蓋上保鮮膜放入培養(yǎng)箱中。

1.2.3 棉花RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成 采集樣品植株，立即液氮研磨。按試劑盒說明書操作，提取棉花總RNA并檢測濃度，-80 ℃保存。cDNA合成參照試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，-20 ℃保存以備后續(xù)試驗。

1.2.4 Quantitative Real-time-PCR 選優(yōu)質(zhì)逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，設(shè)計目的基因特異引物(表1)。以棉花UBQ7作為內(nèi)參基因，設(shè)計內(nèi)參基因引物(表1)按照試劑說明書配制反應(yīng)體系，設(shè)置運行程序。重復(fù)3次生物學(xué)試驗，按2-ΔΔCt計算基因的相對表達量。

1.2.5 大麗輪枝菌的活化培育與接菌處理 將保存的大麗輪枝菌液涂布于PDA平板，28 ℃培養(yǎng)2～3 d。從平板上挑取菌絲，轉(zhuǎn)接至察氏培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min，3～4 d。紗布過濾菌絲后，顯微鏡下用血球計數(shù)板統(tǒng)計孢子數(shù)量(Spores)，稀釋孢子液至1.0×106spores/mL。接菌處理：選取正常生長約14 d的水培棉花植株進行統(tǒng)一傷根處理后，將培養(yǎng)液換成大麗輪枝菌孢子液(1.0×106spores/mL)繼續(xù)培養(yǎng)。在0，12，24，36，48 h分別取樣進行GhWRKY7相對表達量分析。參照Zhang等[16]報道，對棉花植株進行接菌處理，重復(fù)3次生物學(xué)試驗，分別在接菌21 d后，觀察統(tǒng)計棉花發(fā)病株數(shù)和發(fā)病程度，并計算發(fā)病率和發(fā)病指數(shù)。

1.2.6 SA和JA激素處理 選取生長14 d左右長勢相當(dāng)?shù)拿藁ㄖ仓辏舛?.1 mol/L的水楊酸和茉莉酸溶液各10 mL，均勻噴灑至棉花真葉表面。在0，1.5，4，7，12，24 h分別取樣，-80 ℃保存。

1.2.7 載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌培養(yǎng) 以BamH Ⅰ和KpnⅠ為目標(biāo)基因片段插入點，選取GhWRKY7基因特異性片段設(shè)計引物(表1)，并在引物前加入酶切位點及保護堿基，克隆回收該片段。對pYL-156載體和回收片段用BamHⅠ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶37 ℃酶切2 h，純化后的片段與線性載體進行連接反應(yīng)，構(gòu)建TRV病毒表達載體pYL-156-GhWRKY7。

pCAMBIA1302-GFP載體以NcoⅠ和SpeⅠ酶切位點與GhWRKY7基因片段連接，構(gòu)建 pCAMBIA1302-GhWRKY7-GFP載體。pBI121-GUS載體以ScaⅠ和BamH Ⅰ雙酶切處理，GhCYP71B36啟動子(GhCYP71B36pro)替換35S啟動子(35Spro)，構(gòu)建報告載體pBI121-GhCYP71B36pro-GUS；以XbaⅠ和ScaⅠ雙酶切處理，GhWRKY7替換GUS，構(gòu)建表達載體pBI121-GhWRKY7。

將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，涂布在含卡那霉素(50 mg/mL)抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑選正常生長的單菌落進行測序鑒定，獲得含GhWRKY7特異性片段的病毒表達載體。用電擊法將構(gòu)建好的質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，涂布在含卡那霉素(50 mg/mL)和利福平(25 mg/mL)抗性的LB固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)1～2 d，挑選陽性克隆進行測序驗證，成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌的菌液-80 ℃保存。

1.2.8 沉默植株培育 從-80 ℃取出構(gòu)建成功的農(nóng)桿菌，接種到含相應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min過夜培養(yǎng)。收集菌體后用MMA(0.01 mol/L MES，0.01 mol/L MgCl2，0.2 mol/L AS)混合液重選菌體，將OD600調(diào)至1.2。將含陽性對照、陰性對照和重組載體的農(nóng)桿菌重懸液分別與輔助載體的農(nóng)桿菌重懸液按1∶1等體積混合，室溫黑暗靜置2～3 h。

選取正常生長至兩子葉完全展開且長勢相當(dāng)?shù)拿藁ㄖ仓?，用無菌注射器針頭在棉花子葉下表皮劃出傷口，注射靜置好的混合菌液，至整片子葉被充分浸潤，注射好的棉花植株黑暗避光生長12 h后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱正常培育。

1.2.9 煙草瞬時表達 重懸菌液后，將OD600調(diào)至0.8，室溫避光靜置2～3 h。選取生長健康的煙草植株，用無菌注射器針頭在無損葉片的下表皮劃出傷口，注射靜置好的菌液，黑暗避光12 h后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱。

1.2.10 亞細(xì)胞定位分析 分別注射含pCAMBIA1302-GhWRKY7-GFP和pCAMBIA1302-GFP載體的農(nóng)桿菌到煙草葉片24 h后，用激光共聚焦顯微鏡Leica SP8觀察熒光結(jié)果。

1.2.11 GUS染色 將注射好的煙草葉片在24 h后剪下，浸泡在90%丙酮中，4 ℃過夜脫色。PBS緩沖液漂洗后，GUS染液避光37 ℃放置1～3 d，觀察葉片染色情況，用70%乙醇漂洗染色成功的葉片，至葉片呈白色，便于觀察試驗結(jié)果并進行比較。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析抗病WRKY蛋白

前期初步報道了8個棉花抗病相關(guān)WRKY蛋白對大麗輪枝菌響應(yīng)情況[15]，擬對GhWRKY7的抗病性進行深入研究。將GhWRKY7蛋白序列與28個擬南芥抗病WRKY蛋白和25個水稻抗病WRKY蛋白進行序列比對，結(jié)果顯示，抗病相關(guān)WRKY在Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類中均存在，GhWRKY7和AtWRKY7均屬于Ⅱ類(圖1)；有趣的是抗病相關(guān)WRKY蛋白在3個類型都存在，表明不同WRKY結(jié)構(gòu)域數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)類型都有可能參與其調(diào)控植物抗病響應(yīng)。

2.2 GhWRKY7-GFP融合蛋白亞細(xì)胞定位

將GhWRKY7基因克隆并插入pCAMBIA1302-GFP植物表達載體(35S∶GFP)，得到pCAMBIA1302-GhWRKY7-GFP載體(35S∶GhWRKY7-GFP)，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌進行煙草葉片瞬時表達分析，結(jié)果如圖2所示，在激光共聚焦顯微鏡Leica SP8下觀察到35S∶GhWRKY7-GFP僅在植物細(xì)胞核呈現(xiàn)明顯的綠色熒光，細(xì)胞內(nèi)其他部分沒有熒光。對照35S∶GFP在煙草葉片細(xì)胞中也呈現(xiàn)正常綠色熒光，在細(xì)胞膜和細(xì)胞核中均有表達，該結(jié)果表明，GhWRKY7蛋白定位于植物細(xì)胞核中。

2.3 GhWRKY7組織特異性表達和接菌誘導(dǎo)表達分析

利用qPCR方法分析GhWRKY7在棉花的根、莖和葉器官中的相對表達量，結(jié)果表明，GhWRKY7雖然在3個組織部位均有表達，但是其在根與葉中的表達水平顯著高于莖(圖3-A)。在對大麗輪枝菌及水楊酸和茉莉酸抗病激素處理后，采集自不同時間點的棉花檢測GhWRKY7表達，結(jié)果表明，GhWRKY7的相對表達量變化較大。從圖3-B可以看出，相對于接菌0 h，GhWRKY7表達量在接菌后24，36，48 h呈現(xiàn)顯著增加。表明GhWRKY7基因表達受大麗輪枝菌誘導(dǎo)響應(yīng)，暗示其參與調(diào)控棉花抗大麗輪枝菌的抗性。在水楊酸處理后，GhWRKY7表達量與0 h相比，在1.5，4，7，12，24 h均上調(diào)，其中在12 h表達量達到最大值(圖3-C)。在茉莉酸處理后，GhWRKY7表達量在1.5 h顯著上升達到最大值(P<0.05)，此后到24 h其表達量雖有回落，但是仍然顯著高于0 h表達量(P<0.05)(圖3-D)。這些結(jié)果表明，GhWRKY7基因表達受水楊酸和茉莉酸抗病激素誘導(dǎo)，暗示其抗病性可能涉及水楊酸和茉莉酸抗病激素信號通路。

Ⅰ類由2個WRKY結(jié)構(gòu)域和C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H鋅指結(jié)構(gòu)構(gòu)成；Ⅱ類由1個WRKY結(jié)構(gòu)域和C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H鋅指結(jié)構(gòu)構(gòu)成；Ⅲ類由1個WRKY結(jié)構(gòu)域和C-X7-C-X23-H-X1-C鋅指結(jié)構(gòu)構(gòu)成。Group Ⅰ consists of two WRKY domains and a C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H zinc finger structure；Group Ⅱ composed of a WRKY domain and a C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H zinc finger structure；Group Ⅲ consists of a WRKY domain and a C-X7-C-X23-H-X1-C zinc finger structure.

A.35S∶GFP表達框示意圖；B.35S∶ GhWRKY7-GFP表達框示意圖；C.35S∶GhWRKY7-GFP和對照組35S∶GFP在激光共聚焦顯微鏡下細(xì)胞內(nèi)分布。A.Schematic diagram of 35S∶GFP expression frame；B.Schematic diagram of 35S∶GhWRKY7-GFP expression frame；C.The distribution of 35S∶GhWRKY7-GFP and control 35S∶GFP under laser confocal microscope.

A.GhWRKY7組織表達分析；B.大麗輪枝菌對GhWRKY7誘導(dǎo)表達分析；C、D.SA和JA對GhWRKY7誘導(dǎo)表達分析。不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖4—6同。A.Tissue expression analysis of GhWRKY7；B.Induced expression analysis of GhWRKY7 by V.dahliae；C，D.Expression analysis of GhWRKY7 induced by SA and JA.The different alphabets stand for significant difference(P<0.05).The same as Fig.4—6.

2.4 GhWRKY7沉默植株對大麗輪枝菌的抗性下降

為了驗證GhWRKY7是否參與調(diào)控棉花對大麗輪枝菌抗性，利用VIGS技術(shù)培育GhWRKY7基因沉默植株進一步分析GhWRKY7基因的抗病功能。利用TRV載體構(gòu)建了GhWRKY7沉默載體(圖4-A)。試驗設(shè)置陽性對照pYL-156-PDS，當(dāng)植株真葉出現(xiàn)明顯白化現(xiàn)象時(圖4-B)，表明TRV沉默系統(tǒng)在棉花中能夠沉默內(nèi)源基因的表達。此時，利用qPCR分析GhWRKY7在沉默植株中的相對表達量，結(jié)果表明，沉默植株中GhWRKY7基因的平均相對表達量下降了50%以上(圖4-C)。

為進一步研究GhWRKY7的抗病功能，對GhWRKY7沉默植株接種大麗輪枝菌，觀察抗病表型，結(jié)果顯示，接菌21 d后，GhWRKY7沉默植株(TRV∶GhWRKY7)葉片發(fā)黃、萎蔫脫落現(xiàn)象等病征明顯高于對照組(TRV∶00，圖5-A)。TRV∶GhWRKY7植株的發(fā)病高達94.44%，而對照組為83.33%；試驗組病情指數(shù)達76.04，對照組為58.33(圖5-B，C)。為進一步確認(rèn)大麗輪枝菌對沉默植株的浸染，將發(fā)病植株和未接菌植株的棉花主莖稈進行切面分析，觀察維管束褐化情況，結(jié)果表明，TRV∶GhWRKY7植株維管束褐化程度明顯高于對照組，而未接菌的棉花莖組織的維管束沒有褐化現(xiàn)象(圖5-D)。發(fā)病植株莖段的病菌恢復(fù)培養(yǎng)結(jié)果顯示，沉默植株的病原菌菌落數(shù)明顯高于對照組(圖5-E)。綜上所述，這些結(jié)果表明，GhWRKY7基因正調(diào)控棉花對大麗輪枝菌的抗性。

2.5 GhWRKY7參與棉花抗病性涉及SA和JA信號通路

通過前面試驗表明，GhWRKY7基因表達響應(yīng)SA和JA激素的誘導(dǎo)(圖3-C、D)。利用qPCR技術(shù)檢測沉默植株接菌21 d后，檢測SA和JA抗病標(biāo)志基因表達水平；3個SA相關(guān)基因GhPR1、GhPR5和GhPAL1表達水平在GhWRKY7基因沉默植株中顯著下降；3個JA相關(guān)基因GhPR3、GhPR4和GhPDF1.2及植保素(Camalexin)合成相關(guān)基因GhCYP71B36表達在沉默植株中也呈顯著下降水平(P<0.05)。結(jié)果表明，GhWRKY7沉默嚴(yán)重降低了7個抗病基因的表達(圖6)，進一步表明了GhWRKY7參與植株抗病性調(diào)控可能涉及SA和JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

2.6 GhWRKY7促進GhCYP71B36轉(zhuǎn)錄表達提高棉花抗病性

細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)編碼基因在植物基因組中比例高達1%，在植物化學(xué)物質(zhì)的生物合成途徑中必不可少，有助于植物應(yīng)對生物脅迫和環(huán)境脅迫時的化學(xué)防御機制[20]，其中CYP71是植物P450中最大的集團。據(jù)文獻[21-22]報道，AtWRKY33能轉(zhuǎn)錄激活A(yù)tCYP71B15(PAD3)的

A.pYL-156-GhWRKY7沉默載體構(gòu)建示意圖，其中包含強啟動子(35Spro)、NOSter終止子序列和用于各種目的基因片段構(gòu)建的多克隆位點(Multiple clone sites，MCS)，GhWRKY7基因特異性片段大小為300 bp；B.陽性植株葉片白化表型；C.陰性對照與沉默植株中GhWRKY7基因相對表達量分析。

A.GhWRKY7沉默植株與對照組發(fā)病表型；B.植株發(fā)病率；C.病情指數(shù)；D.接菌棉花主莖稈切面維管束表型：WT為未接菌正常發(fā)育棉花植株；TRV∶00和TRV∶GhWRKY7為對照和沉默植株接菌21 d后，發(fā)病植株的主莖稈切面表型；E.接菌植株莖段恢復(fù)培養(yǎng)后，大麗輪枝菌生長情況。

表達，從而促進植保素Camalexin的合成，提高植物抗病性。將AtCYP71B15基因序列在棉花基因庫中進行Blast比對，獲得棉花同源基因GhCYP71B36，經(jīng)過前面的分析表明，沉默GhWRKY7植株在接菌狀態(tài)下，降低了GhCYP71B36的表達水平(圖6-C)。因此，本研究利用GUS報告系統(tǒng)來分析棉花WRKY7是否也激活GhCYP71B36表達。首先克隆了GhCYP71B36基因的啟動子，分別構(gòu)建相應(yīng)的激發(fā)載體和報告載體(圖7-A)。如圖7-B所示，僅僅注射含GhCYP71B36pro-GUS重組質(zhì)粒農(nóng)桿菌的煙草葉片部分顯示較淺的GUS藍色，而GhCYP71B36pro-GUS在與GhWRKY7等量共注射的煙草葉片部分，GUS藍色明顯加深，說明GhWRKY7能促進GhCYP71B36轉(zhuǎn)錄，提高植保素Camalexin合成，從而提高棉花的抗病性。

A.GhWRKY7沉默植株與對照組中SA抗病標(biāo)志基因相對表達量；B.JA抗病標(biāo)志基因相對表達量；C.GhCYP71B36相對表達量。GhWRKY7沉默植株與對照組的表達量測定于大麗輪枝菌浸染后21 d。A.Relative expression levels of three SA marker genes in GhWRKY7-silenced plants and control plants; B. Relative expression levels of three JA marker genes；C.Relative expression levels of GhCYP71B36. GhWRKY7-silenced plants and control group infection with V.dahliae at 21 days were sampled.

A.pBI121-GhWRKY7表達載體與pBI121-GhCYP71B36pro-GUS報告載體構(gòu)建示意圖；B.左為煙草瞬時表達的GUS染色結(jié)果，右為煙草葉片各部分注射情況。陽性對照pBI121-GUS菌液。A.Schematic diagram of construction of pBI121-GhWRKY7 expression vector and pBI121-GhCYP71B36pro-GUS reporting vector；B.GUS staining results of transient expression of tobacco on the left，on the right is the injection of each part of tobacco leaf.Positive control pBI121-GUS bacterial solution.

3 結(jié)論與討論

本研究從陸地棉中分離出了植物抗病基因GhWRKY7，通過構(gòu)建TRV病毒載體，獲得棉花GhWRKY7沉默植株并對其接種大麗輪枝菌，21 d后觀察沉默植株與對照發(fā)病情況不同，對其抗病相關(guān)基因進行研究分析，驗證了GhWRKY7基因在棉花中對抗大麗輪枝菌侵染起到正向調(diào)控作用；揭示了GhWRKY7受到SA和JA激素誘導(dǎo)參與棉花抗病；進一步分析GhWRKY7通過促進如GhCYP71B36的轉(zhuǎn)錄激活，提高植保素Camalexin合成，增強植株對黃萎病的抗性。

WRKY作為植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子大家族，參與植物防衛(wèi)反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在植物抗病中起到重要作用。本研究中，當(dāng)GhWRKY7沉默時，SA相關(guān)基因GhPR1、GhPR5和GhPAL1表達水平顯著下降，同時3個JA相關(guān)基因GhPR3、GhPR4和GhPDF1.2也呈顯著下降水平。結(jié)果表明，GhWRKY7沉默嚴(yán)重降低了7個抗病基因的表達；同時，GhWRKY7表達也受到抗病激素SA和JA的誘導(dǎo)；結(jié)果揭示，棉花WRKY7通過調(diào)控抗病激素SA和JA相關(guān)的抗病基因表達，同時又受到SA和JA激素的誘導(dǎo)表達，來影響植株對大麗輪枝菌的抗性。在其他植物中也有類似的報道，如SA誘導(dǎo)提高甘蔗WRKY5的表達，從而調(diào)節(jié)對青枯病鐮刀菌的抗性[23]。在番茄里，SA上調(diào)SlWRKY8的表達，過表達SlWRKY8提高植株對丁香假單胞菌的抗性[24]。Kuki等[25]從小麥分離出4個WRKY轉(zhuǎn)錄因子TaWRKY49、TaWRKY92、TaWRKY112和TaWRKY142，都能誘導(dǎo)SA標(biāo)志基因PR1的過表達，其中TaWRKY142同時誘導(dǎo)JA標(biāo)志基因PDF1.2表達。在擬南芥中，抑制AtWRKY70表達會激活JA途徑中COI1基因表達，AtWRKY70過表達會提高對SA介導(dǎo)的白粉病菌抗性，同時降低對JA介導(dǎo)黑斑病菌的抗性等[26]。由此可見，GhWRKY7和一些報道WRKY轉(zhuǎn)錄因子都是通過參與激活或抑制SA和JA途徑來提高植株對病原菌的抗性。

本研究發(fā)現(xiàn)，沉默GhWRKY7能夠顯著降低植保素合成的關(guān)鍵基因GhCYP71B36的表達。通過該基因的啟動子進行細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄激活分析顯示，GhWRKY7能夠促進GhCYP71B36表達，提高植保素Camalexin合成，從而提高棉花對大麗輪枝菌的抗性。在擬南芥中，WRKY33在磷酸化修飾后能夠轉(zhuǎn)錄激活A(yù)tCYP71B15(PAD3)的表達，促進植保素Camalexin的合成，提高植株的抗病性[21-22]。由此可見，GhWRKY7可能也是通過磷酸化修飾途徑來調(diào)控GhCYP71B36表達，從而促進植保素Camalexin的合成；關(guān)于GhWRKY7磷酸化修飾功能的轉(zhuǎn)變值得進一步研究。

本研究揭示GhWRKY7基因表達受到大麗輪枝菌入侵和抗病激素JA和SA誘導(dǎo)表達；沉默該基因顯著降低了植株的抗病性。GhWRKY7蛋白定位在細(xì)胞核中，能夠激活CYP71B36轉(zhuǎn)錄，促進植保素Camalexin合成，提高植株對大麗輪枝菌的抗性。作為棉花防衛(wèi)途徑中重要的調(diào)控蛋白，GhWRKY7可以作為棉花育種候選基因來培育棉花抗病新品種，保障棉花的安全生產(chǎn)。