擬南芥液泡H+-ATP酶E1亞基基因AtTUF啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)分析

孫海麗，梁 靜，王文佳，丁位華，王妮娜，柳凱恒，李成偉

(1.河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南省糧食作物基因組編輯工程技術(shù)研究中心， 河南 新鄉(xiāng) 453003；3.河南省現(xiàn)代生物育種協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003)

液泡H+-ATP酶(Vacuolar-H+-ATPase，V-ATPase，VHA)是一種高度保守的多亞基旋轉(zhuǎn)酶，廣泛存在于所有真核細(xì)胞中，定位于液泡膜和細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的其他隔間(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、囊泡及內(nèi)體等)中[1-2]，具有ATP水解驅(qū)動(dòng)的質(zhì)子泵功能。VHA傳統(tǒng)上被認(rèn)為是一種“管家”酶，可以建立用于二次活性轉(zhuǎn)運(yùn)的電化學(xué)質(zhì)子梯度，并維持pH值穩(wěn)態(tài)[3]，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成、新陳代謝及應(yīng)激反應(yīng)等過程中起著關(guān)鍵作用[4-5]。該酶由親水的V1和疏水的V0共2個(gè)區(qū)域構(gòu)成，其中，V1位于膜外胞質(zhì)區(qū)，呈球莖狀，由A～H 共8個(gè)亞基組成，主要負(fù)責(zé)ATP的水解；V0整合于膜中，由a、c、c′、c″、d和e共6個(gè)亞基組成，主要負(fù)責(zé)將質(zhì)子從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至液泡，同時(shí)作為V1聚合和裝配的基點(diǎn)[6-7]。

VHA酶E亞基在植物進(jìn)化過程中較為保守[8]，并在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程及響應(yīng)非生物脅迫中均發(fā)揮著重要的作用。Dabbous等[9]發(fā)現(xiàn)，鹽生植物香雪球VHA酶E1亞基基因LmVHA-E1的過表達(dá)可以提高擬南芥對(duì)鹽和滲透脅迫的耐受性。Zhu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，水稻VHA酶E1亞基(OsVHA-E1)主要定位于反面高爾基體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(Trans golgi network，TGN)和液泡中，參與了內(nèi)膜腔內(nèi)pH值穩(wěn)態(tài)以及高爾基體形態(tài)和TGN的維持。Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)，小麥VHA酶E亞基定位于細(xì)胞質(zhì)中，該基因啟動(dòng)子區(qū)含有響應(yīng)非生物脅迫的順式作用元件，且該基因表達(dá)受干旱、脫落酸(Abscisic acid，ABA)、鹽、冷害及H2O2的誘導(dǎo)，將該基因在擬南芥中過表達(dá)后能增強(qiáng)植物對(duì)鹽類和甘露醇的耐受性。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，構(gòu)樹根中VHA酶活性的升高與VHA酶E亞基轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)水平的升高呈正相關(guān)，暗示E亞基在植物對(duì)鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。Zhao等[13]的結(jié)果表明，在擬南芥中過表達(dá)小麥VHA酶E亞基基因能夠在鹽脅迫下促進(jìn)種子萌發(fā)、根系生長(zhǎng)和成年植株生長(zhǎng)。馮露等[14]研究表明，谷子VHA酶E亞基SiVHA-E基因能不同程度響應(yīng)鹽和冷脅迫以及植物激素ABA、水楊酸(Salicylic acid，SA)、茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)等，且過表達(dá)SiVHA-E基因可以顯著提高植物的耐鹽性。擬南芥中有3個(gè)VHA酶E亞基，其中，E2是花粉特異性表達(dá)基因；E3主要在外圍組織中表達(dá)；E1是胚胎發(fā)育的主要亞型[15]，對(duì)胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育必不可少，缺乏E1亞基的胚胎發(fā)育不會(huì)超過球形胚階段且高爾基體異常堆疊[6，16]，該亞基編碼基因AtTUF(又被稱為TUFF、EMB2448、VHA-E1、VHAE1，基因號(hào)AT4G11150)的突變會(huì)導(dǎo)致胚胎死亡[15]，表明AtTUF基因在擬南芥種子發(fā)育過程中具有關(guān)鍵作用。Dettmer等[17]研究表明，擬南芥AtTUF蛋白定位于液泡膜上。雖然關(guān)于擬南芥AtTUF的功能及亞細(xì)胞定位都有了一定的研究，但是關(guān)于AtTUF基因啟動(dòng)子及組織表達(dá)特性的研究目前還未見詳細(xì)報(bào)道。

為了研究AtTUF基因的組織表達(dá)模式及轉(zhuǎn)錄調(diào)控，克隆了擬南芥AtTUF基因的啟動(dòng)子序列并對(duì)其進(jìn)行了順式作用元件預(yù)測(cè)分析，構(gòu)建了AtTUF啟動(dòng)子的GUS融合表達(dá)載體pBI121-pAtTUF，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化篩選得到擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)其進(jìn)行了GUS染色，并對(duì)該基因的組織表達(dá)模式進(jìn)行了分析，旨在為深入分析AtTUF基因的調(diào)控模式及功能提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 哥倫比亞(Columbia)野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)種子，由河南科技學(xué)院植物激素與化控研究室保存。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamHⅠ、高保真酶PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase、MiniBEST Plant RNA Extraction Kit、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)及TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ均購(gòu)自TaKaRa公司；T4DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；GUS染液購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司；(±)ABA、IAA購(gòu)自Sigma公司；MeJA購(gòu)自索萊寶公司；聚乙二醇(PEG 8000)購(gòu)自Amresco公司。

1.1.3 載體與菌株 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α及農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101均購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；表達(dá)載體pBI121由周口師范學(xué)院徐克東老師饋贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 擬南芥的種植與培養(yǎng) 將種子用0.5% NaClO消毒10 min，無菌水漂洗5次，播種于MS培養(yǎng)基，4 ℃放置3 d，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：21 ℃，光照強(qiáng)度為80 μmol/(m2· s)，晝夜光周期為16 h光照/8 h黑暗。培養(yǎng)10～14 d移入土中放于溫室培養(yǎng)，溫室培養(yǎng)條件：20～22 ℃，光照強(qiáng)度為120 μmol/(m2·s)，晝夜光照周期為16 h光照/8 h黑暗，每周澆水1～2次。

1.2.2 擬南芥基因組DNA的提取 采用SDS法從擬南芥葉片中提取基因組DNA。

1.2.3AtTUF基因啟動(dòng)子的克隆 在TAIR網(wǎng)上下載AtTUF基因翻譯起始密碼子ATG上游2 000 bp的 5′端側(cè)翼序列作為參考。根據(jù)啟動(dòng)子序列利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)特異性引物，在上下游引物的5′端分別加上Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)及酶切位點(diǎn)前15個(gè)堿基的目的載體序列，以便于后續(xù)采用無縫克隆的方法將AtTUF啟動(dòng)子構(gòu)建于表達(dá)載體pBI121上。上游引物AtTUFpro-F序列：5′-GAC

CATGATTACGCCAAGCTTGGTAATGATGAGCCTTC

TTC-3′，下游引物AtTUFpro-R序列：5′-GGACTGAC

CACCCGGGGATCCTTTTACCGGGAAAATCGGCGGT

C-3′(下劃線標(biāo)注的為載體序列和酶切位點(diǎn)，引物由武漢金開瑞生物公司合成)。PCR反應(yīng)體系：5×GXL Buffer 5 μL，GXL酶 0.5 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL，擬南芥DNA 2 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，ddH2O 14.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：98 ℃ 10 s；60 ℃ 15 s，68 ℃ 2 min 10 s，30個(gè)循環(huán)。

1.2.4AtTUF基因啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收與預(yù)期分子質(zhì)量大小一致的目標(biāo)條帶，用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切pBI121質(zhì)粒并回收載體片段，然后用重組酶連接pBI121載體片段與AtTUF啟動(dòng)子片段，參照ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit說明書配制反應(yīng)體系，37 ℃孵育30 min后迅速置于冰上5 min；將重組產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，37 ℃培養(yǎng)過夜；通過菌落PCR和小量酶切鑒定出陽(yáng)性克隆，并送至武漢金開瑞生物公司測(cè)序；將測(cè)序結(jié)果與AtTUF基因組序列比對(duì)，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pBI121-pAtTUF。

1.2.5AtTUF基因的啟動(dòng)子序列分析 利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù) (http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和PLACE(http：//www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/)對(duì)克隆的AtTUF啟動(dòng)子序列的順式作用元件進(jìn)行在線預(yù)測(cè)分析。

1.2.6 表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 利用熱激法將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，將轉(zhuǎn)化液涂布于含50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL利福平的YEB固體平板上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，通過農(nóng)桿菌菌落PCR鑒定陽(yáng)性菌落。

1.2.7 擬南芥植株的遺傳轉(zhuǎn)化與陽(yáng)性苗篩選 采用花芽浸蘸法[18]轉(zhuǎn)化哥倫比亞野生型擬南芥。將轉(zhuǎn)基因的擬南芥植株培養(yǎng)至成熟，收取T0種子，將種子消毒后點(diǎn)播在含有50 μg/mL卡那霉素、40 μg/mL羧芐青霉素的MS平板上，春化3 d后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)10～14 d，挑選平皿上能長(zhǎng)出真葉與根且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的T1陽(yáng)性幼苗移栽培養(yǎng)，提取葉片基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定。收取T1陽(yáng)性株系種子播于含有卡那霉素的MS平板上，篩選單拷貝插入的T2幼苗，直至篩選出T3純合株系，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.8AtTUF基因啟動(dòng)子的表達(dá)模式分析 取培養(yǎng)7～14 d的T3植株幼苗，成苗植株的蓮座葉及側(cè)枝、莖生葉、莖、花序，不同時(shí)期的果莢及T3純合體種子萌發(fā)后的幼苗，浸入GUS染色液中，37 ℃避光染色；用70%乙醇脫色1 h，95%乙醇脫色(每隔2 h更換染液一次)至綠色褪去，用40%，20%，10%，5%乙醇各處理5 min，再用25%，50%甘油各處理15 min，用50%甘油壓片，于T視顯微鏡(AXIO Zoom.V16，Zeiss)下拍照。

1.2.9 激素與脅迫處理下AtTUF基因啟動(dòng)子的表達(dá)分析 選取pBI121-pAtTUF轉(zhuǎn)基因純合株系種子，消毒后播種于含有卡那霉素的MS平板上，春化3 d、光照培養(yǎng)9 d后，取6株長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗分別轉(zhuǎn)移至含有10 μmol/L(±)ABA、10 μmol/L IAA、50 μmol/L MeJA、200 mmol/L NaCl的MS平板上，光照或黑暗(用錫箔紙遮蓋)培養(yǎng)3 d后進(jìn)行GUS染色；參考Verslues等[19]的方法進(jìn)行PEG模擬干旱脅迫處理，將20% PEG 8000倒于無菌凝固的MS平板上，覆蓋平衡24 h后棄去PEG溶液，吹干后即為含有PEG的MS平板，取光照培養(yǎng)10 d的幼苗轉(zhuǎn)移至含PEG的MS平板上，光照培養(yǎng)2 d后染色。37 ℃染色1 h后脫色，拍照。

1.2.10AtTUF基因在不同組織中的表達(dá)檢測(cè) 取盛花期野生型植株的根、主莖、蓮座葉、花，發(fā)育期角果及成熟期的干種子，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，檢測(cè)AtTUF在不同組織中的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR以ACTIN基因?yàn)閮?nèi)參，引物序列為ACTIN-F： 5-′GGTAACATTGTGCTCA

GTGGTGG-3′，ACTIN-R：5′-AACGACCTTAATCTTCATGC

TGC-3′；AtTUF-F：5′-GCTGGTAAAGCAAAGGT-3′，AtTUF-R：5′-AATGCCACATCAAGACG-3′。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算AtTUF基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 AtTUF啟動(dòng)子的克隆

以野生型擬南芥基因組DNA為模板，利用引物對(duì)AtTUFpro-F/pro-R擴(kuò)增AtTUF的啟動(dòng)子片段，結(jié)果如圖1所示，條帶大小與預(yù)期目的基因條帶大小(2 000 bp)相符。將該條帶回收并純化，測(cè)序比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增片段與NCBI網(wǎng)站上提供的AtTUF基因ATG上游2 000 bp的啟動(dòng)子序列一致，表明已成功克隆AtTUF的啟動(dòng)子pAtTUF。

1.AtTUF啟動(dòng)子擴(kuò)增結(jié)果；M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)。1.PCR products of AtTUF promoter；M.Marker.

2.2 pBI121-pAtTUF表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pBI121質(zhì)粒，結(jié)果如圖2-A所示，將pBI121質(zhì)粒上的啟動(dòng)子片段切下，回收大片段。用無縫連接酶連接載體與pAtTUF片段，轉(zhuǎn)化DH5α，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果顯示，1～5號(hào)均擴(kuò)出了與預(yù)期大小相符的條帶(圖2-B)。挑取4號(hào)菌斑搖菌提取質(zhì)粒，并用Hind Ⅲ和BamHⅠ進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果切出了一條約為2 000 bp的片段(圖2-C)，與預(yù)期大小相符。將該重組質(zhì)粒送公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與目的序列一致，表明表達(dá)載體pBI121-pAtTUF構(gòu)建成功。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，并通過菌落PCR驗(yàn)證，挑取陽(yáng)性菌斑搖菌備用。

A.pBI121的酶切結(jié)果：1.Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切pBI121的結(jié)果；M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)。B.pBI121-pAtTUF重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌落PCR鑒定：1—5.單菌落；M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)；6.陽(yáng)性對(duì)照(AtTUF啟動(dòng)子PCR回收產(chǎn)物)；7.陰性對(duì)照。C.pBI121-pAtTUF重組質(zhì)粒的酶切鑒定：1.Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切pBI121-pAtTUF的結(jié)果；M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 AtTUF啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用PlantCARE和PLACE網(wǎng)站對(duì)AtTUF基因翻譯起始密碼子ATG上游2 kb的側(cè)翼序列進(jìn)行順式作用元件分析(圖3和表1)，結(jié)果表明，AtTUF啟動(dòng)子中除了含有真核生物啟動(dòng)子的基本元件CAAT-box和TATA-box外，還包含ABA響應(yīng)元件ABRE、參與MeJA響應(yīng)的順式作用元件CGTCA-motif、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件TGA-element和AuxRR-core、參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn) MBS、厭氧誘導(dǎo)必需的順式作用元件ARE、胚乳表達(dá)所需的順式作用元件GCN4-motif、分生組織表達(dá)相關(guān)順式作用調(diào)節(jié)元件CAT box及參與玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)的順式作用調(diào)節(jié)元件O2-site，同時(shí)，還包括光響應(yīng)元件G-Box、G-box、Box Ⅱ、Ⅰ-box、TCT-motif、Box 4及AE-box。上述結(jié)果表明，AtTUF基因的表達(dá)可能受部分激素、逆境脅迫及光信號(hào)的調(diào)控。

圖3 擬南芥AtTUF 啟動(dòng)子核心順式作用元件位點(diǎn)分析Fig.3 The sites analysis of key cis-acting elements in AtTUF promoter in Arabidopsis

表1 擬南芥AtTUF啟動(dòng)子的主要順式作用元件Tab.1 Key cis-acting elements in AtTUF promoter in Arabidopsis

2.4 擬南芥轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系的篩選

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花芽浸蘸法，用含pBI121-pAtTUF的農(nóng)桿菌菌液對(duì)野生型擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，待轉(zhuǎn)基因擬南芥植株種子成熟后，收獲種子并將其播于含有卡那霉素的MS培養(yǎng)基上篩選T1陽(yáng)性苗，結(jié)果如圖4-A所示，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株在含有卡那霉素的MS培養(yǎng)基上可以長(zhǎng)出真葉及較長(zhǎng)根系，而非轉(zhuǎn)基因幼苗只能長(zhǎng)出子葉且葉片黃化、根系不能伸長(zhǎng)。將陽(yáng)性植株移栽，提取基因組DNA并進(jìn)行PCR鑒定，由鑒定結(jié)果可知(圖4-B)，被檢測(cè)的T1轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中均擴(kuò)增出了801 bp的GUS標(biāo)簽，而野生型植株中擴(kuò)增不到目的條帶，表明所檢測(cè)的植株均為陽(yáng)性植株。成熟后收獲T1植株種子，用卡那霉素篩選轉(zhuǎn)pBI121-pAtTUF的T2株系，挑選單拷貝插入(抗與不抗比例為3∶1)的株系繁種，并用卡那抗性篩選T3純合株系。

2.5 AtTUF基因啟動(dòng)子組織表達(dá)模式分析

為了觀察AtTUF基因啟動(dòng)子在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中的組織表達(dá)模式，分別選取培養(yǎng)基上萌發(fā)7～14 d 的T3轉(zhuǎn)基因純合幼苗整株及盆栽6周植株的葉、莖、花、果莢及種子等進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示，在幼苗期，AtTUF基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS主要在子葉、真葉及根(圖5-A～D)中表達(dá)，在表皮毛(圖5-D)中也有較高表達(dá)，在胚軸中不表達(dá)；在成苗期，AtTUF基因驅(qū)動(dòng)的GUS在蓮座葉(圖5-E)，表皮毛(圖5-F～G)，成熟的柱頭、花絲、花藥、花粉粒(圖5-H、J)，萼片(圖5-I)，幼嫩角果(圖5-L)中表達(dá)量均較高，在主莖(圖5-F)、花瓣(圖5-H、J)、發(fā)育期角果和種子(圖5-M～O)中有一定表達(dá)，在莖生葉及莖生葉側(cè)枝中(主要集中在表皮毛中表達(dá))表達(dá)較弱(圖5-F、G)，在蓮座葉側(cè)枝的莖(圖5-K)、成熟期角果(圖5-P)及種子(圖5-P、Q)中未檢測(cè)到表達(dá)；在剛萌發(fā)幼苗的葉和胚軸中強(qiáng)烈表達(dá)，在根毛中有一定表達(dá)，在根尖區(qū)域表達(dá)較弱(圖5-R、S)。

1.表達(dá)載體pBI121-pAtTUF質(zhì)粒(正對(duì)照)；2—9.轉(zhuǎn)基因擬南芥植株；10.野生型擬南芥(負(fù)對(duì)照)；M.DNA標(biāo)準(zhǔn)。1.The plasmid of expression vector pBI121-pAtTUF (Positive control)；2—9.Transgenic Arabidopsis；10.Wild type Arabidopsis(Negative control)；M.Marker.

A～Q.T3純合體幼苗及成苗植株組織；R～S.T3種子萌發(fā)后。A.子葉期；B.四葉期；C.六葉期；D.七葉期；E.蓮座葉；F.主莖、莖生葉與莖生葉側(cè)枝；G.莖生葉側(cè)枝頂部葉片及花序(F紅色方框中放大圖)；H.主莖花序；I.萼片；J.單朵花；K.蓮座葉側(cè)枝；L.幼嫩角果；M.不同發(fā)育時(shí)期的角果及種子；N.果皮、假隔膜及未成熟種子；O.發(fā)育期種子(N紅色圓圈中放大圖)；P.成熟期角果；Q.成熟期種子；R.光照培養(yǎng)48 h的幼苗；S.光照培養(yǎng)60 h的幼苗。

2.6 AtTUF基因啟動(dòng)子在激素與逆境脅迫處理下的表達(dá)模式分析

為了驗(yàn)證AtTUF基因啟動(dòng)子是否能夠響應(yīng)植物激素及非生物脅迫信號(hào)，取pBI121-pAtTUF轉(zhuǎn)基因T3純合幼苗分別進(jìn)行ABA、IAA、MeJA、NaCl、暗處理及PEG脅迫處理，并進(jìn)行GUS化學(xué)染色，結(jié)果如圖6所示。除MeJA處理組中幼苗染色與對(duì)照(T3純合幼苗正常培養(yǎng))相比變化不明顯外，其他處理均使幼苗染色明顯變淡，表明ABA、IAA、鹽、暗處理及干旱脅迫均可抑制GUS基因的表達(dá)，暗示AtTUF基因啟動(dòng)子對(duì)植物激素ABA與IAA及鹽、光、干旱等信號(hào)均有廣泛的響應(yīng)能力。Hanitzsch等[1]研究發(fā)現(xiàn)，AtTUF基因表達(dá)受干旱脅迫的顯著抑制，這與本研究結(jié)果一致。

2.7 AtTUF基因表達(dá)特性分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)盛花期(移苗后28 d左右)擬南芥的根、莖、蓮座葉、盛開的花，發(fā)育期的角果及剛成熟的干種子中AtTUF基因的表達(dá)量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖7所示，該基因在發(fā)育期角果中的表達(dá)量最高，在花和干種子中次之，在葉中有一定表達(dá)，在根中的表達(dá)量最低。

3 結(jié)論與討論

啟動(dòng)子是指基因編碼區(qū)上游的非編碼DNA區(qū)域，包含轉(zhuǎn)錄因子可以識(shí)別的特定序列，在植物基因表達(dá)和調(diào)控過程中起著重要作用[20-24]。對(duì)AtTUF啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，其啟動(dòng)子區(qū)存在一些重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，包含光反應(yīng)元件MRE、G-box、Box Ⅱ、Ⅰ-box等，還包含與干旱誘導(dǎo)有關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS，參與生長(zhǎng)素反應(yīng)的順式作用元件TGA-element及AuxRR-core，ABA響應(yīng)順式作用元件ABRE和參與MeJA反應(yīng)的順式作用調(diào)控元件等。其中，Ⅰ-box 和G-box可能是光合組織表達(dá)所必需的[20]，MBS和G-box是可將乙烯或脫落酸和脅迫整合到光周期反應(yīng)的協(xié)調(diào)基序[25]。MYB元件和MYC元件對(duì)干旱和鹽脅迫均具有響應(yīng)作用。ABRE元件一般被認(rèn)為是參與ABA信號(hào)相關(guān)的順式作用元件，存在于許多抗逆基因的啟動(dòng)子區(qū)域[26]，擬南芥中AtbZIP1基因可以與ABRE元件結(jié)合參與ABA依賴的信號(hào)傳導(dǎo)通路[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，AtTUF的啟動(dòng)子活性受ABA、IAA、暗處理、鹽脅迫及PEG脅迫的抑制，這可能因?yàn)槠鋯?dòng)子區(qū)含有多種響應(yīng)光、激素及非生物脅迫的元件所致，但AtTUF的啟動(dòng)子活性不受MeJA的影響，這與Dettmer等[17]的研究結(jié)果相符。而Hanitzsch等[1]通過半定量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AtTUF基因表達(dá)受鹽脅迫的輕微誘導(dǎo)，大約被上調(diào)10%，關(guān)于AtTUF基因表達(dá)是受鹽脅迫誘導(dǎo)還是抑制，尚有待通過實(shí)時(shí)定量試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

不同小寫字母表示AtTUF基因在不同組織中的表達(dá)量差異顯著(P<0.05)。The different lowercase letters indicate significant differences in the expression of AtTUF gene in different tissues at 0.05 level.

本研究構(gòu)建了pBI121-pAtTUF的融合表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化了擬南芥，對(duì)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的GUS染色表明，AtTUF啟動(dòng)子在葉片(葉肉細(xì)胞及表皮毛)與幼嫩果莢中的表達(dá)量較高，在生殖系統(tǒng)(萼片、成熟花藥、花粉粒、柱頭)及發(fā)育早期的種子中也有較高的表達(dá)，在根和葉柄中也有一定的表達(dá)，這與Hanitzsch等[1]的研究結(jié)果一致，與擬南芥eFP網(wǎng)上預(yù)測(cè)的AtTUF基因表達(dá)模式基本一致。但是成熟的角果及其種子并未被染色，而定量結(jié)果卻顯示，AtTUF基因在剛成熟的干種子中也有一定表達(dá)，這可能是由于成熟角果及種子被干燥的果皮及種皮包裹而導(dǎo)致不易被染色。

研究表明，AtTUF基因?qū)τ谥参锏呐咛グl(fā)育至關(guān)重要[15，17]，但目前關(guān)于AtTUF基因的抗逆性及其調(diào)控機(jī)制的研究并不多。由于AtTUF啟動(dòng)子區(qū)含有部分激素響應(yīng)調(diào)控元件與脅迫相關(guān)反應(yīng)元件，本研究對(duì)pBI121-pAtTUF轉(zhuǎn)基因擬南芥T3純合體幼苗進(jìn)行ABA、IAA、MeJA、鹽、暗處理及PEG脅迫處理后初步發(fā)現(xiàn)，AtTUF啟動(dòng)子活性受ABA、IAA、暗處理、鹽及PEG的抑制，表明AtTUF可能參與了對(duì)ABA與IAA信號(hào)及鹽、暗、干旱等非生物脅迫信號(hào)的響應(yīng)，這仍需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。在今后的研究中，還需對(duì)逆境脅迫處理后的AtTUF基因表達(dá)變化進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析。

本研究克隆了擬南芥VHA酶E1亞基基因AtTUF的啟動(dòng)子序列，分析了其順式作用元件，構(gòu)建了由其驅(qū)動(dòng)GUS的植物表達(dá)載體，進(jìn)行了擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化，通過GUS染色及熒光定量PCR分析了該基因及其啟動(dòng)子的組織表達(dá)模式。結(jié)果表明，AtTUF基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS在擬南芥幼苗期的葉片與根中、成苗期的葉片、萼片，成熟的柱頭、花藥、花粉粒及幼嫩角果中均有表達(dá)；且AtTUF啟動(dòng)子區(qū)含有ABA、IAA等激素響應(yīng)調(diào)控元件及干旱、厭氧等逆境脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件，暗示該基因可能參與了逆境信號(hào)響應(yīng)。本研究結(jié)果有助于深入研究AtTUF基因在逆境脅迫中的功能及其表達(dá)調(diào)控規(guī)律。