馬鈴薯野生種SpSBP1基因的克隆及CRISPR/Cas9載體構(gòu)建

陳 娜，邵 勤，李曉鵬，高 陽，盧其能

(宜春學(xué)院 生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000)

馬鈴薯為茄科茄屬作物，當(dāng)前仍然是我國甚至是世界上重要的塊莖類糧食作物之一。長期以來都是以馬鈴薯栽培種四倍體為主要生產(chǎn)及研究對象，這樣就使得馬鈴薯的產(chǎn)業(yè)面臨著2個重要的結(jié)構(gòu)性障礙。第1個就是其四倍體的遺傳規(guī)律非常復(fù)雜，在非常高度雜合的四倍體馬鈴薯之中則隱藏著非常多的有害基因，而有利基因則都是分散在各個不同的染色體之中，要把這些有利性狀同時集中到一個品種中僅僅依靠傳統(tǒng)的育種技術(shù)是非常困難的，這就容易導(dǎo)致馬鈴薯的育種周期延長，使得其品種更新非常緩慢，通常情況下要育成一個比較好的品種需要歷時十幾年[1]；第2個就是馬鈴薯的繁殖通常是以薯塊進(jìn)行無性繁殖，這種方式存在著儲存運輸成本偏高、繁殖系數(shù)偏低以及容易攜帶各種病蟲害等問題。為了徹底打破產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的障礙，越來越多的科學(xué)家呼吁用二倍體馬鈴薯進(jìn)行實生種子育種[2]。目前，在自然界中有70%的馬鈴薯種質(zhì)是二倍體，這種豐富的遺傳變異能夠為馬鈴薯實生種的育種實施提供一定的基礎(chǔ)。而二倍體馬鈴薯則普遍存在著一種現(xiàn)象——自交不親和(Self-incompatibility，SI)，正是這種現(xiàn)象導(dǎo)致其自交系品種的創(chuàng)制受到限制[1]。

在被子植物中普遍存在著自交不親和現(xiàn)象，這種現(xiàn)象主要是用于防止植物進(jìn)行自交受精從而促進(jìn)雜交的一種機(jī)制[3]，植物自交不親和性根據(jù)其遺傳機(jī)制不同主要可以分為兩大類：第一類是配子體型自交不親和型(Gametophytic self-incompatibility，GSI)；第二類是孢子體型自交不親和型(Sporophytic self-inconmpatibility，SSI)[4]。截至目前，國內(nèi)外都圍繞植物的自交不親和性方面做了大量的研究，這些研究結(jié)果都證實：植物自交不親和反應(yīng)是一個極其復(fù)雜的過程[5]。薔薇科(Rosaceae)、車前科(Plantaginaceae)、茄科(Solanaceae)均屬于配子體型自交不親和型[6]。在該體系中，其高度特異性的S-位點存在2個相對獨立的基因：S-locus F-Box(SLF)和S-核糖核酸酶基因(S-RNase)，其中，SLF基因決定了雄蕊的特異性，相反S-RNase基因決定了雌蕊的特異性[7]。研究表明，當(dāng)植物的花粉粒落在柱頭上開始萌發(fā)時，延伸的花粉管頂端的細(xì)胞就會通過胞吞作用吸入在花柱中高量表達(dá)的S-RNase[8-9]，接著S-RNase與SLF就會發(fā)生互作，如果是具有相同S單倍型的相互雜交或者為自交，經(jīng)過胞吞作用進(jìn)入到花粉管中的S-RNase就會降解其中的rRNA，這樣就會使得花粉管在延伸到柱頭大概1/3的位置時其延伸將會停止，緊隨其后花粉粒就會出現(xiàn)死亡[10]；但如果是雜交，那么S-RNase蛋白就會被加以泛素化，然后經(jīng)過26S蛋白酶體會將其降解，因此，花粉管能夠進(jìn)行正常的延伸，可以一直延伸到子房，最后能夠完成正常的受精過程。大量的研究都已證實，在矮牽牛和蘋果中的S-RNase是維持其自交不親和的關(guān)鍵因素[11]。由于馬鈴薯和番茄均屬茄科類作物，因此，二者在親緣關(guān)系上十分接近，加之二者在基因組上也同樣具有高度的共線性[12]。野生番茄和栽培番茄二者的倍性都是二倍體，雖然大部分的野生番茄都存在自交不親和現(xiàn)象，而栽培番茄卻均為自交親和。據(jù)研究證實，主要是由于栽培番茄的S-RNase發(fā)生了突變，S-RNase的突變造成其功能缺失，使得其核酸酶活性也隨之喪失，核酸酶活性的喪失使得其不能排斥自身的花粉，因此，最終導(dǎo)致了自交親和現(xiàn)象的發(fā)生[13]。基于以上結(jié)果，可以利用基因組編輯技術(shù)定點編輯S-RNase基因，從而破壞其功能，最終達(dá)到植物自交親和的目的。據(jù)報道，在新疆杏品種中鑒定出27個自交不親和雌蕊的S基因型，為杏品種商業(yè)化栽培配置適宜授粉樹提供了理論依據(jù)[14]。研究證實，在枸杞屬植物中存在著S-RNase的等位基因，該基因序列和茄科植物的基因序列具有一定的相似性，研究表明，枸杞S-RNase是控制其自交不親和性的關(guān)鍵基因[15]。通過對來自3種不同的二倍體馬鈴薯的S-RNase序列進(jìn)行試驗，進(jìn)一步從S-RNase序列數(shù)據(jù)中確定了S-基因型[16]。利用基因組編輯技術(shù)敲除自交不親和基因S-RNase，從而克服了馬鈴薯自交不親和難題[1]。通過運用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，采用生物信息學(xué)方法從烏頭屬鐵棒錘中鑒定出2個在雌蕊中特異或高表達(dá)的花柱S基因(ApSRNase)和2個在雄蕊中特異表達(dá)的花粉S基因(ApSLF)，并分析了其序列特征及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，以期為進(jìn)一步鐵棒錘的自交不親和性的分子機(jī)制研究提供理論依據(jù)[17]。據(jù)報道，馬鈴薯基因(S-locus inhibitor(Sli))能夠編碼一種F-box蛋白，該蛋白在自交親和性植株的花粉中能夠特異性表達(dá)。在該基因的啟動子中插入533 bp的片段得到功能獲得性突變體，從而能夠克服自交花粉排斥的不親和性，揭示了Sli基因的新功能化引發(fā)馬鈴薯的自交親和性并促進(jìn)馬鈴薯精準(zhǔn)育種[18]。同時當(dāng)一種自交親和(SC)二倍體馬鈴薯RH89-039-16(RH)與自交不親和系雜交時，它可以有效地誘導(dǎo)植株從自交不親和性到自交親和性的交配轉(zhuǎn)變。進(jìn)一步在RH中鑒定發(fā)現(xiàn)，Sli基因能夠與雌蕊特異性S-RNases的多個等位基因變體互作。此外，Sli基因的功能類似于一般的S-RNase抑制劑，能夠?qū)C賦予RH和其他自交不親和的馬鈴薯。Sli的發(fā)現(xiàn)打破了二倍體馬鈴薯的自交不親和性，為二倍體雜交育種計劃提供了一條新的有效途徑[19]。

據(jù)報道，植物配子體自交不親和性除了SLF和S-RNase基因外，還存在其他的位于S位點外的新的基因[20-21]，SBP1基因(S-RNase-binding protein 1)，其蛋白序列含有典型的RING(Really Interesting New Gene)保守結(jié)構(gòu)域，它最早是從矮牽?；ǚ鄣腸DNA文庫中篩選出的[20]，起著SSK1(Skp1-like)和 Rbx1 的作用，并且能夠形成一個 SCFSLF/SFB的復(fù)合體，從而用于非自身的S-RNase泛素化的進(jìn)程進(jìn)而調(diào)控配子體植物自交不親和性反應(yīng)的進(jìn)程[22-23]。O′Brien等[24]和Lee等[25]已分別在茄科植物馬鈴薯和煙草中鑒定到SBP1同源基因。Minamikawa等[26]在薔薇科植物中首次發(fā)現(xiàn)了蘋果花粉表達(dá)的SBP同源基因MdSBP1，隨后Zeng等[27]在新疆野扁桃中發(fā)現(xiàn)SBP1的新型SCFSFB復(fù)合物。Yuan等[28]通過研究得出蘋果MdSBP1可能是唯一負(fù)責(zé)識別S-RNase的因子，并且需要包含MdSSK1的SCF復(fù)合體來介導(dǎo)S-RNase的泛素化。以上研究表明，SBP1可能作為泛素連接酶行使著對S-核酸酶標(biāo)記多聚泛素鏈的功能。

本研究利用二倍體馬鈴薯野生種(Solanumpinnatisectum)為材料克隆得到自交不親和基因SpSBP1(登錄號：MZ803088)，使用多種生物信息學(xué)軟件及在線程序?qū)寺〉降幕蜻M(jìn)行序列分析，以及構(gòu)建CRISPR/Cas9載體，以期為今后進(jìn)一步研究馬鈴薯自交不親和分子機(jī)制提供理論依據(jù)，并為建立二倍體馬鈴薯雜交育種平臺提供起始育種材料及理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試植物材料為二倍體馬鈴薯野生種，由江西省作物生長和發(fā)育調(diào)控重點實驗室提供。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)載體pKSE401為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所崔霞教授惠贈[29-30]。

pMDTM19-T克隆載體購自寶生物工程(大連)有限公司。大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細(xì)胞DH5α和農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105均購自廣州圍谷潤儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 馬鈴薯野生種SBP1基因的克隆 根據(jù)馬鈴薯RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選到4個與自交不親和相關(guān)的基因，其中一個SBP1表達(dá)差異較顯著，因此，運用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，使用引物SpSBP1-F/R擴(kuò)增SpSBP1基因(表1)。PCR擴(kuò)增程序為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度55 ℃ 30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，30個循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，并用膠回收試劑盒(Genstar，北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，最后將回收產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，用通用引物pMD19-F/R檢測，挑取陽性單克隆菌落搖菌，將搖好的菌液寄送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，根據(jù)測序結(jié)果確定基因的最終序列。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.2 馬鈴薯野生種SpSBP1基因的生物信息學(xué)分析 將測序結(jié)果正確的SpSBP1基因序列通過NCBI-ORF在線程序確定該基因的最大開放閱讀框，同時將該基因的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列；運用 NCBI-PROGRAM在線程序?qū)υ摶蚓幋a的蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；運用ClustalW2在線工具進(jìn)行同源性比對；運用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；運用ProtParam在線程序預(yù)測SpSBP1基因編碼的蛋白的理化性質(zhì)；運用 SOPMA在線程序預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)；運用SignalP 5.0在線程序和TMHMM Server v.2.0在線程序分別對馬鈴薯野生種SpSBP1基因編碼的蛋白的信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。具體網(wǎng)站見表2。

表2 生物信息學(xué)分析網(wǎng)站Tab.2 Bioinformatics analysis web site

1.2.3 馬鈴薯野生種SpSBP1基因靶位點的選擇與CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建 利用在線網(wǎng)站CRISPR-GE(http：//skl.scau.edu.cn/)選擇適宜的靶位點并分析其特異性。根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的識別原理，PAM序列上游約20 bp核苷酸序列即為識別靶位點，靶位點序列GC含量應(yīng)高于40%，脫靶預(yù)估值低于0.6。根據(jù)靶位點設(shè)計特異性引物：SpSBP1-CRISPR/Cas9-F和SpSBP1-CRISPR/Cas9-R(表1)。然后以pCBC-DT1T2載體(gRNA表達(dá)盒)為模板[29]，通過PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s，退火溫度55 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后再72 ℃延伸10 min)，得到含有g(shù)RNA-scaffold和靶位點序列的DNA片段。然后采用邊切邊連體系將擴(kuò)增后的片段連接到pHSN401載體上，連接體系為DNA片段2 μL、pHSN401載體3.5 μL、BsaⅠ(10 U/μL)1 μL、10×T4DNA ligase Buffer 1.5 μL、T4DNA ligase(350 U/μL)1 μL、ddH2O 6 μL，總15 μL。37 ℃酶切5 h，50 ℃連接5 min，80 ℃酶失活10 min。最后將連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，涂布于LB(+ 50 mg/L卡那霉素)固體平板上，倒置放于生化培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)16～24 h。挑取單菌落用載體特異性引物SpSBP1-CRISPR/Cas9-F和SpSBP1-CRISPR/Cas9-R進(jìn)行PCR驗證，將PCR陽性菌落進(jìn)行搖菌提取質(zhì)粒，最后將質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105中，將構(gòu)建好的載體命名為SpSBP1-CRISPR/Cas9。

1.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯野生種遺傳轉(zhuǎn)化

1.2.4.1 外植體的獲得與預(yù)培養(yǎng) 馬鈴薯野生種的幼苗由宜春學(xué)院遺傳育種與分子生物學(xué)實驗室一直繼代培養(yǎng)，試驗以馬鈴薯莖段為轉(zhuǎn)化材料。取苗齡為15 d左右的無菌苗，將莖段(不含腋芽)切成0.5 cm左右。將該莖段平放在分化培養(yǎng)基上(MS+3%蔗糖+2 mg/L 6-BA+1.5 mg/L 2，4-D+0.8%瓊脂)，每瓶接種30～40個外植體，于人工培養(yǎng)室預(yù)培養(yǎng)2 d。

1.2.4.2 農(nóng)桿菌的侵染 提前3 d取出已經(jīng)構(gòu)建好的SpSBP1-CRISPR/Cas9表達(dá)載體，于YEP固體培養(yǎng)基上(利福平50 mg/L，卡那霉素50 mg/L)劃平板，28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，36～48 h后長出單菌落。挑取一單菌落置于10 mL含利福平50 mg/L，卡那霉素50 mg/L的YEP液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 200 r/min振蕩過夜，次日轉(zhuǎn)至50 mL YEP液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.8左右。5 000 r/min，4 ℃，離心10 min，去除上清液，收集菌體。重懸于滅過菌的MS液體培養(yǎng)基(pH=7.0，+1‰ AS)中，稀釋至OD600為0.4～0.6左右。將預(yù)培養(yǎng)2 d的外植體在菌液中浸泡20 min。

1.2.4.3 共培養(yǎng) 將在農(nóng)桿菌中浸泡過的外植體再重新轉(zhuǎn)移到新鮮的分化培養(yǎng)基中(MS+3%蔗糖+2 mg/L 6-BA+1.5 mg/L 2，4-D+1‰ AS+0.8%瓊脂)，每瓶接種30個左右的外植體，并在(25±1)℃條件下恒溫黑暗培養(yǎng)2 d。

1.2.4.4 抑菌培養(yǎng)及篩選培養(yǎng) 將共培養(yǎng)2 d的外植體插入到含濃度為300 mg/L的特美汀抑菌培養(yǎng)基中(MS+3%蔗糖+0.5 mg/L TDZ+0.03 mg/L GA3+200 mg/L 特美汀+0.8%瓊脂)，放在人工培養(yǎng)室培養(yǎng)5～7 d。將進(jìn)行了抑菌培養(yǎng)的外植體插入到含濃度為50 mg/L的卡那霉素篩選培養(yǎng)基中(MS+3%蔗糖+0.5 mg/L TDZ+0.03 mg/L GA3+200 mg/L 特美汀+50 mg/L卡那霉素+0.8%瓊脂)，直到少許外植體能在選擇培養(yǎng)基上長出抗性芽，大部分外植體在含卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上褪綠，變黃為止。

1.2.4.5 不定芽的生根培養(yǎng)及再生植株的移栽 當(dāng)分化的不定芽伸長至1.5～2.5 cm時，將其自基部切下，分別接種于生根培養(yǎng)基中(MS+3% 蔗糖+200 mg/L特美汀+0.8%瓊脂)誘導(dǎo)其生根。當(dāng)根長至足夠長度，大約1個月，即可開瓶蓋煉苗2～3 d，移栽到裝有泥炭土的營養(yǎng)缽中，并覆蓋塑料薄膜，置于人工氣候箱進(jìn)行培養(yǎng)，并且每天要揭開塑料薄膜進(jìn)行通風(fēng)透氣2～3 h，待移栽苗長出新葉之后可以置于外界自然環(huán)境條件下培養(yǎng)。

1.2.5 抗性植株的鑒定 采集適量的再生植株葉片提取基因組DNA，使用CRISPR/Cas9載體特異引物F：5′-CGGCCTCGATATTGGGACTAACTCT-3′和R：5′-CTTA

TCTGTGGAGTCCACGAGCTTC-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。確認(rèn)外源DNA片段是否已經(jīng)插入到植物基因組中。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯野生種SpSBP1基因的cDNA序列克隆

以二倍體馬鈴薯野生種為試驗材料，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增SpSBP1序列，得到1 000 bp左右的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1-A)。切膠回收，將純化后的片段連接至pMD19-T載體上(圖1-B)，挑取陽性克隆搖菌，將菌液送至生工生物工程上海股份有限公司測序。

2.2 馬鈴薯野生種SpSPB1基因的序列分析

測序結(jié)果顯示，馬鈴薯野生種SpSBP1基因大小為1 176 bp，包含92 bp的5′非編碼區(qū)(5′ UTR)和163 bp的3′非編碼區(qū)(3′ UTR)，其最大開放閱讀框(ORF)為921 bp(圖2)，起于93位，止于1 013位，共編碼了306個氨基酸。SpSBP1存在由Smc組成的Smc超家族結(jié)構(gòu)域(111～223 bp)以及RING finger(254～297 bp)和Zinc finger(zf-C3HC4_3)(256～296 bp)結(jié)構(gòu)域(圖3)。將測序正確的序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號為：MZ803088。

A： M.Marker DL2000，1.SpSBP1基因；B： M.Marker DL2000，1—3，6—8.陽性克隆，4—5.陰性克隆。A： M.Marker DL2000，1.SpSBP1 gene；B： M.DL2000，1—3，6—8.Positive clone，4—5.Negative clone.

圖2 SpSBP1 cDNA及預(yù)測的開放閱讀框Fig.2 Sequences of SpSBP1 cDNA and predicted ORF

圖3 SpSBP1的保守區(qū)Fig.3 Conservative domain of SpSBP1

2.3 馬鈴薯SpSBP1基因編碼的蛋白同源性比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用在線軟件進(jìn)行同源序列比對，各個物種的SBP1基因也有所差異(表3)。通過馬鈴薯野生種SBP1編碼的蛋白與其他物種的SBP1編碼的蛋白序列比對可知，馬鈴薯野生種SBP1編碼的蛋白與其他物種SBP1編碼的蛋白相似度較高，并且發(fā)現(xiàn)蛋白序列的N端的保守性不強(qiáng)，而中間和C端的保守性很強(qiáng)(圖4)。運用MEGA 6.0軟件對馬鈴薯野生種和其他10種植物的氨基酸序列進(jìn)行聚類分析，并制作進(jìn)化樹，結(jié)果表明，馬鈴薯野生種SpSBP1基因編碼的蛋白與馬鈴薯野生種ScSBP1編碼的蛋白的同源性最高，其次為花煙草，但與擬南芥、甜櫻桃、蘋果等植物SBP1編碼的蛋白的同源性較低(圖5)。

表3 試驗中各物種的SBP1基因Tab.3 SBP1 genes of species in the experiment

2.4 馬鈴薯野生種SpSBP1基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

馬鈴薯野生種SpSBP1蛋白的理化性質(zhì)用ProtParam在線程序進(jìn)行分析，得出其相對分子質(zhì)量為34.731 44 ku，理論等電點pI為5.10，總負(fù)電荷殘基數(shù)(Asp+Glu)為48，總正電荷殘基數(shù)(Arg+Lys)為38，其蛋白的分子式為C1486H2408N430O481S23，脂肪系數(shù)為83.46，不穩(wěn)定指數(shù)為47.60，為不穩(wěn)定蛋白，平均親水指數(shù)為-0.586，表現(xiàn)親水性。綜上，推測該蛋白為酸性不穩(wěn)定親水性蛋白(圖6)。

通過SOPMA在線程序?qū)pSBP1蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，得出α-螺旋比例為45.42%，延伸鏈結(jié)構(gòu)的比例為13.07%，β-折疊的比例為1.96%，無規(guī)則卷曲比例為39.54%(圖7)。以上結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲所構(gòu)成，而延伸鏈結(jié)構(gòu)和β-折疊所占的比例則較低。

使用SignalP 5.0和TMHMM Server v.2.0在線程序分別對馬鈴薯野生種SpSBP1蛋白的信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果顯示，SpSBP1蛋白沒有信號肽，因此，屬于非分泌蛋白，同時預(yù)測顯示，該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)(圖8)。

圖4 馬鈴薯野生種SpSBP1編碼的蛋白與其他物種同源蛋白多重序列比對Fig.4 Multiple alignment of homologous protein for the SpSBP1 in S.pinnatisectum and other species

圖5 SpSBP1同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of SpSBP1 homologous protein

圖6 SpSBP1蛋白親疏水性分析Fig.6 Hydrophilic analysis of SpSBP1 protein

2.5 SpSBP1-CRISPR/Cas9載體構(gòu)建

利用CRISPR-GE在線網(wǎng)站，以及根據(jù)設(shè)計靶點的原則和CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性切割原則，設(shè)計二倍體馬鈴薯野生種SpSBP1的靶點序列，分別位于該基因的248～266 bp，321～339 bp，以pCBC-DT1T2載體為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖9-A)，將擴(kuò)增片段切膠回收，然后將回收片段連接到pHSN401載體上，挑取菌落進(jìn)行PCR驗證(圖9-B)，然后將PCR陽性菌落進(jìn)行搖菌提取質(zhì)粒，最后將質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105中，將構(gòu)建好的載體命名為SpSBP1-CRISPR/Cas9(圖10)。

圖7 SpSBP1編碼的蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 Secondary structure prediction of protein encoded by SpSBP1 gene

A.SpSBP1基因編碼的蛋白的信號肽預(yù)測；B.SpSBP1基因編碼的蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測。A.Signal peptide prediction of protein encoded by SpSBP1 gene；B.Transmembrane structure prediction of protein encoded by SpSBP1 gene.

2.6 馬鈴薯野生種的遺傳轉(zhuǎn)化

以馬鈴薯野生種的幼苗為材料(圖11-A)，將構(gòu)建好的SpSBP1-CRISPR/Cas9表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法侵染馬鈴薯野生種的莖段(圖11-B)，在24 ℃下共培養(yǎng)2 d(圖11-C)，之后轉(zhuǎn)移到抑菌培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)(圖11-D)，經(jīng)過5～7 d后轉(zhuǎn)移至含50 mg/L卡那霉素的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選(圖11-E、F)，然后將分化出的長至1.5～2.5 cm抗性芽自基部切下，分別接種于生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)其生根(圖11-G、H)。當(dāng)根長至足夠長度，大

A： M.Marker DL2000，1—2.SpSBP1基因；B： M.Marker DL2000，1—4，6—7.陽性克隆，5.陰性克隆。A： M.Marker DL2000，1—2.SpSBP1 gene；B： M.Marker DL2000，1—4，6—7.Positive clones，5.Negative clones.

圖10 馬鈴薯SpSBP1-CRISPR/Cas9載體示意圖Fig.10 Structural diagram of S.pinnatisectum SpSBP1-CRISPR/Cas9 vector

A.馬鈴薯幼苗；B.預(yù)培養(yǎng)；C.共培養(yǎng)；D.抑菌培養(yǎng)；E、F.篩選培養(yǎng)；G、H.生根培養(yǎng)；I.移栽。A.Potato plantlet in vitro；B.Pre-culture；C.Co-culture；D.Antibacterial culture；E，F(xiàn).Screening culture；G，H.Rooting culture；I.Transplanting.

約1個月，即可開瓶蓋煉苗2～3 d，移栽到裝有泥炭土的營養(yǎng)缽中，待移栽苗長出新葉之后可以置于外界自然環(huán)境條件下培養(yǎng)(圖11-I)。

2.7 再生植株的分子鑒定

提取32株抗性植株的基因組DNA，利用載體特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖12)。帶有目標(biāo)靶點的CRISPR/Cas9載體質(zhì)粒陽性對照(CK+)可擴(kuò)增出約424 bp的目的片段(SpSBP1基因的N-端序列)；而野生型植株(CK-)則無法擴(kuò)增出目的片段；抗性植株中可擴(kuò)增出與陽性對照大小相同片段的為PCR陽性植株。

3 結(jié)論與討論

馬鈴薯的營養(yǎng)比較全面，是僅次于水稻和小麥的第三大重要的糧食作物[31]。就整體而言，馬鈴薯的育種進(jìn)程相對來說比較緩慢，究其主要原因是馬鈴薯栽培種的倍性主要為同源四倍體，遺傳特性復(fù)雜，加之其繁殖方式主要是利用薯塊進(jìn)行繁殖，因此大大限制了馬鈴薯基礎(chǔ)研究的開展和育種水平的提高[32]?；谝陨显颍隈R鈴薯二倍體的水平上進(jìn)行再馴化的研究得到越來越多科學(xué)家的呼吁，并最終將馬鈴薯馴化成為能夠用種子來進(jìn)行繁殖的作物。但是，這種方法的一個重要的障礙是大多數(shù)的二倍體馬鈴薯種質(zhì)中存在著自交不親和現(xiàn)象[33]。而自交不親和性是一種生殖隔離的現(xiàn)象，在自然界中40%的開花植物都存在著自交不親和，其中包括十字花科、茄科、薔薇科和罌粟科等至少100種植物種類[34-35]。前人研究證實，植物配子體自交不親性除了SLF和S-RNase之外，還存在其他位于S位點外的SBP1基因。目前，馬鈴薯自交不親和相關(guān)的研究主要集中在S-RNase[1，16，31，33，36]和SLF[18-19]2種基因，而關(guān)于SBP1基因的研究較少。本研究以二倍體馬鈴薯野生種為材料，克隆得到一個自交不親和相關(guān)基因SpSBP1，進(jìn)一步對該基因的序列和功能進(jìn)行了分析及生物信息學(xué)預(yù)測，序列分析得出，SpSBP1蛋白包含RING finger結(jié)構(gòu)域，前人研究表明，SBP1是一類RING-finger蛋白，是植物體內(nèi)存在的一類新的參與基于核酸酶的自交不親和反應(yīng)因子[20]。另外，Zeng等[27]在野生矮杏仁中也鑒定出含有 SCFSFB復(fù)合物新的SBP1基因。序列比對及進(jìn)化樹分析得出，二倍體馬鈴薯野生種SpSBP1具有一定的序列保守性，并且與馬鈴薯野生種ScSBP1及花煙草NaSBP1親緣關(guān)系最近，而這幾個物種同屬茄科植物，推測SPB1基因可能在同一科作物中具有更高的保守性，這與同科植物基因家族成員具有更高的保守性研究結(jié)果相符[37]。O′Brien等[24]報道，馬鈴薯ScSBP1基因幾乎在所有的組織中均有表達(dá)，其作用比僅參與自交不親和的基因更普遍。通過進(jìn)一步研究證實，ScSBP1在馬鈴薯自交不親和性中具有重要的作用。Lee等[25]通過研究表明，花煙草NaSPB1和NaPCCP與雌蕊AGPs之間的結(jié)合可能對植物中正在生長的花粉管內(nèi)信號的傳導(dǎo)和運輸有幫助。以上研究表明，SBP1與植物配子體自交不親和存在一定關(guān)系，因此，SpSBP1也可能與二倍體馬鈴薯野生種自交不親和相關(guān)。

M.Marker DL2000；CK+.陽性質(zhì)粒對照；CK-.未轉(zhuǎn)化植株對照；3，9，12，14—16，22—23，27—31.陽性植株；1—2，4—8，10—11，13，17—21，24—26，32.陰性植株。M.Marker DL2000；CK+.Positive plasmid control；CK-.Untransformed plant control；3，9，12，14—16，22—23，27—31.Positive plants；1—2，4—8，10—11，13，17—21，24—26，32.Negative plants.

近年來，CRISPR/Cas9技術(shù)在植物基因編輯研究中應(yīng)用的越來越多，其通過對目標(biāo)基因進(jìn)行高效準(zhǔn)確的修飾，為植物遺傳改良開辟了新途徑[38-41]。Sun和Kao[42]通過CRISPR/Cas9技術(shù)證實，矮牽牛PiSSK1在自交不親和中發(fā)揮了特殊的作用，并支持了含SLF蛋白的SCF復(fù)合體對授粉親和性至關(guān)重要的假設(shè)。Ye等[1]利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除自交不親和基因S-RNase，培育出了自交親和的二倍體馬鈴薯。Ma等[43]通過研究表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠與內(nèi)源tRNA處理系統(tǒng)相結(jié)合，能夠作為一種改善卷心菜性狀的有效工具。Enciso-Rodriguez等[31]利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除S-RNase，從而克服二倍體馬鈴薯的自交不親和性，為馬鈴薯二倍體育種提供一種有效的途徑。Dou等[44]利用CRISPR/Cas9技術(shù)制備新型自交不親和甘藍(lán)型油菜，從而能夠加速雜種優(yōu)勢的利用。在本試驗中，也成功利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建出二倍體馬鈴薯野生種SpSBP1基因的敲除載體，并轉(zhuǎn)化馬鈴薯外植體獲得陽性植株。

本研究應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從二倍體馬鈴薯野生種中克隆得到自交不親和相關(guān)基因SpSBP1的cDNA序列，全長為1 176 bp，其最大開放閱讀框大小為921 bp，編碼的氨基酸數(shù)為306個，分子質(zhì)量大小為34.731 44 ku。多序列比對及進(jìn)化樹分析表明，馬鈴薯野生種SpSBP1與馬鈴薯野生種ScSBP1的親緣關(guān)系最近，其次為花煙草。對其理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析，得出其編碼蛋白SpSBP1為酸性不穩(wěn)定親水性非分泌蛋白。同時成功構(gòu)建了SpSBP1-CRISPR/Cas9載體，并通過遺傳轉(zhuǎn)化法，獲得了陽性植株，后續(xù)將進(jìn)一步研究該基因在二倍體馬鈴薯野生種自交不親和性中的調(diào)控機(jī)制，研究結(jié)果能夠為二倍體馬鈴薯雜交育種平臺的建立提供理論依據(jù)及起始育種材料。