泛連接蛋白1參與炎癥調(diào)控和抗炎作用的研究進(jìn)展*

竇 琴,吳秋妹 綜述,羽曉瑜 審校

(同濟(jì)大學(xué)附屬上海東方醫(yī)院，上海 200123)

細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)和物質(zhì)傳遞是細(xì)胞維持正常生物學(xué)功能的重要方式，泛連接蛋白1(Pannexin 1，Panx1)大孔通道蛋白家族在該過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。Panx1在肝臟、心臟、肺臟、腦部及眼睛、耳蝸、前列腺、甲狀腺、垂體、視網(wǎng)膜等各類(lèi)細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在維持人體心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)正常功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Panx1是細(xì)胞膜上連接蛋白，將細(xì)胞內(nèi)腺苷三磷酸(ATP)釋放至細(xì)胞外，參與細(xì)胞內(nèi)外信息傳遞[2]，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和遷移，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)育和再生，參與傷口愈合、細(xì)胞清除、感染和癌癥發(fā)生等過(guò)程[3-6]。本文將通過(guò)闡述Panx1在炎性反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用和分子機(jī)制的最新研究進(jìn)展，為抗感染治療提供新的研究視角。

1 Panx1概述

1.1 Panx1基本結(jié)構(gòu)

Panx1單體為4次跨膜結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞膜上寡聚化形成Panx1通道蛋白。Ruan通過(guò)低溫冷凍電鏡發(fā)現(xiàn)人源野生型Panx1是七聚體的組裝模式，中間的主通道可以通過(guò)ATP大分子，外側(cè)7個(gè)小通道是重要的離子通道[7]。Ruan同時(shí)解析了ATP通透性的限制性位點(diǎn)，揭示了細(xì)胞外端74位的色氨酸形成一個(gè)直徑小于10埃的門(mén)控環(huán)，選擇性調(diào)控ATP通透性的機(jī)制[8]，提示該位點(diǎn)可以成為Panx1特異性調(diào)控位點(diǎn)。細(xì)胞通過(guò)Panx1通道開(kāi)放將細(xì)胞內(nèi)生成的ATP釋放到細(xì)胞外，胞外游離的ATP作為一種重要的信號(hào)分子，引起免疫細(xì)胞遷移聚集并誘導(dǎo)炎性反應(yīng)及其他生理反應(yīng)。

1.2 Panx1通道開(kāi)放/關(guān)閉

生理?xiàng)l件下，Panx1主通道內(nèi)入口被其C末端結(jié)構(gòu)封閉，小的陰離子可通過(guò)外側(cè)小通道進(jìn)行離子交換。這些狹窄小通道與主孔相連，并受N端螺旋結(jié)構(gòu)和第一跨膜螺旋之間的長(zhǎng)連接體控制。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，半胱氨酸天冬氨酸酶(Caspase)切割C末端的尾部，使Pannexin1主孔道開(kāi)放，釋放細(xì)胞內(nèi)ATP到細(xì)胞外，同時(shí)釋放促進(jìn)細(xì)胞增殖的信號(hào)分子進(jìn)入細(xì)胞間液，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

1.2.1Panx1通道開(kāi)放

目前認(rèn)為Panx1通道開(kāi)放存在5個(gè)階段：5%、25%、30%、90%和完全開(kāi)放[9]。Panx1通道的開(kāi)放分為受體依賴(lài)性和非受體依賴(lài)性?xún)煞N，受體依賴(lài)性開(kāi)放是指一些細(xì)胞膜上受體(PRs、腎上腺素能α受體、組胺受體)激活促使Panx1通道開(kāi)放。非受體依賴(lài)性開(kāi)放是指外界因素如機(jī)械應(yīng)力、缺血、缺氧等直接作用于Panx1通道使其開(kāi)放。Panx1翻譯后修飾也可以調(diào)節(jié)其通道的開(kāi)放狀態(tài)，Panx1肽鏈的抑制性結(jié)構(gòu)CTT可以被Caspase-3/7剪切，從而使Panx1通道持續(xù)開(kāi)放[8，10]。Panx1在炎癥、再生和機(jī)械信號(hào)傳導(dǎo)中的功能，以及與Panx1相關(guān)的各種P2受體的激活，均與細(xì)胞外ATP和K+水平相關(guān)。K+刺激Panx1通道釋放ATP并從細(xì)胞外吸收陽(yáng)離子進(jìn)細(xì)胞內(nèi)。激活的受體可使細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，誘導(dǎo)Panx1通道開(kāi)放，細(xì)胞內(nèi)ATP和K+從細(xì)胞內(nèi)外排到細(xì)胞外，促進(jìn)炎癥的發(fā)生[11]。細(xì)胞外低濃度ATP通過(guò)和嘌呤受體結(jié)合，也可以反饋激活Panx1[12-14]通道開(kāi)放，誘導(dǎo)ATP釋放。

1.2.2Panx1通道關(guān)閉

Panx1通道可以被調(diào)控關(guān)閉，其抑制因子和細(xì)胞外ATP濃度是最主要的調(diào)控因素。生胃酮(carbenoxolone，CBX)是當(dāng)前發(fā)現(xiàn)Panx1最強(qiáng)的抑制劑，通過(guò)封閉Panx1主通道，抑制 ATP釋放功能[8]。其他抑制劑4、4′-二異硫氰基芪-2、2′-二磺酸(DIDS)、 NPPB、IAA-94、氟滅酸抑制作用依次減弱。IVAN等[15]研究發(fā)現(xiàn)喹諾酮類(lèi)抗生素也可以阻斷Panx1通道，抑制ATP釋放。此外，ATP濃度可以負(fù)反饋調(diào)節(jié)Panx1關(guān)閉狀態(tài)。高ATP濃度(1 000 μmol/L)對(duì)Panx1通道有60%抑制作用。細(xì)胞外ATP的濃度高于普通濃度的50～100倍時(shí)，ATP直接作用于Panx1通道，使該通道失活[16]。同時(shí)，高濃度ATP也可以誘導(dǎo)關(guān)閉Panx1，從而消除ATP釋放的正反饋回路[16-17]。

2 Panx1主要生物學(xué)功能

正常生理?xiàng)l件下，Panx1的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控。Panx1表達(dá)水平的改變(高表達(dá)或低表達(dá))與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。隨著Panx1在炎癥治療、癲癇、腫瘤、移植等領(lǐng)域的研究不斷深入，其在發(fā)育、血壓調(diào)節(jié)、炎癥和細(xì)胞死亡中的重要作用也越來(lái)越引起重視。Panx1通道將細(xì)胞內(nèi)ATP釋放到細(xì)胞外，分別調(diào)節(jié)鉀離子外流和鈣離子內(nèi)流，參與免疫調(diào)節(jié)、血管收縮與舒張、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、味覺(jué)系統(tǒng)和氣道纖毛運(yùn)動(dòng)等生理功能。目前炎癥和癌癥之間的相關(guān)性已得到充分驗(yàn)證，靶向Panx1治療癌癥的研究也越來(lái)越多，抗炎藥物已顯示出在黑色素瘤等惡性腫瘤中具有良好的預(yù)防作用[18]，Panx1已成為腫瘤、急性炎癥損傷、應(yīng)激損傷等多種疾病的潛在治療靶點(diǎn)[19-22]。

3 Panx1參與炎癥調(diào)控的機(jī)制

在病原體的感染、應(yīng)激反應(yīng)、機(jī)體損傷或細(xì)胞死亡過(guò)程中，Panx1在宿主免疫系統(tǒng)都發(fā)揮著重要的免疫防御及保護(hù)功能[23]。Panx1通道廣泛存在各種細(xì)胞膜上，參與炎性反應(yīng)過(guò)程和免疫反應(yīng)。先天性免疫中Panx1的開(kāi)放釋放ATP,促使免疫細(xì)胞遷移。SOSHI等[24]研究發(fā)現(xiàn)，阻斷Panx1可以抑制中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的遷移，高表達(dá)Panx1也可以增加免疫細(xì)胞的遷移。該研究還發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，Panx1基因敲除小鼠中提取出胸腺細(xì)胞無(wú)法募集巨噬細(xì)胞。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，Panx1通道與炎癥小體激活，炎性細(xì)胞因子釋放和炎性細(xì)胞募集關(guān)系密切。半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1型(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)組成的蛋白復(fù)合體，簡(jiǎn)稱(chēng)NLRP3炎性小體，其中效應(yīng)蛋白 Caspase-1的激活可以進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和IL-18的釋放[25]。高濃度的細(xì)胞外ATP作用于核糖磷酸焦磷酸激酶(PRs)，激活炎性小體，促使Caspase-1催化IL-1β前體成有成熟形式的IL-1β，誘發(fā)炎性反應(yīng)。Panx1與P2X7R相互作用可以在細(xì)胞膜上形成一個(gè)大的高通透性孔道，激活炎性小體。

Panx1通道在適應(yīng)性免疫中的作用主要體現(xiàn)在Panx1與T細(xì)胞的關(guān)系。首先，與Panx1誘導(dǎo)的嘌呤自分泌和旁分泌信號(hào)激活參與了T細(xì)胞增殖和IL-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄[26]。此外，T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cells,APCs)上都有Panx1通道，它們之間的相互作用可以形成免疫突觸，T細(xì)胞上的PRs既接受來(lái)自APCs上Panx1所釋放的ATP,也接受自身Panx1所釋放的ATP，促進(jìn)T細(xì)胞的激活和增殖，并且參與了免疫突觸的形成，在適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。TOBIAS等[27]用高滲鹽水刺激人外周血白血病T細(xì)胞(Jurkat細(xì)胞)，誘導(dǎo)Panx1釋放ATP，作用于T細(xì)胞表面的P2X、R和P2X,R，激活T細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞的功能。CHRISTOPHER等[28]發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞高表達(dá)Panx1有利于Treg細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞間通訊，下調(diào)效應(yīng)T細(xì)胞活性，抑制氣道炎性反應(yīng)。

4 Panx1在急性炎癥性疾病中的炎癥調(diào)控及抗炎作用

4.1 病原微生物感染

大量研究證實(shí)，細(xì)菌可以釋放大量ATP激活Panx1/P2X。產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的β-毒素可以和P2X7相互作用激活Panx1開(kāi)放，Panx1通道開(kāi)放釋放的ATP促進(jìn)寡聚體形成毒素的分泌，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[29]。越來(lái)越多的研究提示，細(xì)菌、真菌刺激下Panx1通路活化和炎癥發(fā)生存在緊密關(guān)系[30]。在急性炎癥期間血管內(nèi)皮細(xì)胞Panx1通道開(kāi)放釋放ATP可促進(jìn)白細(xì)胞遷移參與炎性反應(yīng)[31]。人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)感染中Panx1還參與調(diào)控CD4+T激活、HIV相關(guān)的神經(jīng)認(rèn)知障礙，抑制Panx1可以有效控制HIV感染[32-33]。冠狀病毒病 (COVID-19)感染中，SARS-CoV-2刺突蛋白和人類(lèi)冠狀病毒229E (hCoV-229E)或其純化的 S 蛋白可誘導(dǎo)人肺上皮細(xì)胞Panx1通道開(kāi)放，是導(dǎo)致 SARS-CoV-2引發(fā)COVID-19的重要原因之一[34]。

4.2 膿毒癥

膿毒癥病情兇險(xiǎn)，病死率高，全球每天約14 000人死于其并發(fā)癥，難以控制的全身性炎性反應(yīng)是早期膿毒癥的特征，膿毒癥發(fā)生與巨噬細(xì)胞活化及炎性小體激活有關(guān)。最新研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞上的P2X受體在膿毒癥中有保護(hù)作用，與野生型小鼠相比，P2X受體基因敲除的膿毒癥模型小鼠短期生存率明顯下降，血漿和腹腔灌洗液中的炎癥因子水平升高。YANG等[35]發(fā)現(xiàn)，Panx1基因敲除小鼠，血清IL-1β水平明顯降低比野生型小鼠更耐受內(nèi)毒素的二次攻擊。通過(guò)抑制 Pannexin-1降低 NLRP3 炎性體激活和細(xì)胞凋亡可以減輕膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷和腦損傷[36-37]。

4.3 移植后感染

肝移植的成功開(kāi)展為許多終末期肝病患者帶來(lái)了生的希望，移植后感染控制是提高移植成活率的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，供體肝臟中Panx1的低表達(dá)與人類(lèi)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)感染有關(guān)。 肝移植Panx1-/-小鼠模型證明Panx1缺乏癥增加了MRSA在體內(nèi)的定植，進(jìn)一步引起肝臟的炎性損傷壞死。低Panx1致減少肝細(xì)胞中ATP的釋放，進(jìn)一步降低了肝細(xì)胞ATP的P2X受體P2x2的活化[38]。正常細(xì)胞壞死過(guò)程中，Panx1可以上調(diào)炎癥細(xì)胞因子(如IL-8)的產(chǎn)生，當(dāng)Panx1被沉默或抑制可以影響炎癥的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，混合激酶樣蛋白(MLKL)低聚物會(huì)激活Panx1通道，同時(shí)伴隨磷脂酰絲氨酸的喪失，提示Panx1限制了壞死病程中的促炎細(xì)胞因子釋放[39]。

5 Panx1在慢性炎癥性疾病中的炎癥調(diào)控及抗炎作用

5.1 血管炎癥性疾病

血管內(nèi)皮細(xì)胞在血栓形成、創(chuàng)傷愈合及炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。血管內(nèi)皮受損已被視為休克、感染、心血管疾病、腫瘤等多種疾病發(fā)生的病理基礎(chǔ)，血管內(nèi)皮細(xì)胞中，Ca2+調(diào)節(jié)通過(guò)Panx1通道對(duì)核因子-κB(NF-κB)產(chǎn)生反饋?zhàn)饔茫瑥亩龠M(jìn)IL-1β的合成，誘導(dǎo)血管炎性反應(yīng)[40]。FILIPPD等[41]在Panx1缺陷型小鼠中觀(guān)察到，淋巴功能受損導(dǎo)致的免疫反應(yīng)降低，可以抵消動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中Panx1缺失在內(nèi)皮和/或單核細(xì)胞中的有害作用，提示Panx1對(duì)淋巴功能與脂質(zhì)代謝和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)生互相關(guān)聯(lián)進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。

5.2 阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)

阿爾茨海默病又叫老年性癡呆，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病。由病毒感染或衰老引起的神經(jīng)炎癥可能導(dǎo)致IFITM3水平升高，促進(jìn)γ-分泌酶生成，促進(jìn)β-淀粉樣蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)的活性,增加AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[42]。神經(jīng)炎性反應(yīng)中，Panx1介導(dǎo)的信號(hào)參與神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)[43]。鄰近的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的Panx1被激活后，活化的Panx1通道可以促進(jìn)Aβ導(dǎo)致的級(jí)聯(lián)反應(yīng)致突觸功能障礙。小鼠實(shí)驗(yàn)證明，阻斷Panx1 可以有效減輕AD的早期突觸可塑性缺陷[44]。Panx1在腦部損傷后炎性反應(yīng)和隨后的組織再生過(guò)程中均起重要作用[45]。由于Panx1在多種組織中廣泛表達(dá)并參與多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，因此，連接蛋白被認(rèn)為是顱腦或脊髓損傷、缺血性中風(fēng)治療的新靶標(biāo)。

5.2 眼部疾病

ANASTASIA等[46]在水性淚液缺乏性干眼小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，淚腺Panx1 sdRNAi的治療可以顯著降低TSP1-/-小鼠中IL-1β和NLRP3表達(dá)調(diào)控，提示靶向Panx1的治療策略可以抑制炎癥和/或炎癥的信號(hào)通路。由于Panx1抑制劑只是短期阻斷和部分抑制Panx1功能，所以在臨床治療上可行性高。Panx1參與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGC)損傷和視神經(jīng)頭重塑,青光眼發(fā)病中，Panx1抑制劑可以阻斷炎癥小體和離子化的Ca2+流入，而不會(huì)影響整體視網(wǎng)膜功能[47-48]。MOHAMMAD等[49]發(fā)現(xiàn)，在低滲應(yīng)激過(guò)程中Panx1介導(dǎo)的ATP釋放與TRPV4通道激活有關(guān)，參與炎性反應(yīng)。

6 結(jié)語(yǔ)和展望

Panx1通道開(kāi)放關(guān)閉是致“ATP誘導(dǎo)的ATP釋放”，可以形成正反饋通路活化，因而嚴(yán)格而準(zhǔn)確的調(diào)控是Panx1生理功能多樣性的生理學(xué)基礎(chǔ)。由于Panx1生理功能多樣，還有很多功能和調(diào)控機(jī)制尚未闡明，需要進(jìn)一步大量的實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證和完善現(xiàn)有研究結(jié)論。

早期阻斷Panx1通道可以減弱先天性免疫反應(yīng)，抑制免疫細(xì)胞遷移，降低炎癥因子的表達(dá)，減少組織損傷。晚期激活Panx1可以增強(qiáng)后天性免疫反應(yīng)，增強(qiáng)T細(xì)胞功能，改善免疫抑制狀態(tài)。目前，炎癥和癌癥之間的相關(guān)性，抗生素-泛素通道-細(xì)胞完整性之間相互聯(lián)系已得到充分確立，靶向Panx1的炎癥和腫瘤治療正成為新的治療靶點(diǎn)。因?yàn)槟壳芭R床上還缺乏特異性的Panx1抑制劑，還需要開(kāi)發(fā)更多的Panx1抑制劑以期干預(yù)Panx1活化，調(diào)控疾病的發(fā)生發(fā)展；凋亡中Panx1依賴(lài)的代謝物釋放在體內(nèi)調(diào)節(jié)吞噬細(xì)胞基因表達(dá)，減輕炎性反應(yīng)，以及其如何選擇性表達(dá)相關(guān)代謝產(chǎn)物的機(jī)制還不清楚，仍需要進(jìn)一步研究探索。耐藥性細(xì)菌增加和新抗生素的缺乏是人類(lèi)健康重大挑戰(zhàn)，喹諾酮類(lèi)抗生素可以阻斷Panx1通道，提示抗生素、泛素通道和細(xì)胞完整性之間相互聯(lián)系，重組某些喹諾酮類(lèi)藥物可能有助于開(kāi)發(fā)新的抗菌藥物。