二甲雙胍抑制人MDA-MB-231細胞增殖及遷移的體外實驗研究

趙 巖，孫震曉*

(北京中醫(yī)藥大學生命科學學院，北京 102488)

二甲雙胍作為臨床上廣泛應用于2型糖尿病患者的藥物，研究表明，接受二甲雙胍治療的2型糖尿病患者的癌癥發(fā)生率和死亡率明顯降低[1-3]。近年來，二甲雙胍的抗腫瘤功效受到持續(xù)關注，越來越多的實驗數(shù)據(jù)表明二甲雙胍可以抑制癌細胞的增殖并誘導多種癌細胞凋亡[4-5]。目前的研究表明，二甲雙胍的抗腫瘤機制表現(xiàn)在特異性激活單磷酸腺苷依賴的蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)，進而影響其下游的信號通路來發(fā)揮抗腫瘤的作用[6-7]；誘導腫瘤細胞周期阻滯[8-9]；增強腫瘤細胞對放化療治療的敏感性[10]等。

乳腺癌是全球女性發(fā)病率最高的癌癥之一，其死亡率僅次于肺癌[11]，三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)作為其中的一個分型，是指雌激素受體、孕激素受體、人表皮生長因子受體-2表達均為陰性的一類乳腺癌，占所有乳腺癌患者的15%~20%，其生存率要遠低于非TNBC患者[12]，主要原因在于該分型的腫瘤細胞具有分化程度低、增殖能力強、易轉移、復發(fā)率高的特點。目前，化療仍是臨床上采用的主要治療手段，但化療耐藥性及TNBC本身轉移能力強的特點是其治療中的主要障礙[13]。流行病學研究表明，服用二甲雙胍可顯著降低糖尿病患者的乳腺癌發(fā)病率和死亡率[14]。因此，本研究選擇人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞為研究對象，探討二甲雙胍體外是否對其增殖和遷移有抑制作用，為進一步開展二甲雙胍抗三陰性乳腺癌的基礎研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231，由北京中醫(yī)藥大學生物制藥系凍存；RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于Gibco公司；青霉素、鏈霉素溶液購于Amresco公司；MTT購于北京拜爾迪生物技術有限公司；胎牛血清，購于浙江天杭生物科技有限公司；二甲雙胍，純度≥98%，購于北京蘭博利德商貿有限公司；細胞培養(yǎng)瓶，細胞培養(yǎng)孔板，8.0μm孔徑Transwell小室均購于Corning公司；MCO-18AIC(UV)細胞培養(yǎng)箱購于Sanyo公司；Nikon ECLIPSE TE2000-S倒置相差顯微鏡，Nikon ECLIPSE TE200正置顯微鏡購于Nikon公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT法檢測細胞活力將處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞按每孔1.5×103個接種至96孔板中，置于CO2體積分數(shù)為5%、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。倒置顯微鏡下觀察到細胞貼壁并且生長良好時，加入RPMI 1640完全培養(yǎng)基和含不同濃度二甲雙胍(1、2、4 mmol/L)的含藥培養(yǎng)基，作用時間分別為48和72 h。到達作用時間后吸去培養(yǎng)基，每孔加入0.5 mg/mL的MTT 100μL，培養(yǎng)箱中孵育4 h，倒去MTT，加入150μL的DMSO震蕩使藍紫色結晶完全溶解，酶標儀在570 nm處檢測溶液的吸光度D(570)。按下列公式計算細胞活力[15]。

1.2.2 細胞形態(tài)學觀察細胞培養(yǎng)同1.2.1。加入RPMI 1640完全培養(yǎng)基和含不同濃度二甲雙胍(1、2、4 mmol/L)的含藥培養(yǎng)基，作用時間為72 h。倒置顯微鏡下觀察對照組和加藥組細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)學變化，拍照記錄。

4 mmol/L二甲雙胍作用MDA-MB-231細胞48 h后收集細胞，離心涂片后自然晾干，無水乙醇固定3 min。Giemsa貯存液與PBS按1∶5混合后離心，取上清滴加在細胞上，染色15~20 min，洗去染液，正置顯微鏡下觀察，拍照記錄。

1.2.3 細胞劃痕實驗取處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞，以每孔4.8×105個細胞的濃度接種于6孔板中，接種后輕晃細胞培養(yǎng)板使細胞均勻且單層分布，待細胞生長至匯合度達到95%以上時準備劃痕。用10μL白色槍頭垂直沿著無菌直尺劃痕。之后用PBS輕輕洗滌處理孔3次，洗去劃下來的細胞，并拍照記錄(0 h)。加入含不同濃度二甲雙胍的的培養(yǎng)基(2、4 mmol/L)，對照組使用RPMI 1640完全培養(yǎng)基，置于CO2體積分數(shù)為5%、溫度為37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后拍照。使用ImageJ軟件的劃痕面積分析模塊得到劃痕面積S，并按下列公式[16]計算劃痕愈合率。

1.2.4 Transwell遷移實驗將處于對數(shù)生長期的細胞無血清培養(yǎng)過夜，消化離心收集細胞，使用無FBS，含不同濃度二甲雙胍(2、4 mmol/L)的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細胞，調整細胞濃度為2×105個/mL，按每孔100μL即2×104個細胞接種至上室，在下室加入600μL含10%FBS的RPMI 1640，置于CO2體積分數(shù)為5%、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后從細胞培養(yǎng)板中取出Transwell小室，棄去上室培養(yǎng)液，并使用PBS清洗兩次，然后用濕棉簽擦去膜上層細胞，4%多聚甲醛固定15 min，并用蒸餾水清洗數(shù)次以除去殘留固定液。將小室置于0.1%結晶紫中染色30 min，用蒸餾水將浮色漂洗干凈后于正置顯微鏡下(40×)拍照(ImageView拍照軟件)，使用ImageJ統(tǒng)計膜下層細胞數(shù)。按參考文獻[17]的方法分析不同處理組對細胞穿膜能力的影響。

1.2.5 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。細胞活力，劃痕愈合率及穿膜細胞數(shù)的統(tǒng)計采用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)均采用±s表示，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 二甲雙胍對人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的影響

2.1.1 二甲雙胍對MDA-MB-231細胞活力的影響MTT實驗結果見圖1，與對照組比較，可見二甲雙胍在濃度為1、2 mmol/L時對MDA-MB-231細胞活力無明顯抑制作用，在濃度為4 mmol/L作用72 h時可顯著抑制MDA-MB-231細胞活力(P＜0.01)，抑制率為(29.83±2.25)%。

圖1 二甲雙胍作用48和72 h后對MDA-MB-231細胞活力的影響

2.1.2 二甲雙胍對MDA-MB-231細胞形態(tài)學變化的影響倒置顯微鏡下觀察結果見圖2，與對照組相比，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍濃度為1 mmol/L時細胞形態(tài)沒有發(fā)生明顯變化；當二甲雙胍濃度為2 mmol/L時，視野中變圓的細胞數(shù)量明顯增加，且細胞密度有所降低；而當二甲雙胍濃度為4 mmol/L時，細胞密度明顯降低，細胞與細胞間聯(lián)系減少。結合MTT實驗結果，說明二甲雙胍明顯抑制了MDA-MB-231細胞的增殖。

細胞經Giemsa染色后光學顯微鏡下觀察結果見圖3，可見對照組MDA-MB-231細胞形態(tài)正常，而4 mmol/L的二甲雙胍組部分細胞出現(xiàn)細胞核碎裂現(xiàn)象。

圖2 倒置顯微鏡下觀察二甲雙胍作用72 h后MDA-MB-231細胞形態(tài)學變化

圖3 Giemsa染色觀察二甲雙胍作用48 h后MDA-MB-231細胞的形態(tài)學變化

2.2 二甲雙胍對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響

2.2.1 二甲雙胍對MDA-MB-231細胞劃痕愈合的抑制作用體外細胞劃痕實驗結果見圖4，與對照組比較，用2、4 mmol/L的二甲雙胍處理MDA-MB-231細胞24 h，藥物處理組細胞匯合程度明顯降低。2、4 mmol/L二甲雙胍處理組劃痕愈合率分別為(55.76±2.41)%、(52.67±4.48)%，與對照組間的差異均具有統(tǒng)計學意義(均為P＜0.01)。

圖4 二甲雙胍作用MDA-MB-231細胞24 h后劃痕愈合情況

2.2.2 二甲雙胍對MDA-MB-231細胞穿膜能力的抑制Transwell遷移實驗結果見圖5，不同濃度的二甲雙胍處理MDA-MB-231細胞24 h后，視野下穿膜細胞數(shù)目明顯減少。統(tǒng)計結果顯示二甲雙胍處理MDAMB-231細胞后，與對照組相比發(fā)生遷移的細胞數(shù)目顯著減少，對照組的穿膜細胞數(shù)為(99.3±18.9)個，2、4 mmol/L二甲雙胍處理組的穿膜細胞數(shù)分別為(61.6±1.6)、(51.3±2.6)個，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖5 二甲雙胍作用MDA-MB-231細胞24 h后的穿膜情況

3 討論

二甲雙胍作為臨床廣泛使用的藥物，其治療2型糖尿病的效果和安全性已得到充分肯定。目前，除了體外實驗證明二甲雙胍的抗腫瘤功效外，也有研究表明二甲雙胍也可以在體內抑制乳腺癌移植瘤小鼠腫瘤的生長[18-19]。本研究選用了遷移能力較強的人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞為研究對象，首先，結合細胞活力測定和形態(tài)觀察，確定二甲雙胍體外抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖情況，其次，選擇合適的藥物濃度，通過劃痕實驗和Transwell實驗觀察二甲雙胍對該細胞遷移能力的影響。結果表明，2、4 mmol/L濃度的二甲雙胍可以顯著抑制該細胞的遷移能力，但是，二甲雙胍是通過何種分子機制調控腫瘤細胞的增殖和遷移，以及對腫瘤細胞轉移能力的影響，還需要進一步實驗研究闡明。

腫瘤作為一種多因素共同作用引起的復雜疾病，兩藥或多藥聯(lián)合使用已在臨床證明比單藥使用抗腫瘤效果更優(yōu)[20-21]，二甲雙胍與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合使用逐漸為大家所關注。有實驗表明，二甲雙胍與醋酸諾美孕酮聯(lián)合應用時，使子宮內膜癌細胞RL95-2和HEC-1A的增殖抑制率分別提高了12.8%和17.1%[22]。二甲雙胍和順鉑聯(lián)用與分別單用相比可明顯降低TNBC細胞的存活率，同時，細胞遷移和侵襲的現(xiàn)象也明顯減弱[23]。任翠等[24]研究發(fā)現(xiàn)，新型厚樸酚-二甲雙胍綴合物低、高劑量組均可抑制小鼠人肝癌細胞HepG2移植瘤生長，且并未產生不良反應，該研究提供了一種將不同功效的兩種藥物以人工合成的方法，拼接成具有多個核心作用的綴合物分子，以期能達到增強藥效或增加藥物作用靶點的效果。未來研究可以在揭示二甲雙胍抗腫瘤增殖和轉移分子機制的基礎上，進一步探索二甲雙胍與臨床抗腫瘤藥物聯(lián)用的效果。