丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)環(huán)境細(xì)顆粒物誘導(dǎo)的大鼠肺部損傷的保護(hù)作用

陳東亞，陸羅定，陳 耿，張 穎，俞 萍，呂中明，卞 倩*

(江蘇省疾病預(yù)防控制中心毒理與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究所，江蘇 南京 210009)

目前的流行病學(xué)研究表明長(zhǎng)期暴露于環(huán)境細(xì)顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)中，可能引發(fā)哮喘、肺功能下降、心血管疾病、神經(jīng)毒性等[1-4]。PM2.5主要成分為礦物粉塵、多環(huán)芳烴、硫酸鹽和銨等[5]，因?yàn)槠淠艹练e在呼吸道及肺泡中，且難以清除，其所致?lián)p傷主要表現(xiàn)為肺部炎性病變，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和炎性因子如白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和IL-6(interleukin-6，IL-6)等的增加[6-8]。

丹參酮ⅡA磺酸鈉(sulfotanshinone sodium，STS)是從中草藥丹參中提取并磺化的物質(zhì)，具有改善血液循環(huán)、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)、抗血栓等作用，目前臨床已被廣泛用于治療心血管疾病，其更多藥理作用還在被繼續(xù)探索。Xu等[9]報(bào)道，STS可通過(guò)抑制核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)來(lái)減輕脂多糖引起的小鼠急性肺損傷。高輝等[10]報(bào)道，STS聯(lián)合布地奈德和異丙托溴銨霧化吸入可顯著改善慢性阻塞性肺病急性加重期患者的肺功能和免疫功能。而目前關(guān)于STS對(duì)PM2.5誘導(dǎo)的肺部炎癥的相關(guān)研究較少。因此本研究在建立PM2.5氣管滴注大鼠肺部炎癥模型基礎(chǔ)上，探索STS對(duì)大鼠肺部炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑包括：STS(上海第一生化藥業(yè)有限公司)；空氣細(xì)顆粒物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究所)；地塞米松片(廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司)；大鼠CD3-4-8檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司)；IL-1β、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒(南京翼飛雪生物科技有限公司)；細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔抗NF-κB P65多克隆抗體及磷酸化p-P65多克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)。

主要儀器包括：酶標(biāo)儀(Paradigm型，美國(guó)MD公司)；小動(dòng)物肺功能-全身體積描記檢測(cè)系統(tǒng)(WBP型，美國(guó)BUXCO公司)；低溫高速離心機(jī)(MIKRO 220R型，德國(guó)Hettich公司)；流式細(xì)胞儀(C6，美國(guó)BD公司)；Mini-PROTEAN型電泳儀和Trans-Blot型轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；成像儀(C280型，美國(guó)Azure Biosystems公司)。

1.2 造模及給藥

24只清潔級(jí)雄性SD大鼠，初始體質(zhì)量180~200 g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SXK(蘇)2016-0002，由南京醫(yī)科大學(xué)提供，在動(dòng)物飼養(yǎng)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，每組6只，分別為對(duì)照組、PM2.5染毒組(模型組)、丹參酮ⅡA磺酸鈉組(STS組)、地塞米松組(陽(yáng)性對(duì)照)。染毒濃度設(shè)定依據(jù)參見(jiàn)本課題組前期發(fā)表的論文[11]。本研究采用氣管滴注PM2.5懸液染毒，除對(duì)照組氣管滴注生理鹽水外，其余3組染毒劑量均為5.4 mg/kg，每3 d滴注1次，共10次，于染毒第1天起STS組和地塞米松組分別以濃度15 mg/kg和0.5 mg/kg腹腔注射，每天1次，持續(xù)28 d。末次染毒后2 d，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血2 mL，處死后灌洗左肺，收集肺泡灌洗液5 mL，右肺上葉置于液氮凍存。

1.3 大鼠呼吸功能測(cè)定

末次染毒后24 h，采用整體體積描記法(whole body plethysmography，WBP)，將大鼠置于測(cè)量腔內(nèi)，在安靜且溫度和濕度適宜環(huán)境中，適應(yīng)10 min，待呼吸波形平穩(wěn)后，測(cè)定各組大鼠的呼吸頻率(respiratory frequency，f)和被迫呼吸間隙(enhanced pause，Penh)。

1.4 血液淋巴細(xì)胞亞群分析和肺泡灌洗液炎癥因子檢測(cè)

分離各組大鼠血液淋巴細(xì)胞，將濃度調(diào)整為1×106個(gè)/mL，取100μL淋巴細(xì)胞懸液分別與CD3和CD4、CD3和CD8的抗體組合孵育。樣品在室溫下黑暗處孵育20 min，PBS洗滌兩次后，使用流式細(xì)胞儀測(cè)定每個(gè)樣本1×104個(gè)淋巴細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，分析CD3+、CD4+和CD8+比例。

肺泡灌洗液炎癥因子的檢測(cè)，按照IL-1β、TNFα和IL-6 ELISA試劑盒含量檢測(cè)說(shuō)明書(shū)操作。

1.5 Western blot檢測(cè)NF-κB蛋白表達(dá)

按照說(shuō)明書(shū)分別提取肺組織細(xì)胞核、細(xì)胞漿蛋白。BCA法測(cè)定蛋白含量，煮沸變性后，取40μg蛋白上樣，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，將膜室溫封閉1 h，一抗NF-κB P65、磷酸化p-P65、GAPDH和Lamin B1均為1∶1 000稀釋，4℃過(guò)夜，二抗(1∶5 000稀釋)孵育1 h，洗滌后ECL化學(xué)發(fā)光顯影，Azure成像系統(tǒng)檢測(cè)條帶，利用Image J1.52V軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行測(cè)定，與對(duì)應(yīng)內(nèi)參比較后，計(jì)算相對(duì)值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)

使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，各組數(shù)據(jù)用±s表示，當(dāng)多組間方差齊時(shí)，使用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STS對(duì)染毒后大鼠肺功能的影響

如表1所示，與對(duì)照組相比，模型組呼吸f值和Penh值均明顯升高(P＜0.01)；與模型組相比，丹參酮ⅡA磺酸鈉組和地塞米松組呼吸f值的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而被迫呼吸間隙Penh值均降低(P＜0.05或P＜0.01)；另外，丹參酮ⅡA磺酸鈉組和地塞米松組間f值和Penh的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠肺功能變化(n=6，±s)

表1 各組大鼠肺功能變化(n=6，±s)

與對(duì)照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01.

組別對(duì)照組模型組丹參酮ⅡA磺酸鈉組地塞米松組呼吸頻率/(次/min)251.31±22.91 286.29±14.23**269.80±19.19 266.53±13.91被迫呼吸間隙0.43±0.08 0.62±0.13**0.46±0.04##0.50±0.09#

2.2 STS對(duì)染毒后大鼠外周血淋巴細(xì)胞的影響

如表2所示，各組大鼠外周血淋巴細(xì)胞CD3+、CD8+細(xì)胞百分率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與對(duì)照組比較，模型組CD4+細(xì)胞百分率降低(P＜0.01)，CD4+/CD8+比值降低(P＜0.05)；相較于模型組，丹參酮ⅡA磺酸鈉組和地塞米松組CD4+細(xì)胞百分率均升高(P＜0.01)，CD4+/CD8+比值亦升高(P＜0.01或P＜0.05)，但丹參酮ⅡA磺酸鈉組和地塞米松組間CD4+細(xì)胞百分率和CD4+/CD8+比值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 各組大鼠外周血中T淋巴細(xì)胞亞群比較(n=6，±s)

表2 各組大鼠外周血中T淋巴細(xì)胞亞群比較(n=6，±s)

與對(duì)照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01.表格中CD4+數(shù)據(jù)方差不齊，采用非參數(shù)檢驗(yàn)，其他數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析.

組別對(duì)照組模型組丹參酮ⅡA磺酸鈉組地塞米松組CD3+/%64.71±3.92 61.81±3.49 65.95±4.02 62.25±1.85 CD4+/%31.05±2.65 23.20±1.63**33.40±3.98##27.82±2.38##CD8+/%25.25±3.44 23.02±2.62 24.02±2.84 23.82±1.90 CD4+/CD8+1.25±0.18 1.02±0.14*1.36±0.26##1.17±0.09#

2.3 STS對(duì)大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子IL-1β、TNF-α及IL-6的影響

如表3所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-α和IL-6濃度升高(P＜0.01)；與模型組相比，丹參酮ⅡA磺酸鈉組和地塞米松組IL-1β、TNF-α和IL-6濃度均降低(P＜0.01或P＜0.05)，但丹參酮ⅡA磺酸鈉組和地塞米松組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表3 各組大鼠炎癥因子IL-1β、TNF-α及IL-6的表達(dá)(n=6，±s)

表3 各組大鼠炎癥因子IL-1β、TNF-α及IL-6的表達(dá)(n=6，±s)

與對(duì)照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01.

組別對(duì)照組模型組丹參酮ⅡA磺酸鈉組地塞米松組IL-1β/(ng/L)33.79±4.99 41.72±3.04**35.83±2.77#34.37±3.77##TNF-α/(ng/L)278.64±34.25 359.43±36.22**310.95±30.64#305.82±30.35#IL-6/(ng/L)146.39±18.24 182.21±15.64**156.86±16.05#153.44±17.23#

2.4 STS對(duì)NF-κB P65和p-P65蛋白表達(dá)的影響

如圖1所示，與對(duì)照組相比，模型組肺細(xì)胞漿中P65含量降低(P＜0.01)，細(xì)胞核中p-P65含量升高(P＜0.01)；與模型組相比，丹參酮ⅡA磺酸鈉組和地塞米松組細(xì)胞漿中P65含量升高(P＜0.05)，細(xì)胞核中p-P65含量降低(P＜0.01)；另外，丹參ⅡA磺酸鈉組和地塞米松組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

圖1 各組大鼠肺細(xì)胞漿和細(xì)胞核中NF-κB P65和p-P65蛋白表達(dá)(n=3)

3 討論

大氣PM2.5引起的非傳染性疾病已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[12-13]，因此PM2.5對(duì)機(jī)體的損傷機(jī)制和干預(yù)方法的探索成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。本研究采取大鼠氣管滴注染毒法造模，并對(duì)STS的干預(yù)作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。

在研究PM2.5對(duì)肺部影響時(shí)，肺功能指標(biāo)是一項(xiàng)直觀的數(shù)據(jù)，有報(bào)道表明人類長(zhǎng)期吸入細(xì)顆粒物會(huì)引起呼吸功能下降，造成肺部損傷[14-15]。本研究采用無(wú)創(chuàng)WBP法對(duì)大鼠肺功能進(jìn)行檢測(cè)，相比于有創(chuàng)檢測(cè)法，該方法操作較簡(jiǎn)便，動(dòng)物始終保持清醒狀態(tài)，減少了手術(shù)和麻醉對(duì)指標(biāo)的影響，且不影響后續(xù)其他指標(biāo)的檢測(cè)。當(dāng)大鼠出現(xiàn)肺泡壁增厚、肺泡腔減小、肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺間質(zhì)纖維化等病理改變時(shí)，f和Penh數(shù)值增加，提示肺部通氣不足，氣道阻力增加，且與炎癥程度相關(guān)[16-17]。本課題組前期結(jié)果表明STS能改善PM2.5染毒后大鼠肺組織炎性病理改變[11]，本研究結(jié)果顯示模型組大鼠f和Penh增加，而STS組和地塞米松組能改善PM2.5引起的肺功能下降，降低f和Penh，與前期病理研究改變結(jié)果一致。

血液T淋巴細(xì)胞亞群在正常機(jī)體中呈現(xiàn)相互作用，相互平衡，維持機(jī)體正常細(xì)胞免疫功能。研究[18]報(bào)道，吸入PM2.5導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)小鼠T淋巴細(xì)胞失衡，并使COPD加重。朱敏立等[19]發(fā)現(xiàn)空氣污染導(dǎo)致大鼠T淋巴細(xì)胞構(gòu)成異常。本研究中，與對(duì)照組相比，模型組大鼠染毒后CD4+細(xì)胞百分率降低，CD4+/CD8+比值降低；而與模型組相比，STS組通過(guò)升高CD4+細(xì)胞數(shù)，提高CD4+/CD8+比值改善PM2.5導(dǎo)致的T淋巴細(xì)胞亞群比例失衡，達(dá)到免疫平衡狀態(tài)，這與之前報(bào)道的STS具有免疫調(diào)節(jié)作用相一致[20-21]。而地塞米松組CD4+/CD8+比值與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群比例的作用不如STS，可能與地塞米松誘導(dǎo)免疫抑制有關(guān)。

由肺泡巨噬細(xì)胞釋放的IL-1β是PM2.5暴露后釋放的急性反應(yīng)細(xì)胞因子，與細(xì)胞表面受體結(jié)合后，激活JNK或p38通路，促進(jìn)TNF-α等細(xì)胞因子分泌[22]。TNF-α也是肺部炎癥的早期細(xì)胞因子之一，由肺泡巨噬細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞釋放，促進(jìn)循環(huán)中炎癥細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附[23]。IL-6主要來(lái)源于單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖分化、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等功能，通過(guò)自分泌或旁分泌的形式參與氣道和肺部炎癥的發(fā)生發(fā)展[24-25]。有研究[26]表明，PM2.5通過(guò)激活I(lǐng)KK/NF-κB信號(hào)途徑激活NF-κB P65，使其磷酸化為p-P65并進(jìn)入細(xì)胞核提高炎癥因子水平。PM2.5通過(guò)誘導(dǎo)自噬，增加P65磷酸化促進(jìn)炎癥因子表達(dá)[27]。此外，IL-1β和TNF-α能誘導(dǎo)抑制蛋白IκB的快速磷酸化和降解來(lái)誘導(dǎo)NF-κB快速核移位，通過(guò)反向調(diào)節(jié)進(jìn)一步從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)，加重肺部炎癥[28-29]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠經(jīng)PM2.5染毒后，肺泡灌洗液中炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6濃度與對(duì)照組相比明顯升高，細(xì)胞核內(nèi)p-P65蛋白含量增加，這與之前研究報(bào)道一致，而STS組和地塞米松組大鼠炎癥因子水平和核內(nèi)p-P65蛋白含量降低，說(shuō)明兩者能通過(guò)降低炎癥因子表達(dá)，抑制NF-κB P65激活，減輕肺部炎癥。

STS是從丹參根部提取的主要成分，具有丹參大部分藥效特性，且副作用小[30]。研究[31]表明STS可以減少腦動(dòng)脈閉塞大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放，通過(guò)減少NF-κB P65磷酸化降低神經(jīng)炎癥。李春陵等[32]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腹腔注射32 mg/(kg·d)STS，14 d后通過(guò)上調(diào)PPARγ蛋白表達(dá)，下調(diào)NF-κB蛋白表達(dá)，抑制氣道重塑因子TNF-α、IL-6水平，從而防止COPD大鼠氣道重塑。在課題組前期研究基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)肺功能、免疫功能和炎癥因子檢測(cè)，進(jìn)一步表明STS可能通過(guò)抑制NF-κB激活、降低炎癥因子表達(dá)、提高機(jī)體細(xì)胞免疫能力、減輕肺部炎癥從而改善肺功能。地塞米松作為常用的腎上腺皮質(zhì)激素，具有較好的抗炎效果，但是長(zhǎng)期使用對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制不容忽視。而多個(gè)臨床報(bào)告[33-34]表明，STS連續(xù)靜脈滴注4周用于治療冠心病等疾病時(shí)，未見(jiàn)嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)或并發(fā)癥。因此STS在PM2.5所致肺部炎癥多次給藥治療中具有一定的應(yīng)用前景。

綜上所述，STS可能通過(guò)抑制NF-κB激活，降低炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6表達(dá)，減輕PM2.5導(dǎo)致的大鼠肺部炎癥損傷，改善肺功能和免疫功能。本研究為明確STS對(duì)PM2.5致肺部炎癥損傷的干預(yù)作用提供了參考依據(jù)，但STS具體作用靶點(diǎn)，如何抑制NF-κB激活的上游因子，以及是否通過(guò)其他途徑調(diào)節(jié)機(jī)體損傷均有待進(jìn)一步研究。另外，可嘗試改變?nèi)径痉绞綖槿肀┞度径镜茸鞲钊胩接憽?/p>