結(jié)核分枝桿菌H37Ra感染的THP-1細(xì)胞TGF-β1、Smad2、Smad3、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)變化

王立楠，李艷寧，劉建，屈昱良，，郭樂，楊宗強(qiáng)，牛寧奎

1 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨科，銀川 750004；2 寧夏醫(yī)科大學(xué)；3 寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院寧夏臨床病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（MTB）感染導(dǎo)致的一類慢性傳染性疾病，據(jù)2020年全球結(jié)核病報(bào)告顯示，雖然結(jié)核病發(fā)病率在逐年下降，2018－2019年期間的結(jié)核病發(fā)病率較上一年減少了2.3%，但目前它仍是世界上十大死亡疾病原因之一，中國(guó)結(jié)核病患者總?cè)藬?shù)占全球結(jié)核病患者總?cè)藬?shù)的8.4%，位居世界第三位。因此，迄今為止，結(jié)核病還是我國(guó)重點(diǎn)防控的傳染病之一。當(dāng)MTB 通過呼吸道、破損的皮膚、消化道進(jìn)入患者體內(nèi)后，巨噬細(xì)胞作為人體內(nèi)最為重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，具有強(qiáng)大的吞噬能力，是機(jī)體抵御MTB進(jìn)入機(jī)體的第一道重要防線［1］。巨噬細(xì)胞吞噬MTB 后可啟動(dòng)凋亡、自噬等免疫相關(guān)機(jī)制清除和防御MTB，還可作為抗原提呈細(xì)胞啟動(dòng)T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答和B 細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答［2］。在結(jié)核病中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）是一類在結(jié)構(gòu)上相似的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，分為TGF-β1、TGF-β2 和TGF-β3 三種亞型［3］，其中75%為TGF-β1，由多種細(xì)胞產(chǎn)生，可發(fā)揮免疫抑制、抗炎、促進(jìn)成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集、組織損傷修復(fù)及骨組織的修復(fù)與重建等作用［4］。Smads 蛋白是TGF-β 家族從細(xì)胞膜受體到細(xì)胞核的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子［5］。TGFβ1 對(duì)下游信號(hào)通路的調(diào)控包括依賴于Smads 蛋白的經(jīng)典通路途徑和不依賴于Smads蛋白的非經(jīng)典通路途徑，其中經(jīng)典途徑為主要調(diào)控通路［6］。TGF-β1主要是通過Smad2/3 來發(fā)揮其抗炎作用，Smad2/3在TGF-β1/Smads 經(jīng)典信號(hào)通路中處于重要位置［7］。在結(jié)核病中，感染MTB 菌量不同引起的機(jī)體免疫反應(yīng)強(qiáng)弱也不同，TGF-β1/Smads經(jīng)典信號(hào)通路的激活程度是否與MTB感染的細(xì)菌量有關(guān)，被激活的TGFβ1/Smads 經(jīng)典通路主要在MTB 感染后的哪個(gè)時(shí)間階段發(fā)揮主要作用的研究甚少。2020年1月—2021年6月，本研究觀察了MTB H37Ra 在不同感染時(shí)間和不同感染復(fù)數(shù)下感染THP-1 細(xì)胞后TGF- β1/Smads 經(jīng)典信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因TGF-β1、Smad2、Smad3及炎癥因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）基因表達(dá)變化，為進(jìn)一步探究TGF-β1/Smads經(jīng)典信號(hào)通路在MTB感染的巨噬細(xì)胞中可能的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑、儀器及來源 THP-1 巨噬細(xì)胞、MTB H37Ra 均由本實(shí)驗(yàn)室液氮罐及-80 ℃冰箱保存；RPMI 1640 培 養(yǎng) 基 購(gòu) 自Biological Industries 公司；胎牛血清購(gòu)自Gemini 公司；羅氏改良培養(yǎng)基購(gòu)自賽諾特生物公司；TRIzol 試劑購(gòu)自Invitrogen 公司；基因序列從NCBI 網(wǎng)站Gene Bank 網(wǎng)站獲取，由NCBI Primer-BLAST 在線網(wǎng)站設(shè)計(jì)基因正反引物序列，由上海生工生物工程公司負(fù)責(zé)合成引物；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）試劑盒購(gòu)自大連寶生物TaKaRa 公司；熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司（Applied Biosystems 7600 系統(tǒng)）；雙光束紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)自北京普析通用儀器有限公司；超聲細(xì)胞粉碎機(jī)購(gòu)自寧波新藝超聲設(shè)備有限公司。

1.2 THP-1巨噬細(xì)胞、MTB H37Ra的培養(yǎng) 從液氮罐中取出THP-1 細(xì)胞，在37 ℃水浴中快速解凍細(xì)胞，在含有10% 胎牛血清（FBS）的RPMI1640 培養(yǎng)基、37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)和濃度，使用牛鮑計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，培養(yǎng)細(xì)胞濃度至1×106/mL時(shí)，接種細(xì)胞至6孔板中，每孔2 mL，然后加入終濃度為100 ng/mL佛波酯，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，THP-1 細(xì)胞由單個(gè)圓形細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樾螒B(tài)不規(guī)則，具有偽足的貼壁細(xì)胞，棄去六孔板中培養(yǎng)基，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗2 遍，每孔加入不含抗生素的10% FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基2 mL，待用。

從低溫-80 ℃冰箱中取出生長(zhǎng)在改良羅氏培養(yǎng)基表面的MTB H37Ra，移至生物安全柜進(jìn)行操作。在培養(yǎng)箱中解凍30 min，待培養(yǎng)基表面的菌落可被挑下時(shí)，挑取適量H37Ra 菌團(tuán)，轉(zhuǎn)移至高壓滅菌過的玻璃組織均漿器中，加入5 mL PBS，反復(fù)研磨均勻后，用巴氏吸管轉(zhuǎn)移至新的改良羅氏培養(yǎng)基斜面，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 周后，可見培養(yǎng)基斜面生長(zhǎng)散落的黃色菜花狀菌落，用接種環(huán)刮取長(zhǎng)勢(shì)良好的單個(gè)菌落的細(xì)菌，置于5 mL EP 管中，然后加入2 mL PBS；將EP 管置于冰上，用細(xì)胞超聲破碎儀將成團(tuán)的細(xì)菌處理為單個(gè)的菌，設(shè)置條件：功率5 W、工作15 s、停15 s，總時(shí)間5 min；超聲結(jié)束后200 g 10 min低速離心，吸取上層菌懸液轉(zhuǎn)移到新的5 mL EP 管中，使用紫外分光光度儀在OD600 波長(zhǎng)條件下，檢測(cè)H37Ra 菌懸液OD600 值，帶入公式CFU=3.26×107×OD600 + 6.89×105，計(jì)算得到H37Ra菌懸液濃度［8-9］，待用。

1.3 THP-1 細(xì)胞中MTB H37Ra 的加入方法 在前期處理好的THP-1 細(xì)胞中加入H37Ra 菌液（觀察組），根據(jù)六孔板中每孔THP-1細(xì)胞數(shù)量和感染復(fù)數(shù)（MOI）即細(xì)菌與細(xì)胞的比例加入相對(duì)應(yīng)量的H37Ra菌懸液，調(diào)整MOI 為1∶1、10∶1、100∶1（即MOI=1，10，100），繼續(xù)置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后更換新鮮的不含抗生素10% FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基2 mL，更換前用PBS 洗去未進(jìn)入THP-1 細(xì)胞內(nèi)的H37Ra，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h；在感染復(fù)數(shù)MOI=10 的條件下，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，在共培養(yǎng)6 h后更換新鮮的不含抗生素的10% FBS RPMI1640 培養(yǎng)基2 mL，然后繼續(xù)培養(yǎng)至12 h，24 h 后收集細(xì)胞。對(duì)照組均為未感染H37Ra的細(xì)胞。

1.4 MTB H37Ra 感染的THP-1 細(xì)胞中TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA、TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 檢測(cè) 采用qRT-PCR 法 根據(jù)共培養(yǎng)時(shí)間的不同，按時(shí)間棄去六孔板中培養(yǎng)基，用PBS清洗2～3遍，每孔加入1 mL TRIzol按照參考說明書步驟提取每孔中細(xì)胞總RNA，使用Nanodrop 2000檢測(cè)提取總RNA 的濃度及純度，確保OD260/OD280：1.8～2.4，OD260/OD230：1.5～2.4，濃度均大于50 ng/μL。總RNA 質(zhì)檢合格后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，使用StepOnePlus Real-Time PCR System、qRT-PCR 法檢測(cè)TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA、TNF- α mRNA、IL-6 mRNA。 TGF- β1 的 上 游 引物：5’GGACCAGTGGGGAAC ACTAC3’，下 游 引 物 序 列：5’AGAGTCCCTGCATCTCAGAGT3’，目標(biāo)片段大小為123 bp；Smad2 的上游引物：5’GATGCCTGTTGTTTGCCCAG3’，下游引物序列：5’TCTGCCAAAGTGACAGGTCC3’，目標(biāo)片段大小為138 bp；Smad3 的上游引物：5’TGCTGGTGACTGGATAGCAG3’，下游引物：5’GCTGCAAGGTGAAGATG TCA3’，目標(biāo)片段大小 為105 bp；TNF- α 的 上 游 引 物：5’CACAGTGAAGTGCTG GCAAC3’，下 游 引 物：5’GATCAAAGCTGTAGGCCCCA3’，目 標(biāo) 片 段 為75 bp；IL-6 的 上 游 引 物：5’GCTCCTGGTGTTGCCTGCTG3’，下游引物：5’GTTCTGAAGAGGTGAGTGGCTGTC3’，目標(biāo)片段大小為101 bp；GAPDH 的上游引物：5’CAGGAGGCATTGCTGATGAT3’，下游引物：5’GAAGGCTGGGG CTCATTT3’，目標(biāo)片段大小為138 bp。由上海生工生物公司合成。按20 μL 反應(yīng)體系在冰盒上依次添加以下試劑：10 μL TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）、0.8 μL PCR Forward Primer（10 μmol/L）、0.8 μL PCR Reverse Primer（10 μmol/L）、0.4 μL ROX Reference Dye（50×）、6 μL無酶水及2 μL cDNA；反應(yīng)條件：95 ℃30 s，95 ℃5 s、60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)，95 ℃15 s、60 ℃60 s、95 ℃15 s 1 個(gè)循環(huán)。每個(gè)標(biāo)本均設(shè)置3 個(gè)平行復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3 次。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行SW 檢驗(yàn)（Shapiro-Wilk），符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTB H37Ra 不同感染復(fù)數(shù)和不同感染時(shí)間感染 的THP-1 細(xì) 胞 中TGF- β1、Smad2 mRNA、Smad 3 mRNA 表達(dá) H37Ra 感染24 h 時(shí)，與空白對(duì)照比較，當(dāng)MOI=1、10 、100 時(shí)，TGF-β1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量先升高后降低，在MOI=10 時(shí)表達(dá)最高（P均＜0.05）；Smad2 mRNA 的相 對(duì) 表 達(dá) 量降 低（P均＜0.05）；Smad3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量升高（P均＜0.05）；TNF-α mRNA 和IL-6 MRNA 表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致，在MOI=1、10 時(shí)升高不明顯（P均＞0.05），MOI=100時(shí)升高（P均＜0.05），見表1。

表1 不同感染時(shí)間H37Ra感染THP-1細(xì)胞后TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA表達(dá)（±s）

表1 不同感染時(shí)間H37Ra感染THP-1細(xì)胞后TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA表達(dá)（±s）

感染時(shí)間0 h 6 h 12 h 24 h TGF-β1 mRNA 0.993 ± 0.1351.696 ± 0.2041.845 ± 0.2591.993 ± 0.317 Smad2 mRNA 1.017 ± 0.2270.008 ± 0.0010.010 ± 0.0030.011 ± 0.004 Smad3 mRNA 1.012 ± 0.18117.150 ± 0.27614.910 ± 0.1905.319 ± 0.079

H37Ra MOI=10 時(shí)，隨感染時(shí)間（T=6 h、12 h、24 h）延長(zhǎng)，TGF-β1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)（P均＜0.05）；Smad2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量呈降低趨勢(shì)（P均＜0.05）；Smad3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量呈先升 高 后 降 低 趨 勢(shì)，在T=6 h 最 高（P均＜0.05）；TNF-α mRNA 和IL-6 MRNA 表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致，呈先升高后降低趨勢(shì)，在T=12 h 時(shí)最高（P均＜0.05），詳見表2。

表2 不同MOI H37Ra感染THP-1細(xì)胞后TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA表達(dá)（±s）

表2 不同MOI H37Ra感染THP-1細(xì)胞后TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA表達(dá)（±s）

MOI 01 10 100 TGF-β1 mRNA 0.993 ± 0.1351.282 ± 0.0611.876 ± 0.2531.008 ± 0.310 Smad2 mRNA 1.017 ± 0.2270.011 ± 0.0030.012 ± 0.0020.010 ± 0.002 Smad3 mRNA 1.012 ± 0.1814.872 ± 0.0284.912 ± 0.7877.594 ± 0.880

2.2 MTB H37Ra 不同MOI 和不同感染時(shí)間感染的THP-1細(xì)胞中TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 表達(dá) 感染24 h時(shí)，觀察組MOI=1時(shí)，TNF-α mRNA、IL-6 mRNA分別為5.628 ± 1.033、5.718 ± 1.335；MOI=10 時(shí)，TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 分別為5.045 ± 0.109、5.016 ± 0.853；MOI=100 時(shí)，TNF- α mRNA、IL-6 mRNA 分 別 為39.210 ± 6.396、48.440 ±13.550。 對(duì)照組TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 分別為1.025 ± 0.277、1.054 ± 0.413。隨著MOI 的升高，觀察組TNF-α mRNA 和IL-6 mRNA 表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致，在MOI=1、10時(shí)升高不明顯（P＞0.05），MOI=100時(shí)升高（P＜0.05）。

在MOI=10 時(shí)，不同感染時(shí)間（T=6 h、12 h、24 h），觀察組TNF-α mRNA 分別為13.400 ± 2.386、19.950 ± 2.925、5.066 ± 0.434，IL-6 mRNA 分別為13.760 ± 2.484、19.950 ± 1.374、4.931 ± 0.789。H37Ra MOI=10 時(shí)，隨感染時(shí)間延長(zhǎng)，TNF-α mRNA和IL-6 MRNA 表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致，呈先升高后降低趨勢(shì)，在T=12 h時(shí)最高（P＜0.05）。

3 討論

MTB 是一種嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生菌，當(dāng)MTB 通過呼吸道、腸道、破損的皮膚等途徑侵入機(jī)體后，巨噬細(xì)胞是其主要的宿主細(xì)胞，而巨噬細(xì)胞作為人體固有免疫的第一道防線，既可以通過自噬、凋亡和炎性小體等作用機(jī)制殺滅MTB，也可以作為抗原提呈細(xì)胞加工提呈抗原啟動(dòng)獲得性免疫應(yīng)答，巨噬細(xì)胞在識(shí)別分枝桿菌細(xì)胞壁成分后被誘導(dǎo)分泌TNF-α 和IL-6等因子調(diào)控免疫反應(yīng)［10-12］，TNF-α是一種促炎細(xì)胞因子，可以激活巨噬細(xì)胞，招募它們到感染部位，并調(diào)控結(jié)核肉芽腫的形成［13］，導(dǎo)致組織壞死和空腔的形成［14］。IL-6 是一種單鏈糖蛋白細(xì)胞因子，能促進(jìn)T 細(xì)胞和B 細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)和增殖［15］，從而提高機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫作用。

MTB 在一定條件下會(huì)發(fā)生免疫逃逸，在宿主細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期潛伏存活，并且把巨噬細(xì)胞作為其逃避機(jī)體免疫清除機(jī)制的一個(gè)重要屏障，避免被殺傷而滯留在巨噬細(xì)胞內(nèi)，這些潛伏的MTB 會(huì)隨著機(jī)體免疫力的變化隨時(shí)啟動(dòng)開始生長(zhǎng)，導(dǎo)致結(jié)核病的復(fù)燃，直接影響著結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及轉(zhuǎn)歸。在MTB 定植于身體某個(gè)部位導(dǎo)致結(jié)核病的發(fā)病時(shí)，結(jié)核性肉芽腫是診斷結(jié)核的主要病理特征之一［16］，而巨噬細(xì)胞是結(jié)核性肉芽腫中最豐富的細(xì)胞類型，在組織中的結(jié)節(jié)、硬化及干酪樣壞死中起關(guān)鍵作用，結(jié)核性肉芽腫中巨噬細(xì)胞極化的類型與肉芽腫的形成密切相關(guān)，巨噬細(xì)胞分化途徑的不同是肉芽腫內(nèi)病原菌是否播散的原因之一［17］。結(jié)核性肉芽腫的過度產(chǎn)生會(huì)緊緊包裹MTB，一方面防止了MTB 的播散，但也會(huì)使其逃避抗結(jié)核免疫，無法被機(jī)體免疫細(xì)胞發(fā)現(xiàn)和清除，MTB 長(zhǎng)期存在于結(jié)核性肉芽腫中，處于休眠狀態(tài)；當(dāng)宿主免疫力降低時(shí)，MTB 也會(huì)再次開始繁殖、生長(zhǎng)導(dǎo)致結(jié)核病的復(fù)發(fā)、再燃，TGF-β 是形成結(jié)核性肉芽腫的關(guān)鍵基因［18］。早期肉芽腫和晚期肉芽腫中的多核巨細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞均有不同程度的TGF-β1 表達(dá)［18］。

在結(jié)核免疫反應(yīng)過程中，TGF-β1 可通過抑制T淋巴細(xì)胞的激活、抑制T 淋巴細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡，降低單核巨噬細(xì)胞活性，降低其吞噬結(jié)核分枝桿菌的能力，從而降低人體對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的抵抗力［18］。結(jié)核性肉芽腫是結(jié)核病主要的病理特征之一，巨噬細(xì)胞是結(jié)核性肉芽腫中最豐富的細(xì)胞類型，TGF-β1 是影響結(jié)核性肉芽腫形成的關(guān)鍵基因［19］，早期肉芽腫和晚期肉芽腫中的多核巨細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞均有不同程度的TGF-β1 表達(dá)［20］。Smads 是TGF-β 家族從細(xì)胞膜受體到細(xì)胞核的重要胞內(nèi)作用分子［21-22］，TGF-β與胞膜表面的TGF-βRⅡ受體結(jié)合進(jìn)一步使TGF-βRⅠ募集［23］，使其下游的Smad2 和Smad3磷酸化并與Smad4形成異寡聚物復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［24-26］。TNF-α 可由巨噬細(xì)胞內(nèi)源性分泌，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用［27］；IL-6 可抑制由MTB 感染引起的巨噬細(xì)胞自噬，其分泌量增加有利于MTB抑制機(jī)體先天性免疫應(yīng)答［28］。

在本研究中，我們利用MTB H37Ra 在不同MOI及不同感染時(shí)間條件下感染THP-1 巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TGF- β1 mRNA 表 達(dá) 均 明 顯 升 高，在MOI=10 時(shí)，TGF-β1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量最高，MOI=100 時(shí)，相對(duì)表達(dá)量下降，且發(fā)現(xiàn)已誘導(dǎo)貼壁的THP-1 巨噬細(xì)胞一半數(shù)量發(fā)生死亡，而MOI=10的THP-1巨噬細(xì)胞狀態(tài)良好，考慮菌量過多導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此本研究在做不同時(shí)間感染模型時(shí)我們選擇了MOI=10。在感染24 h 內(nèi)，TGF-β1 mRNA 表達(dá)呈現(xiàn)出時(shí)間依懶性，在隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)水平持續(xù)升高，已有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可降低巨噬細(xì)胞表面受體活性［29］，降低其吞噬功能［30］，誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞發(fā)生凋亡［31］，抑制CD8+T 細(xì)胞功能［32］，有利于MTB 逃避機(jī)體固有免疫和獲得性細(xì)胞免疫系統(tǒng)的殺傷，在機(jī)體內(nèi)存活和繁殖。Smad2 和Smad3 作為TGF-β1 信號(hào)通路下游細(xì)胞內(nèi)的主要作用因子，當(dāng)MOI ＞1 時(shí)，Smad 2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低，但Smad3 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高，MOI 值越大表達(dá)量越多，且在MOI=10感染6 h 時(shí)表達(dá)量最高，之后逐漸下降，因此我們推測(cè)在H37Ra感染THP-1后，激活TGF-β信號(hào)通路，早期通過激活經(jīng)典通路上調(diào)Smad3 mRNA 的表達(dá)，抑制Smad2 mRNA 的表達(dá)從而發(fā)揮免疫調(diào)控作用，晚期可能通過非經(jīng)典通路抑制機(jī)體對(duì)MTB 的免疫反應(yīng)。已有研究發(fā)現(xiàn)，在BCG 感染的THP-1 巨噬細(xì)胞中，TGF-β1 呈現(xiàn)高表達(dá)［33］，且ROSAS-TARACO 等發(fā)現(xiàn)沉默小鼠肺內(nèi)TGF-β1 基因可提高小鼠對(duì)MTB 的免疫能力，降低小鼠肺內(nèi)MTB 數(shù)量，增加肺組織中TNF-α的表達(dá)，在感染早期可減輕肺組織的纖維化。TGF-β信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫均有抑制作用，通過下調(diào)TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-12 以及IL-6 等炎癥因子的表達(dá)發(fā)揮免疫抑制作用［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，TNF- α mRNA 和IL-6 mRNA 在MOI=100 感 染24 h后相對(duì)表達(dá)量均明顯高于MOI=1、10，說明在一定范圍內(nèi)感染MTB 數(shù)量越多巨噬細(xì)胞免疫反應(yīng)越強(qiáng)烈，分泌更多的促炎因子。在不同感染時(shí)間組中，感染12 h時(shí)TNF-α mRNA和IL-6 MRNA相對(duì)表達(dá)量最高，24 h 時(shí)明顯下降，TNF-α 可促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡，而在12 h 后MTB 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞早期凋亡情況已經(jīng)趨于穩(wěn)定，晚期凋亡和壞死的細(xì)胞在減少，MTB感染機(jī)體后12～24 h 時(shí)間段是MTB 發(fā)揮逃逸作用的關(guān)鍵時(shí)期；IL-6 可誘導(dǎo)T 細(xì)胞成熟，T 細(xì)胞為主的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)是機(jī)體清除MTB 的主要途徑，IL-6 晚期表達(dá)下降會(huì)抑制T 細(xì)胞成熟，導(dǎo)致T 細(xì)胞無法殺傷結(jié)核菌或受結(jié)核菌感染的細(xì)胞，這也可能是導(dǎo)致MTB慢性感染的原因之一。

綜上所述，相同感染時(shí)間，隨著MOI 值增加，結(jié)核分枝桿菌H37Ra 感染的THP-1 巨噬細(xì)胞中TGFβ1 mRNA 表達(dá)先上調(diào)后降低，Smad2 mRNA 表達(dá)下調(diào)，Smad3 mRNA 表 達(dá) 上 調(diào)，TNF- α mRNA、IL-6 mRNA 相對(duì)表達(dá)量在MOI=100 時(shí)升高；MOI=10時(shí)，隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，結(jié)核分枝桿菌H37Ra 感染的THP-1 巨噬細(xì)胞中TGF-β1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量升高，Smad2 mRNA 表達(dá)下調(diào)，Smad3 mRNA 表達(dá)先升高，6 h 后降低，TNF-α mRNA 和IL-6 mRNA 表達(dá)早期上調(diào)，12 h 后降低。說明結(jié)核分枝桿菌感染的細(xì)菌量與TGF-β1/Smads 經(jīng)典信號(hào)通路的激活程度有關(guān)，結(jié)核分枝桿菌感染后的12 h 內(nèi)TGF-β1/Smads經(jīng)典信號(hào)通路發(fā)揮主要作用。但由于實(shí)驗(yàn)室生物安全條件限制，本研究使用MTB H37Ra 弱毒株感染THP-1 巨噬細(xì)胞與MTB H37Rv 強(qiáng)毒株存在一定差異，其次只在mRNA水平進(jìn)行了研究，缺少在轉(zhuǎn)錄后蛋白水平的進(jìn)一步驗(yàn)證。