固載乳酸菌發(fā)酵中藥槐角研究

金爽，白雪，許雯惠，陳威沛，呂晨，程玉鵬，崔喆，匡海學(xué)

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

槐角(Fructus Sophorae)為豆科植物槐的果實，作為一味常用的中藥，可止血涼血、清熱瀉火，性苦、寒，歸肝，大腸經(jīng)。槐角中富含黃酮類和異黃酮類化合物，如染料木素、染料木苷、槐角苷、槐角雙苷等[1-3]。其中，染料木素等異黃酮類化合物是槐角中最主要的成分和標志性活性物質(zhì)[4-6]。眾所周知，染料木素具有雌性激素及抗雌性激素性質(zhì)，可以抑制拓撲異物酶Ⅱ的活性和酪氨酸蛋白激酶PTK的活性，因其抑菌、降血脂、抗氧化等作用已成為國際上的研究和開發(fā)熱點。微生物轉(zhuǎn)化具有較高的立體選擇性、基團選擇性和區(qū)域選擇性。與化學(xué)反應(yīng)相比，具有反應(yīng)條件溫和、后處理簡單、污染小、成本低等優(yōu)點。近年來，隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵炮制的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究得以大力發(fā)展，但傳統(tǒng)的微生物轉(zhuǎn)化炮制主要以真菌為主，其效果雖好，安全性有待考量。益生菌作為研究熱點一直備受關(guān)注，應(yīng)用益生菌對中藥材進行發(fā)酵炮制也逐步成為研究的熱點[7-9]。乳酸菌作為代表性的益生菌以其無毒并具有獨特的生理功效受到了國內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注，通過乳酸菌發(fā)酵中藥擁有廣闊的發(fā)展前景[10]。

本文對槐角提取物中染料木素的含量進行了測定，以乳酸菌發(fā)酵炮制槐角后染料木素的含量為衡量指標，通過對pH、溫度和料液比等影響因素進行了單因素考察試驗，并結(jié)合中心組合設(shè)計試驗和固載微生物技術(shù)，采用固載乳酸菌發(fā)酵處理中藥槐角，對槐角的最佳發(fā)酵條件進行初步研究，優(yōu)化出最佳的發(fā)酵條件，并對槐角乳酸菌轉(zhuǎn)化發(fā)酵生產(chǎn)染料木素過程進行研究，同時考察發(fā)酵過程中總黃酮的含量變化，為乳酸菌發(fā)酵炮制中草藥領(lǐng)域的進一步深入研究探索及相關(guān)開發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料

槐角購自黑龍江省哈爾濱市藥材市場，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院蘇連杰教授鑒定為藥典收載品種；乳酸乳球菌購自黑龍江省微生物研究所；HZQ-C空氣浴振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；BPH-9162精密恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；其他試劑均為市售分析純。

2 方法

2.1 固載乳酸乳球菌菌液的制備

向培養(yǎng)好的乳酸乳球菌培養(yǎng)皿中加入20 mL滅菌后的蒸餾水，將菌種用接種環(huán)輕輕刮下，混合均勻備用。

2.2 固載乳酸乳球菌菌球制備

室溫下，取3 mL均勻乳酸乳球菌菌液加入到6 mL濃度為5%的海藻酸鈉溶液中，用注射器量取混合液滴入到3%氯化鈣溶液中，迅速攪拌，制成直徑約為5 mm的菌球，形成形狀完好的菌球后靜置2 h，用無菌水沖洗3次得到固載菌球。

2.3 發(fā)酵基質(zhì)的制備

將槐角研粉碎后過80目篩，稱取1 g槐角粉末投到含有50 mL無糖馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，121 ℃條件下高壓滅菌30 min，制備得到發(fā)酵基質(zhì)，備用。

2.4 固載乳酸菌發(fā)酵過程

將制備得到的固載乳酸乳球菌球投入到發(fā)酵基質(zhì)后，在37 ℃恒溫條件下進行搖床培養(yǎng)。

2.5 發(fā)酵中藥槐角后染料木素的提取

將培養(yǎng)后的槐角和固載乳酸乳球菌用濾紙過濾，使發(fā)酵液與槐角和固載乳酸乳球菌分離。將發(fā)酵液旋轉(zhuǎn)蒸干，加入適量80%乙醇，超聲后得到溶解液。然后，再向過濾分離得到的槐角和固載球菌中加入適量80%乙醇溶液，超聲提取30 min，濾紙過濾，重復(fù)提取2次，合并提取液，且將上述溶解液和提取液合并，旋轉(zhuǎn)蒸干，加入80%乙醇定容至50 mL，于12 000 r/min離心以備用。

2.5.1 標準曲線的制備

精密稱取蘆丁對照品，加入乙醇，置于水浴溶解，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得蘆丁標準品溶液(蘆丁含量為0.2 mg/mL)。吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL蘆丁標準溶液，分別置于10 mL容量瓶內(nèi)，加入30%乙醇至2 mL，再加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL放置8 min，加入10 %硝酸鋁溶液0.5 mL放置8 min，分別加入4 %氫氧化鈉溶液4.0 mL，定容后搖勻，放置15 min。以0 mL的容量瓶內(nèi)試劑為空白，在510 nm波長處測定吸光度。以蘆丁濃度作為橫坐標，吸光度為縱坐標制作標準曲線，求得回歸方程。

2.5.2 樣品溶液的制備

取實驗樣品，揮干溶劑，量取3 mL無水乙醇于10 mL容量瓶，加蒸餾水定容后，用等體積石油醚依次萃取，脫脂、脫色素，取水層用于總黃酮的含量測定。

2.6 發(fā)酵中藥槐角后染料木素的檢測

測定在不同pH值(4.0、5.0、5.5、6.0、7.0)、不同時間(12、24、36、48、60 h)、以及不同液料比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 mL/g)下中藥槐角炮制后發(fā)酵體系中染料木素的含量，確定槐角的最佳發(fā)酵條件。

2.7 中心組合設(shè)計法優(yōu)化發(fā)酵體系條件

根據(jù)2.6發(fā)酵中藥槐角后染料木素的檢測中單因素優(yōu)化的試驗結(jié)果，選擇對該體系中有顯著作用的3個因素，采用中心組合法進行3因素3水平試驗，并結(jié)合響應(yīng)面法對試驗進行進一步優(yōu)化，研究這3個因素不同水平下的組合對炮制槐角發(fā)酵體系中染料木素含量的影響。

3 結(jié)果

3.1 固載乳酸菌發(fā)酵炮制槐角色譜相圖

槐角原藥材中染料木素含量為(6.53±0.06)mg/g，經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化為(18.93±0.47)mg/g，可達原藥材的2.90倍，見圖1。

注：A.中藥槐角原藥材；B.中藥槐角經(jīng)固載乳酸菌炮制后。

3.2 固載乳酸菌發(fā)酵總黃酮的變化分析

據(jù)分析，得到標準曲線為y=1.221 4x-0.019 2(R=0.998)，總黃酮含量原藥材為(74.00±0.42)mg/g，發(fā)酵36 h時總黃酮含量可達(122.00±0.56)mg/g，見表1。

表1 乳酸菌發(fā)酵槐角前后總黃酮含量變化

3.3 固載乳酸菌發(fā)酵體系單因素優(yōu)化

本試驗對固載乳酸菌槐角發(fā)酵體系的條件進行了單因素優(yōu)化，考察了pH值、時間、液料比3個因素，試驗結(jié)果見表2～4。

表2 不同pH發(fā)酵槐角前后染料木素含量變化

由表2可得，pH值對發(fā)酵過程有較大的影響，當發(fā)酵基質(zhì)的pH值為5.0時，槐角體系中的染料木素含量達到最大值6.24 mg/g。pH 在4.0～5.0時，槐角體系中染料木素的含量逐漸增加，而pH在5.5～7.0時，染料木素的含量開始下降。pH作為微生物在一定環(huán)境條件下代謝活動的綜合指標，對菌體的生長和產(chǎn)品的積累有很大的影響，上述發(fā)生的變化取決于菌種的特性和產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)，而pH值的變化會影響酶活力的改變，以致影響產(chǎn)物的合成，但pH值過高會使酶失活而無法發(fā)揮其活性，從而導(dǎo)致生成產(chǎn)物的含量降低。

將該體系放置在pH值為5.0的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測定不同的發(fā)酵時間染料木素的含量。由表3可知，當發(fā)酵基質(zhì)的發(fā)酵時間為36 h時，槐角體系中的染料木素含量達到最大值11.73 mg/g。時間在12.0～36.0 h范圍內(nèi)，槐角體系中染料木素的含量逐漸增加，而在48～72 h時，染料木素的含量逐漸降低。這是因為在發(fā)酵過程中存在最適發(fā)酵時間，發(fā)酵時間過短發(fā)酵不完全，過長則損失更多的營養(yǎng)，導(dǎo)致降剩下的量顯著降低，從而影響染料木素的含量。

表3 不同發(fā)酵時間發(fā)酵槐角前后染料木素含量變化

將納豆菌發(fā)酵槐角體系放到按照不同的液料比配制好的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，由表4可知，液料比對發(fā)酵過程影響頗大，當發(fā)酵基質(zhì)的液料比為25 mL/g時，槐角體系中的染料木素含量達到最大值為18.93 mg/g。液料比在15.0∶1～5.0∶1 mL/g范圍內(nèi)，染料木素的含量逐漸增加，而在25∶1～35∶1 mL/g時，染料木素的含量逐步下降。分析出現(xiàn)上述的原因是合適的培養(yǎng)基給細胞提供了充足的氧氣，而培養(yǎng)基的配比過量會影響酶的活性，使其活性降低。

表4 不同液料比發(fā)酵槐角前后染料木素含量變化

3.4 中心組合設(shè)計法優(yōu)化固載乳酸菌發(fā)酵槐角條件

按照單因素試驗結(jié)果，選擇pH(A)、液料比(B)和發(fā)酵時間(C)作為中心組合設(shè)計的三個優(yōu)化因素，具體見表5、表6和表7。

表5 中心組合試驗因素與水平表

表6 中心組合試驗設(shè)計方案與結(jié)果

表7 二次中心組合設(shè)計方差分析表

選擇中心組合法對固載乳酸菌發(fā)酵槐角的條件進行響應(yīng)面試驗，繼而應(yīng)用相關(guān)的軟件對結(jié)果進行回歸分析和方差分析(表 5、6)，用槐角體系中染料木素的含量作響應(yīng)值(Y)，自變量為pH值、發(fā)酵時間、液料比的二次多元回歸方程：Y=18.82-0.022A+0.68B+1.02C-0.030A×B-0.012A×C+0.24B×C-0.75A2-1.40B2-0.78C2

據(jù)表7可得，P<0.000 1，說明差異極顯著；而模型失擬項是表示模型中的理論值與實際值不相擬合的概率，本部分中的失擬P=0.0515>0.05，說明模型的失擬度不顯著。

如圖2(a～c)，隨意兩個交互因素的響應(yīng)面都有最高值。據(jù)分析，發(fā)酵時間和料液比對發(fā)酵槐角的影響較大，而pH值的影響相對較小。通過軟件分析，最佳發(fā)酵工藝為：發(fā)酵時間為36 h、pH 5.0、料液比為25∶1(mL/g)，在此條件下發(fā)酵槐角得到的染料木素含量為(18.93±0.47)mg/g，是原藥材的2.90倍，而最優(yōu)條件下的總黃酮含量為(122.00±0.56)mg/g。

注：a.pH和液料比響應(yīng)面圖；b.pH和發(fā)酵時間響應(yīng)圖；c.液料比和發(fā)酵時間響應(yīng)圖。

4 討論

本研究以槐角中總黃酮含量和染料木素含量為指標，對固載乳酸菌炮制槐角發(fā)酵體系進行了研究，在單因素試驗的基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面法，對固載乳酸菌發(fā)酵槐角的條件進一步優(yōu)化，得到槐角最佳的發(fā)酵條件為pH 5.0，液料比25∶1(mL/g)，發(fā)酵時間36 h，發(fā)酵后得到最優(yōu)染料木素含量為(18.93±0.47)mg/g，是原藥材的2.90倍，而最優(yōu)條件下總黃酮為(122.00±0.56)mg/g，遠高于未處理時槐角原藥材的含量。

該研究將益生菌微生物轉(zhuǎn)化與固載技術(shù)結(jié)合發(fā)酵炮制中藥槐角，消除了傳統(tǒng)炮制方法的弊端，研究結(jié)果為槐角的進一步的開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)，為創(chuàng)新技術(shù)的發(fā)展提供了依據(jù)。