喙尾琵琶甲有效成分的藥理活性及其作用機(jī)理的研究進(jìn)展

孔彩華，李萬(wàn)輝，王欽，劉克娜，隋世燕，*

(1.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南 大理 671003；2.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 大理 671000)

喙尾琵琶甲(Blapsrynchopeterafairmaire)屬于鞘翅目(Coleop-tera)擬步甲科(Tenebrionidae)琵琶甲屬(Blaps)，為中國(guó)西南地區(qū)(云貴高原)的一種攜帶臭味的昆蟲(chóng)，大多分布在云南滇中、滇東高原[1]。當(dāng)?shù)厝朔Q其為小黑蟲(chóng)、臭殼殼蟲(chóng)和打屁蟲(chóng)等。該蟲(chóng)開(kāi)始被命名為日本琵琶甲云南亞種，后來(lái)為了方便又被稱為“云南琵琶甲”，2007年經(jīng)專家鑒定為喙尾琵琶甲[2]。喙尾琵琶甲營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，含有除色氨酸外的7種人體必需氨基酸，總量達(dá)到248 mg/g，此外，蛋白含量為10.12%，脂肪含量為10.51%，具有高蛋白和低脂肪的特點(diǎn)[3]。

喙尾琵琶甲蟲(chóng)體體內(nèi)有多種有效活性成分，主要為酚類化合物、環(huán)肽和氨基酸類化合物、油脂等，蟲(chóng)體防御液及甲殼素中也含有有效活性成分[4]。此種昆蟲(chóng)在云南民間，特別是被云南彝族百姓作為藥物應(yīng)用較多。當(dāng)?shù)厝藢⑵浠铙w成蟲(chóng)經(jīng)飲用酒或酒精制成藥酒外敷，以驅(qū)除瘡中毒素及水泡引起的痛癢，還用該蟲(chóng)治療疔瘡、皮膚癢痛、皰疹、腰酸背痛、腰椎間盤(pán)突出等，效果顯著；蘸取蟲(chóng)體粉碎物于牙齒蛀洞內(nèi)或開(kāi)水口服，可治療牙痛、齲齒痛，還可以治療感冒引起的發(fā)燒[2]。此外，與黑骨頭、石巖菜、重樓等一起用水煎服可治療小兒麻痹；與鮮嫩木賊研碎后和鮮雞脯爆炒與稀飯共服，對(duì)晚期肝癌患者有顯著效果；放入雞蛋蒸熟后一起食用可以治療乳腺癌；而與金果攬、壁虎研碎開(kāi)水送服以治療食道癌等[2]。

喙尾琵琶甲在治療各種疾病疼痛中表現(xiàn)出顯著的藥理作用，具有較大的藥用價(jià)值和潛在的開(kāi)發(fā)利用前景。但是，其發(fā)揮藥理作用的具體有效成分仍然不清楚，作用機(jī)理有待深入研究。本文就喙尾琵琶甲不同溶劑萃取所含活性成分、藥理活性及其作用機(jī)制進(jìn)行綜述，并分析總結(jié)，旨在為將來(lái)對(duì)該藥用昆蟲(chóng)進(jìn)行深入研究和開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 藥理活性

1.1 抗菌、抑菌活性

施貴榮等[5]先后研究了喙尾琵琶甲乙醇提取后不同極性溶劑萃取以及石油醚脫脂后甲醇和水提取物的抗菌活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其乙醇提取物對(duì)引起化膿性疾病的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌活性，甲醇提取物及水提物對(duì)金黃色、白色葡萄球菌均具有較強(qiáng)的抑制作用，但對(duì)痢疾桿菌效果不顯著，甲醇提取物的抗菌作用高于水提物；另外，乙酸乙酯和丙酮萃取物對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌均具有明顯的抑制效果，但前者高于后者，并且前者對(duì)白色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)。

研究發(fā)現(xiàn)，喙尾琵琶甲幼蟲(chóng)全蟲(chóng)勻漿無(wú)抑菌作用，但通過(guò)0.1%三氟乙酸提取，凝膠色譜分離純化得到的抗菌肽(分子量約20 kD)具有顯著的抑制金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌的活性[6]。在上述研究的基礎(chǔ)上，將喙尾琵琶甲幼蟲(chóng)(8～11日齡)用50 ℃熱水處死干燥，粉末分別用石油醚和乙酸乙酯浸泡，然后采用硅膠柱和凝膠柱色譜提取脂溶性物質(zhì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)，石油醚提取物無(wú)抑菌活性，而乙酸乙酯提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌具有顯著的抑制效果[7]，進(jìn)一步印證了喙尾琵琶甲對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制效果更佳，其抑菌活性物質(zhì)是極性較大的脂溶性小分子。

以二氯甲烷為萃取劑萃取喙尾琵琶甲的防御液，其中最主要的成分是苯醌類、苯酚類、烷類以及胺類，它們都具有較好的抑制枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠桿菌的效果[8]。其中的苯醌能夠與細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的DNA和蛋白質(zhì)相互作用形成共價(jià)復(fù)合物，同時(shí)產(chǎn)生活性氧，造成其基因突變和蛋白質(zhì)變性，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9]。郭明磊等[8]使用喙尾琵琶甲防御液(臀腺分泌物)研究對(duì)革蘭陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、革蘭陰性菌大腸桿菌和銅綠桿菌的抑菌效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入二氯甲烷分層后的下層有機(jī)相對(duì)4種細(xì)菌均具有較好的抑制作用，但對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制效果更好，并且對(duì)枯草桿菌的抑制效果最好。

1.2 鎮(zhèn)痛、抗炎活性

喙尾琵琶甲鮮蟲(chóng)用95%乙醇浸泡后減壓濃縮為浸膏(收縮率為20%～25%)，使用熱板致痛法和小鼠扭體實(shí)驗(yàn)分別研究浸膏的神經(jīng)鎮(zhèn)痛和外周鎮(zhèn)痛效果,使用小鼠耳廓腫脹法測(cè)定其抗炎效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高劑量(0.4 g/mL)的浸膏能較好地抑制熱板疼痛，而低劑量(0.2 g/mL)就能較好地抑制小鼠扭體反應(yīng)[10]，表明喙尾琵琶甲乙醇浸膏具有較好的鎮(zhèn)痛作用，特別是對(duì)外周性疼痛效果更佳，但是抗炎效果不明顯。然而，先將活體用95%乙醇浸泡致死，蟲(chóng)體干燥后粉碎，再用60%乙醇浸泡，合并浸泡液濃縮制成凍干粉，該提取物的抗炎效果則與阿司匹林相近，另外，喙尾琵琶甲乙醇提取物急性毒性很小，小鼠的最大耐受量達(dá)500 g/kg，半數(shù)致死量無(wú)法計(jì)算，且進(jìn)食量和體質(zhì)量變化各組間均無(wú)顯著性差異[11]。說(shuō)明在正常劑量下該藥的鎮(zhèn)痛和抗炎效果尤佳，無(wú)毒副作用。

1.3 抗腫瘤、抗癌活性

有研究發(fā)現(xiàn)，喙尾琵琶甲水提物和乙醇粗提物在體外均具有明顯的抑制人卵巢癌細(xì)胞Skov3增殖的作用，對(duì)人子宮頸癌HeLa細(xì)胞無(wú)影響，但對(duì)正常的細(xì)胞株也有損傷作用，并且在體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)抑瘤效果[12]。使用改進(jìn)了的水提緩沖液，使其能夠保留水溶性大分子和熱敏小分子物質(zhì)，結(jié)果則能夠顯著的抑制HeLa細(xì)胞的增殖[13]。將喙尾琵琶甲活體用95%乙醇浸泡，再用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯萃取后濃縮，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯萃取物能夠顯著地抑制人乳腺癌細(xì)胞MD-A-MB-231和SKBR3、人胰腺癌細(xì)胞ASPC1、人前列腺癌細(xì)胞PC3[12-13]以及人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞CaCO-2和人肺癌細(xì)胞A549[14]的增殖，并發(fā)現(xiàn)抗腫瘤活性成分為酚類化合物，同時(shí)該活性成分還對(duì)銅綠假單胞桿菌具有顯著的抑菌活性。其證實(shí)了喙尾琵琶甲提取物具有顯著的體外抗腫瘤和抗癌效果，但是，體內(nèi)效果如何還有待進(jìn)一步研究。

1.4 抗氧化活性

喙尾琵琶甲鮮蟲(chóng)、干蟲(chóng)及分泌液中均含有多酚類物質(zhì)[15]。而昆蟲(chóng)體內(nèi)的多酚類物質(zhì)具有顯著的抗氧化作用。使用石油醚和乙酸乙酯為萃取劑萃取，發(fā)現(xiàn)該蟲(chóng)乙醇提取物的乙酸乙酯部位是酚類物質(zhì)的富集部位，并且鮮蟲(chóng)體內(nèi)的多酚類成分含量高于干燥蟲(chóng)體[14，16-17]。

將喙尾琵琶甲用95%乙醇冷浸提取3次，得到的粗提物用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取分離得到一種新的異二聚體，一種新的天然產(chǎn)物和11種已知的酚類化合物，利用DPPH方法研究該萃取物的體外抗氧化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種化合物均具有顯著清除自由基的能力，自由基清除率高達(dá)3.52和7.83[16]。肖懷[14]將喙尾琵琶甲成蟲(chóng)處死，風(fēng)干，粉碎后經(jīng)石油醚脫脂后分別用95%、85%及75%乙醇冷浸提取，合并濾液，回收乙醇后分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，共獲得80個(gè)化合物，大部分為對(duì)苯二酚或鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的多酚類物質(zhì)，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯部位具有最強(qiáng)的抗氧化能力?？梢?jiàn)，喙尾琵琶甲的體外抗氧化成分主要集中在中小極性部分，該蟲(chóng)乙醇提取物的乙酸乙酯部位的抗氧化活性值得深入研究，但喙尾琵琶甲的體內(nèi)抗氧化效果還未見(jiàn)報(bào)道。

1.5 創(chuàng)傷修復(fù)和肝損傷保護(hù)

瘢痕是皮膚纖維母細(xì)胞增殖與凋亡失衡所致的疾病。趙文斌等[18]首先將云南琵琶甲使用甲醇熱回流、正己烷萃取物(極性小)涂于增生瘢痕患者患處，結(jié)果瘢痕增生抑制效果顯著，痛癢癥狀明顯減輕，與藥物治療組相比復(fù)發(fā)率較低。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，該提取物對(duì)兔耳增生性瘢痕具有顯著的抑制作用。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，喙尾琵琶甲乙醇提取物能夠顯著抑制人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞的增殖，對(duì)人肺纖維化的治療具有潛在的效果[19]。另有研究將喙尾琵琶甲用70%乙醇冷浸提取，濃縮制成浸膏，收縮率控制為25%，用白酒灌胃大鼠建立肝損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低、中劑量的該提取物具有顯著的保護(hù)酒精性肝損傷作用[20]。

1.6 綜合作用和其他作用

環(huán)二肽具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗細(xì)菌和神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性[21]。喙尾琵琶甲甲醇提物用正丁醇萃取，得到了10個(gè)環(huán)二肽類物質(zhì)[22]。對(duì)喙尾琵琶甲甲醇熱回流產(chǎn)物的正己烷萃取物分析測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其油脂的主要化學(xué)成分為不飽和脂肪酸[23]，這將在心血管疾病防治中發(fā)揮顯著效果，還可以增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫力。

甲殼素具有良好的成膜、生物降解、可再生等特性，還具有顯著的抗菌、抗癌、抗凝血等藥理作用，但目前主要來(lái)源于蟹殼和蝦[24]。有研究通過(guò)堿酸法提取到喙尾琵琶甲的甲殼素，使用紅外光譜及X-射線衍生對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品相符，并且發(fā)現(xiàn)比從蝦、蟹中提取的效果更好；此外，從體壁角質(zhì)化程度較高的喙尾琵琶甲中提取的甲殼素得率最高[25]。

Xu等[26]采用氣相色譜-質(zhì)譜結(jié)合方法探究喙尾琵琶甲提取物中抗α-淀粉酶活性成分，發(fā)現(xiàn)所鑒定的20種化合物中戊酸具有抑制α-淀粉酶的活性，表明喙尾琵琶甲提取物中的戊酸具有降血糖作用。

將喙尾琵琶甲活體用95%乙醇浸泡致死，蟲(chóng)體晾干后粉碎再用60%乙醇浸泡，合并浸泡液進(jìn)行濃縮干燥制成凍干粉，用生理鹽水溶解做成不同濃度藥劑，針對(duì)實(shí)驗(yàn)兔的貧血進(jìn)行治療，及觀察家兔小腸平滑肌的收縮，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該藥劑對(duì)實(shí)驗(yàn)兔的貧血有顯著緩解作用，能抑制家兔小腸平滑肌的收縮，且與劑量存在量效關(guān)系[27]?？梢?jiàn)，該提取物具有顯著的治療貧血和抑制腸痙攣?zhàn)饔?，這一結(jié)果也為民間使用該蟲(chóng)酒精浸泡物治療胃腸疾病作出了論證，如抑制胃腸痙攣、緩解腸道疼痛和治療胃炎。

研究還發(fā)現(xiàn)，除刺激性分泌物及水部位外，喙尾琵琶甲乙醇提取物及不同極性萃取的氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、精制多糖等均有一定的免疫活性，以精制多糖、氯仿部位、乙酸乙酯部位效果顯著。

2 作用機(jī)理

2.1 抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)

調(diào)控細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路主要包括內(nèi)源性(線粒體)通路、外源性(死亡受體)通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路[28]?，F(xiàn)有的研究表明，喙尾琵琶甲主要通過(guò)阻滯細(xì)胞周期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為調(diào)控細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性通路。賡迪等利用流式細(xì)胞術(shù)，結(jié)合MTT結(jié)果，發(fā)現(xiàn)413 μg/mL云南琵琶甲粗提物顯著提高HeLa細(xì)胞S期細(xì)胞數(shù)，推測(cè)藥物可將HeLa細(xì)胞阻滯在S期，從而影響了細(xì)胞DNA的復(fù)制，促使癌細(xì)胞凋亡[13]。

14-3-3蛋白參與細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡、增殖等通路，可與靶蛋白相結(jié)合起促凋亡和抗凋亡作用[29]。Yan等[30]從日本琵琶甲乙醇提取物中提取到3種新型天然化合物，對(duì)它們進(jìn)行功能研究發(fā)現(xiàn)，化合物1和2具有明顯的抑制14-3-3蛋白作用，14-3-3蛋白能結(jié)合和調(diào)控多種癌基因和抑癌基因，表明喙尾琵琶甲提取物具有顯著的抗癌作用可能以14-3-3蛋白為靶點(diǎn)發(fā)揮抗癌作用。

2.2 抑制瘢痕增生

皮膚創(chuàng)傷時(shí)傷口內(nèi)的膠原合成與分解呈動(dòng)態(tài)平衡，該平衡一旦被打破，就會(huì)形成膠原沉積導(dǎo)致增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)。趙文斌等[18]對(duì)兔建立耳HS模型，術(shù)后28 d將模型隨機(jī)分為喙尾琵琶甲提取物制劑(云南省中醫(yī)醫(yī)院制劑中心提供)組、陽(yáng)性藥物(復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠干預(yù))對(duì)照組和空白對(duì)照組，用RT-PCR方法檢測(cè)耳HS組織TGF-β1 mRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組瘢痕增生指數(shù)(HI)、膠原密度、成纖維細(xì)胞數(shù)量和創(chuàng)傷愈合、瘢痕形成等關(guān)鍵轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1 mRNA表達(dá)量均顯著降低或減少，表明該提取物能夠通過(guò)下調(diào)TGF-β1的表達(dá)抑制瘢痕增生。在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，增加模型組(HS模型涂抹生理鹽水)和不同劑量喙尾琵琶甲提取物組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)制劑組HI指數(shù)、瘢痕的直徑和厚度均顯著降低，并且顯著抑制增生性瘢痕組織中相關(guān)標(biāo)志物Nanog、Oct4及Hedgehg信號(hào)通路相關(guān)基因SHH、Patch、Smo、Gli-1的表達(dá)水平，此外，2.668g/kg制劑組與15mg/kg劑量復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠治療效果相近。體外研究也發(fā)現(xiàn)，使用該制劑(0.025、0.05、0.1g/mL)處理表皮干細(xì)胞均可以抑制該細(xì)胞的增殖，可以降低表皮干細(xì)胞中Nanog和Oct4及SHH、Patch、Smo、Gli-1的基因和蛋白表達(dá)水平，還可以顯著抑制增生性瘢痕組織相關(guān)標(biāo)志物CD49F、CD29 和CK19 的陽(yáng)性細(xì)胞比率，并且可以減弱增生性瘢痕中表皮干細(xì)胞干性[31]。而Hedgehog信號(hào)通路在調(diào)控組織損傷修復(fù)、血管再生等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

綜上所述，喙尾琵琶甲對(duì)瘢痕增生具有良好的抑制效果，主要通過(guò)抑制Hedgehog信號(hào)通路進(jìn)而抑制表皮干細(xì)胞干性來(lái)治療增生性瘢痕。

2.3 抗炎作用

小腸炎癥等疾病會(huì)引起小腸平滑肌組織異常收縮[32]，研究表明，喙尾琵琶甲醇提物可使家兔小腸平滑肌收縮頻率降低、收縮張力降低、收縮曲線與基線間面積減小;研究結(jié)果表明，喙尾琵琶甲乙醇提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)兔的抑制小腸平滑肌收縮的作用機(jī)制可能與組胺H1受體有關(guān)[27]。Yan等[33-34]證實(shí)了日本琵琶甲提取物能抑制環(huán)氧化酶COX-2活性，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制COX表達(dá)而減少前列腺素的合成，從而起到抗炎作用。此外，喙尾琵琶甲乙醇提取物能夠有效地保護(hù)和治療角叉菜膠所致大鼠非細(xì)菌性前列腺炎，其作用的機(jī)理可能是通過(guò)抑制炎癥因子的滲透來(lái)調(diào)節(jié)前列腺組織的局部免疫反應(yīng)[35]。

2.4 抗氧化作用

崔文博等利用DPPH和ABTS方法對(duì)喙尾琵琶甲進(jìn)行體外抗氧化活性研究，結(jié)果表明，喙尾琵琶甲的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取物部位均有不同程度的自由基清除能力，其中氯仿和乙酸乙酯部位具有較好的抗氧化活性，其抗氧化作用主要通過(guò)清除DPPH自由基及ABTS自由基來(lái)實(shí)現(xiàn)[36]。

對(duì)喙尾琵琶甲活性成分作用機(jī)制的研究不僅是為探索其如何發(fā)揮療效，更為重要的是能夠發(fā)現(xiàn)活性成分發(fā)揮療效過(guò)程中的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)、作用信號(hào)通路及其上下游的關(guān)鍵因子，為其藥物的開(kāi)發(fā)和利用提供參考依據(jù)。但是，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外對(duì)于喙尾琵琶甲活性成分作用機(jī)制的研究還很少，也較為膚淺。

4 展望

喙尾琵琶甲具有顯著的抗菌、抗腫瘤、抑制炎癥等藥用效果，還具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，發(fā)展前景廣闊。但目前相關(guān)的研究主要集中在其不同提取物在抑菌、抗癌、抗氧化等方面的生理作用研究上，對(duì)其具體活性成分是什么，它們?nèi)绾瓮ㄟ^(guò)影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而影響靶因子發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞增殖和遷移等分子機(jī)制尚不明確，分子機(jī)理方面的研究十分有限，這將是下一步研究的重點(diǎn)。對(duì)喙尾琵琶甲提取物展開(kāi)更深層次的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制研究，將兩者密切聯(lián)系，找到藥物核心作用靶點(diǎn)、關(guān)鍵信號(hào)通路、代謝通路等，進(jìn)而找到成分明確、機(jī)制清楚、藥效可靠的關(guān)鍵有效成分或成分群，有助于進(jìn)一步加快喙尾琵琶甲藥用昆蟲(chóng)開(kāi)發(fā)和利用的進(jìn)程。