大慶溫室黃瓜根結(jié)線蟲病原鑒定

姬妍茹 肖湘 張正海 李國巍 董艷 楊慶麗 高宇 聶迪 石杰

摘要 [目的] 明確大慶溫室黃瓜根結(jié)線蟲的種類，為黃瓜根結(jié)線蟲病的防治提供理論依據(jù)。[方法] 從大慶市讓湖路區(qū)溫室采集感染根結(jié)線蟲的黃瓜根部和根際土壤，分別采用直接剝離法和貝爾曼法分離獲得線蟲卵囊和雄蟲，并由卵囊孵化培養(yǎng)得 2 齡幼蟲，采用顯微形態(tài)觀察結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定。[結(jié)果] 形態(tài)學(xué)觀察表明采集的樣本線蟲與象耳豆根結(jié)線蟲（Meloido-gyne enterolobii） 特征基本相符;rDNA-ITS 序列分析表明，與 GenBank 中象耳豆根結(jié)線蟲的序列相似度為 98%～100%，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，大慶根結(jié)線蟲 M229、M230 和 M231 與登錄號(hào)為 KF418368.1 和 JF309154.1 等 5 個(gè)象耳豆根結(jié)線蟲（Meloidogyne enterolobii）處于同一分類地位。[結(jié)論] 從大慶讓湖路區(qū)溫室采集的黃瓜根結(jié)線蟲為象耳豆根結(jié)線蟲。

關(guān)鍵詞 象耳豆根結(jié)線蟲;黃瓜;大慶;鑒定;PCR檢測(cè)

中圖分類號(hào) S 432.4? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）01-0144-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.038

Pathogenic Identification of? Cucumber Root-knot Nematodes in Daqing Greenhouse

JI Yan-ru，XIAO Xiang，ZHANG? Zheng-hai et al

（Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences，Daqing，Heilongjiang 163319）

Abstract [Objective]To identify the species of cucumber root-knot nematode in Daqing greenhouse and provide theoretical basis for the prophylaxis and treatment of cucumber root-knot nematodosis. [Method]The eggs and males of the nematodes were isolated from cucumber roots and rhizosphere soil infected with root-knot nematodes in the greenhouse of Ranghulu District，Daqing City. The eggs and males were isolated by direct stripping and Belman method，the second instar larvae were incubated by egg，and identified by micromorphological observation combined with molecular biological method. [Result]Morphological observation showed that the characteristics of the collected nematodes were basically consistent with that of Meloidogyne enterolobii.RDNA-ITS sequence analysis indicated that the sequence similarity with GenBank was 98%-100 %. The phylogenetic tree was constructed by neighbor joining method and the Daqing root-knot nematode M229，M230 and M231 were in the same taxonomic position with 5 kinds of Meloidogyne entrolobii （accession No. KF418368.1，JF309154.1 et al ）. [Conclusion]The cucumber root knot nematode collected from the greenhouse of Ranghulu District in Daqing is elephant eared bean root knot nematode.

Key words Meloidogyne enterolobii;Cucumber;Daqing;Identification;PCR test

基金項(xiàng)目 大慶市指導(dǎo)性科技計(jì)劃項(xiàng)目（zd-2020-77）。

作者簡(jiǎn)介 姬妍茹（1971—），女，黑龍江大慶人，高級(jí)農(nóng)藝師，碩士，從事生物技術(shù)研究。通信作者，實(shí)驗(yàn)師，從事生物技術(shù)研究。

收稿日期 2021-04-17

黃瓜（Cucumis sativus Linn.）是一年生草本植物，最初發(fā)現(xiàn)于喜馬拉雅山脈的熱帶地區(qū)，后在很多國家種植。截至2003年，全世界黃瓜種植面積超過200萬hm2，我國超過 125 萬hm2，居世界黃瓜栽培之首[1]，設(shè)施黃瓜栽培面積占國內(nèi)黃瓜總面積的近50%[2]。設(shè)施栽培的優(yōu)勢(shì)在于既能為消費(fèi)者提供反季蔬菜，還增加了菜農(nóng)收入，已成為當(dāng)前黃瓜的主要栽培方式。但由于設(shè)施栽培存在同類蔬菜連作和溫室內(nèi)濕度過高等問題，病害發(fā)生比大田更為嚴(yán)重，根結(jié)線蟲病是設(shè)施蔬菜生產(chǎn)中的主要病害，一般可減產(chǎn)30%～50%[3-5]。目前我國已發(fā)現(xiàn)根結(jié)線蟲40多種[6]，為害蔬菜的主要有南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incogni-ta）、花生根結(jié)線蟲（Meloidogyne arenaria）、北方根結(jié)線蟲（Meloidogyne hapla）、爪哇根結(jié)線蟲（Meloidogyne javanica）和象耳豆根結(jié)線蟲（Meloidogyne enterolobii）[7-9]。

象耳豆根結(jié)線蟲最早在我國海南儋州的象耳豆樹上發(fā)現(xiàn)，于1983年被鑒定命名[10]。該種的根結(jié)線蟲致病力極強(qiáng)，可為害多種農(nóng)作物，是熱帶及亞熱帶地區(qū)最具有威脅性的主要病原微生物[11-13]，我國南方的胡蘿卜、生姜、辣椒和空心菜上曾有過象耳豆根結(jié)線蟲的發(fā)生和為害[14-17]。東北地區(qū)的黃瓜、番茄、茄子和辣椒的根結(jié)線蟲病原以南方根結(jié)線蟲為主，其次為北方根結(jié)線蟲，在大慶大同區(qū)大棚的發(fā)病黃瓜、番茄和茄子上鑒定出的致病病原都為南方根結(jié)線蟲[6]，還未發(fā)現(xiàn)象耳豆根結(jié)線蟲為害溫室蔬菜的報(bào)道。筆者從大慶讓湖路區(qū)溫室采集感染根結(jié)線蟲的黃瓜植株和根際土壤，采用顯微形態(tài)觀察結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，明確黃瓜根結(jié)線蟲的種類，以期為黃瓜根結(jié)線蟲病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 Ezup 柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒，上海生工 SK8259;DreamTaq-TM DNA Polymerase MBI EP0702 dNTP，上海生工 D0056;瓊脂糖 BBI AB0014;SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒，上海生工 SK8131;DNA Ladder Mix maker，上海生工 SM0337; pMD 18-T Vector 連接試劑盒TaKaRa D101A;SanPrep 柱式質(zhì)粒 DNA 小量抽提試劑盒，上海生工 SK8191;其他化學(xué)試劑均用分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 BBI HC-2518R型冷凍高速離心機(jī)（鄭州南北儀器設(shè)備有限公司）;JY04S-3C型凝膠成像系統(tǒng)，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;DYY-5型電泳儀，北京六一儀器廠;GENEPRO型基因擴(kuò)增儀，上海京工實(shí)業(yè)有限公司;BK-5000型生物顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司;PXS5-B體視解剖鏡，北京測(cè)維光電儀器廠。

1.3 樣本采集 發(fā)病黃瓜的根部及根部周圍病土，于2020年5月采自大慶市讓湖路區(qū)宏偉二隊(duì)溫室。

1.4 形態(tài)鑒定 雌蟲從發(fā)病黃瓜根組織上解剖獲得;雄蟲通過貝爾曼漏斗法從染病黃瓜根際土壤分離獲得;2齡幼蟲由黃瓜發(fā)病根部的卵囊孵化獲得。線蟲的處死和會(huì)陰花紋的制作參照張紹升[18]的方法。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

1.5.1 DNA提取。

黃瓜根結(jié)線蟲DNA提取參照萬新龍等[19]的研究方法，從發(fā)病的黃瓜根結(jié)挑取線蟲卵囊 3 個(gè)，分別放入盛有10? μL滅菌重蒸水的 PCR 管中，并用解剖針將其刺破。加入8? μL預(yù)冷的 WLB （蠕蟲裂解液）和2? μL蛋白酶 K （1 mg/mL），13 200 r/min 離心0.5 min。迅速放入-20 ℃冰箱中至少10 min。然后分別在65? ℃下溫育1.5 h，95? ℃下滅活10 min，13 200 r/min下離心1 min，吸取上層DNA清液于PCR管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 rDNA-ITS 序列分析。

用線蟲ITS擴(kuò)增的通用引物V5367：5′-TTGAT-TACGTCCCTGCCCTTT-3′和26S：5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由上海生工合成。50 μL反應(yīng)體系：10×PCR Buffer（Mg2+Plus）5 μL，dNTP Mixture 4 μL，Taq酶（5 U/μL）0.4 μL，引物26S（20 μmol/L）1.5 μL，引物V5367（20μmol/L）1.5 μL，模板DNA 5 μL，加ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性1 min，55 ℃ 退火1.5 min，72 ℃ 延伸2 min，循環(huán)35次;最后72 ℃延伸10 min。4 ℃保存?zhèn)溆谩CR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠110 V電泳30 min進(jìn)行檢測(cè)，用0.5×TAE作為電泳緩沖液，并在紫外燈下觀測(cè)照相。PCR產(chǎn)物回收純化后送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。將獲得的 rDNA-ITS 區(qū)序列與 GenBank 數(shù)據(jù)庫中常見根結(jié)線蟲序列進(jìn)行 Blast 比對(duì)分析，并通過 MEGA 5軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，評(píng)估根結(jié)線蟲樣本的生物學(xué)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜根結(jié)線蟲病害癥狀 黃瓜感染根結(jié)線蟲后，初時(shí)癥狀表現(xiàn)不明顯，隨著病程加重，表現(xiàn)為植株矮小，果實(shí)小而少，葉片褪綠發(fā)黃，萎蔫甚至枯死。受害根系出現(xiàn)膨大的根結(jié)，呈近圓形。一條根上出現(xiàn)形狀不定、大小不一、表面粗糙的念珠狀根結(jié)。根結(jié)初期為白色，表面光滑，后轉(zhuǎn)為褐色至黑色（圖1），嚴(yán)重時(shí)腐爛。

2.2 形態(tài)學(xué)特征

雌蟲：頭尖，腹部膨大呈球形或梨形，乳白色。（0.45～1.60）mm×（0.26～0.80）mm，口針長(zhǎng)12～15 μm;會(huì)陰花紋圓形或橢圓形，線紋細(xì)且較為平滑，背弓高，呈近圓形或方形。

雄蟲：蠕蟲形，體較長(zhǎng)，無色透明，（1.0～1.5）mm×（0.03～0.04）mm，口針長(zhǎng) 20～26 μm，背食道腺開口在基部球后2.2～2.8 μm。

2 齡幼蟲：蠕蟲形，體細(xì)小，體長(zhǎng)0.36～0.39 mm?？卺樌w細(xì)，針錐與針桿等長(zhǎng)，基部球小。

會(huì)陰花紋整體呈圓形至卵圓形，線紋較密且平滑，背弓較高，為方形或近圓形，無明顯側(cè)線（圖2）。與象耳豆根結(jié)線蟲的會(huì)陰花紋描述基本吻合[20]，初步推斷侵染黃瓜根結(jié)線蟲種類為象耳豆根結(jié)線蟲。

2.3 黃瓜根結(jié)線蟲PCR擴(kuò)增及測(cè)序分析結(jié)果 利用通用引物 V5367 /26S對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲3個(gè)DNA樣本的 rDNA-ITS區(qū)片段進(jìn)行擴(kuò)增，得到的條帶均為859 bp（圖3），通過GenBank進(jìn)行 BLAST比對(duì)，結(jié)果表明黃瓜根結(jié)線蟲與象耳豆根結(jié)線蟲（Meloidogyne enterolobii）相似度為98%～100%。利用MEGA 5 軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），由圖4可知，3個(gè)DNA樣本與 5 個(gè)Meloidogyne enterolobii在同一支系上。由此可確定，該研究中所采集的樣本為象耳豆根結(jié)線蟲。

3 結(jié)論與討論

該研究結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法，明確從大慶讓湖路區(qū)溫室采集的黃瓜根結(jié)線蟲樣本為象耳豆根結(jié)線蟲，同時(shí)對(duì)其形態(tài)特征和為害黃瓜的癥狀進(jìn)行了描述，為黃瓜根結(jié)線蟲的防治提供理論依據(jù)。該研究是大慶黃瓜上發(fā)生象耳豆根結(jié)線蟲的首次報(bào)道，該線蟲致病力強(qiáng)，調(diào)查發(fā)現(xiàn)發(fā)病溫室中 85% 以上的黃瓜植株矮小，葉片變黃，果實(shí)少而小，根系根結(jié)多，大多數(shù)黃瓜根部變黑腐爛，嚴(yán)重降低了黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。以往大慶地區(qū)溫室曾發(fā)現(xiàn)有南方根結(jié)線蟲的為害[6]，沒有發(fā)現(xiàn)象耳豆根結(jié)線蟲的原因可能是樣本采集分布區(qū)域覆蓋面不夠。該研究?jī)H對(duì)大慶讓湖區(qū)溫室采集到的黃瓜根結(jié)線蟲樣本進(jìn)行了初步鑒定，關(guān)于黃瓜根結(jié)線蟲的發(fā)生規(guī)律、群體分布情況等還有待于深入研究，以期為大慶地區(qū)黃瓜根結(jié)線蟲的防治提供更加充分的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 屈倩倩.陜西黃瓜主栽品種性狀比較[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2020.

[2] 余冰，鄭志華，孔令云，等.加工黃瓜的標(biāo)準(zhǔn)化與質(zhì)量控制[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23（3）：109-112.

[3] 曾立，程萬里，余豪，等.多粘類芽孢桿菌 KM2501-1發(fā)酵液對(duì)番茄根結(jié)線蟲的防治效果[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2020，26（5）：1046-1050.

[4] 李瑞，李惠霞，謝丙炎，等.長(zhǎng)枝木霉菌株TL16防治南方根結(jié)線蟲的作用機(jī)理[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2020，47（2）：384-393.

[5] 遲元?jiǎng)P，葉夢(mèng)迪，趙偉，等.氟吡菌酰胺對(duì)南方根結(jié)線蟲的作用效果[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2019，46（6）：1364-1370.

[6] 宮遠(yuǎn)福.東北地區(qū)根結(jié)線蟲的種類分布及南方根結(jié)線蟲氯離子通道基因分析[D].沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

[7] 張鋒，楊苗苗，孫娟，等.陜西設(shè)施蔬菜根結(jié)線蟲特異性分子檢測(cè)[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30（31）：136-140.

[8] 趙傳波，鄭小玲，阮兆英，等.深圳市蔬菜基地根結(jié)線蟲的種類和分布[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，34（2）：41-48.

[9] 李克梅，董艷秋，曹雪松，等.新疆設(shè)施蔬菜根結(jié)線蟲病發(fā)生調(diào)查及病原鑒定[J].植物保護(hù)，2015，41（6）：191-194，204.

[10] YANG B J，EISENBACK J D.Meloidogyne enterolobii n.sp.（ Meloidogynidae），a root-knot nematode parasitizing pacara ear-pod tree in China[J].Journal of nematology，1983，15（3）：381-391.

[11] AHMED M，VAN DE VOSSENBERG B T L H，CORNELISSE C，et al.On the species status of the root-knot nematode Meloidogyne ulmi Palmisano & Ambrogioni，2000 （Nematoda，Meloidogynidae）[J].ZooKeys，2013，362：1-27.

[12] 卓侃，胡茂秀，廖金鈴，等.廣東省和海南省象耳豆根結(jié)線蟲的鑒定[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27（2）：193-197.

[13] 符美英，芮凱，肖彤斌，等.海南島象耳豆根結(jié)線蟲的種類鑒定及其 rDNA-ITS 序列分析[J].生物安全學(xué)報(bào)，2012，21（1）：79-84.

[14] WANG Y F，XIAO S，HUANG Y K，et al.First report of Meloidogyne enterolobii on carrot in China[J].Plant disease，2014，98（7）：1019-1019.

[15] ZHOU X，CHENG X，XIAO S，et al.First report of Meloidogyne enterolobii on banana in China[J].Plant disease，2016，100（4）：863-864.

[16] XIAO S，HOU X Y，CHENG M，et al.First report of Meloidogyne enterolobii on ginger （Zingiber officinale） in China[J].Plant disease，2018，102（3）：684.

[17] 陳淑君，肖順，程敏，等.福建省象耳豆根結(jié)線蟲的鑒定及分子檢測(cè)[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，46（2）：141-146.

[18] 張紹升.植物線蟲病害診斷與治理[M].福州：福建科學(xué)技術(shù)出版社，1999.

[19] 萬新龍，李建洪，彭德良.根結(jié)線蟲rDNA-ITS片段的克隆與序列分析[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26（5）：624-628.

[20] 劉晨，陳志杰，楊藝煒，等.陜西省首次發(fā)現(xiàn)象耳豆根結(jié)線蟲危害洛南白菜[J].植物保護(hù)，2020，46（5）：156-159.