高粱品種成熟期抗性生理指標(biāo)及可溶性糖與SS和SPS活性相關(guān)性研究

商靖 陸勁羽 黃禹翕 陳鈺 王曉雪 項陽 吳迪 李玥瑩

摘要 [目的]通過研究不同品種雜交高粱抗性生理指標(biāo)的差異并探索其可溶性糖的含量與SS酶及SPS酶活性的關(guān)系，建立高效精確選育抗性強產(chǎn)量高的優(yōu)質(zhì)高粱種質(zhì)資源的重要途徑。[方法]選用愈創(chuàng)木酚比色法、氮藍四唑光還原法、紫外分光光度計法分別提取并測定POD、SOD、CAT活性;采用優(yōu)化后的蒽酮比色法測定葉片可溶性糖含量并以硫代巴比妥酸法測定MDA含量;SS及SPS活性的測定均采用間苯二酚比色法。[結(jié)果]遼糯10號同時具有抗逆性強、可溶性糖含量高的雙重優(yōu)勢;遼糯15號SOD和CAT活性最高但MDA含量最低，表明其抗逆性在所有品種中最強;遼雜66號具有較高的SS及SPS活性，從而對糖分積累有促進作用，利于實現(xiàn)高產(chǎn)。[結(jié)論]從多角度闡明了高粱抗旱、耐鹽堿機制，豐富其抗性生理內(nèi)容;進一步發(fā)掘并了解高粱糖分積累機制，明確高粱糖分積累分子調(diào)節(jié)機制的內(nèi)在機理，建立了精確選育抗性強、產(chǎn)量高的優(yōu)質(zhì)高粱種質(zhì)資源的重要途徑，并制定強化高粱抗性及產(chǎn)量的技術(shù)措施，為篩選近緣農(nóng)作物的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源、提高農(nóng)作物的育種技術(shù)水平、篩選其差異表達基因后再進行蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析、挖掘調(diào)控高粱抗性強弱及糖分積累的關(guān)鍵基因及解析其分子調(diào)控機制奠定堅實的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 高粱;SOD;POD;SPS;種質(zhì)資源

中圖分類號 S514? 文獻標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）01-0046-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.013

Study on Correlation between the Soluble Sugar and the SS and SPS Activities of Different Sorghum Varieties at Maturity and Analysis of Physiological Indexes of Resistance

SHANG Jing，LU Jin-yu，HUANG Yu-xi et al

（College of Life Science， Shenyang Normal University， Shenyang， Liaoning 110034）

Abstract [Objective] To explore the relationship between soluble sugar content and SS and SPS enzyme activities in sorghum， and to establish an effective way to select high-quality sorghum germplasm resources with strong resistance and high yield. [Method] The activities of POD， SOD and CAT were extracted and determined by guaiacol colorimetry， azoblue tetrazole photoreduction and UV spectrophotometer， respectively. The contents of total available sugar and acetaldehyde were determined by antraton non-color optimization method and mercaptan acid non color method， respectively. The activities of SS and SPS were determined by isophthalic phenol colorimetry. [Result] Liaonuo 10 had the double advantages of strong stress resistance and high soluble sugar content at the same time;Liaonuo 15 had the highest SOD activity， CAT activity and the lowest MDA content， which indicated that it had the strongest stress resistance;Liaoza 66 had the highest SS and SPS enzyme activities， which promoted sugar accumulation and achieved high yield. [Conclusion] The mechanism of drought resistance and saline alkali tolerance of sorghum was revealed from many aspects， and the physiological content of stress resistance of sorghum was enriched;the mechanism of sugar accumulation in sorghum was explored and further understood， and the internal mechanism of molecular regulation mechanism of sugar accumulation in sorghum was clarified. An important way to accurately select high-quality sorghum germplasm resources with strong resistance and high yield was established， and technical measures to strengthen sorghum resistance and yield were formulated ， so as to screen the high-quality germplasm resources of related crops， to enhance crop breeding level， to screen different expressed genes， to carry out proteome and transcriptome association analysis， to explore the regulation of sorghum resistance， and to find out the key genes of sexual strength and sugar accumulation and their molecular regulation mechanism.

Key words Sorghum;SOD;POD;SPS;Germplasm resources

基金項目 遼寧省教育廳重點攻關(guān)項目（LZD201901）。

作者簡介 商靖（1996—），女，遼寧北票人，碩士研究生，研究方向：植物基因工程。通信作者，教授，博士，從事植物基因工程研究。

收稿日期 2021-05-03;修回日期 2021-06-08

高粱又稱蜀黍，是全球第五大糧食作物[1]。因較高的二氧化碳固定效率，使其同時具有抗旱、耐澇、耐瘠薄、光合效率高等顯著特點，是目前干旱、瘠薄和鹽堿等農(nóng)田種植的主要經(jīng)濟作物之一。與玉米相比，高粱葉片較窄、葉面積較小、氣孔數(shù)目較少且葉表面具有一層蠟質(zhì)層起到保護作用，使得高粱水分蒸發(fā)大幅度減少，因此抗旱、耐澇、抗鹽堿等能力均強于其他夏季農(nóng)作物，并能在干旱條件下保持體內(nèi)水分平衡，并且生長周期的需水量都遠小于其他的作物[2]。此外，高粱也極其耐澇，只要所處生存環(huán)境中的水沒有將高粱穗淹沒，都對其生長和發(fā)育的影響不太大。同時高粱對水肥要求低，在肥力不足時也能獲得高產(chǎn)[3]。

我國高粱品種較多，應(yīng)用的途徑也多種多樣，既可直接食用、飼用，又可加工利用，對食品工業(yè)、畜牧業(yè)等方面均具有廣泛的現(xiàn)實和潛在價值[4-5]，可以滿足我國各類產(chǎn)業(yè)的不同需求，減少各行業(yè)消費對國際市場的過度依賴。因此高粱的合理開發(fā)利用對于解決國家能源短缺問題、改善生態(tài)環(huán)境、促進國民經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。

綜上所述，為深入了解并解決高粱在育種上存在的問題，筆者測定不同高粱主栽品種在不同時期 SOD、POD、CAT活性變化和 MDA、可溶性糖含量并比較各指標(biāo)間的差異，探究并揭示糖分積累的規(guī)律與其糖代謝機理，根據(jù)研究結(jié)果從多方面篩選出抗逆性強、光合效率高、生物產(chǎn)量高的優(yōu)良品種，為提高作物育種水平建立選育優(yōu)質(zhì)高粱品種的方法，為培養(yǎng)更優(yōu)質(zhì)的高產(chǎn)高抗糧食作物與品種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

來源于遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供的12個不同高粱品種，分別為遼糯10號、遼糯11號、遼糯15號、遼雜37號、遼雜57號、遼雜58號、遼雜61號、遼雜62號、遼雜66號、遼雜73號、遼雜79號。成熟期隨機取材，取材部位為高粱倒2葉，每個樣品進行3次重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 酶液制備。

1.2.1.1 抗性指標(biāo)酶液制備。

取0.5 g新鮮葉片，置于液氮預(yù)冷后的研缽中，加入適量的液氮（不超過研缽容積的1/3），快速研磨至磨成粉末狀，再加入5 mL預(yù)冷的以50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.8）配制而成的酶提取液[6]。在冰浴條件下靜置10 min，4 ℃，9 915 r/min離心20 min，棄沉淀后收集的上清液，即為試驗用酶提取液，冰箱低溫保存，用于測定SOD、POD、ACT 活性和MDA 含量。

1.2.1.2 可溶性糖含量溶液制備。

稱取0.5 g新鮮高粱葉片，剪碎后放于研缽中，放入適當(dāng)?shù)氖⑸昂驼麴s水，仔細研磨成勻漿狀后，轉(zhuǎn)移到帶刻度的試管中，再用10 mL蒸餾水分數(shù)次沖洗研缽。將試管置于80 ℃水浴鍋中，恒溫加熱30 min后取出，待試管冷卻后，將溶液過濾2次至100 mL容量瓶中，用熱的蒸餾水沖洗殘渣數(shù)次，最后定容至100 mL。

1.2.1.3 蔗糖合成酶（SS）及蔗糖磷酸酶（SPS）溶液制備。

稱取新鮮高粱葉片1 g，置于液氮預(yù)冷的研缽中，研磨同時加入6 mL Hepes-NaOH緩沖液，將葉片勻漿轉(zhuǎn)至離心管中，在4 ℃下，10 000轉(zhuǎn)離心10 min，提取上清液。

1.2.2 指標(biāo)測定。

采用愈創(chuàng)木酚比色法、氮藍四唑光還原法、紫外分光光度計法分別提取并測定POD、SOD、CAT活性[7];采用優(yōu)化的蒽酮比色法和硫代巴比妥酸法分別測定可溶性糖總含量及MDA含量[8];采用間苯二酚比色法測定 SS 和 SPS 的活性[6]。上述數(shù)據(jù)測定均進行重復(fù)試驗3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用 Origin 8.6和Excel 2016軟件進行試驗數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種成熟期SOD活性比較

不同品種高粱成熟期SOD活性具有明顯差距，遼糯10號的SOD活性在成熟期最高并顯著高于其余品種，遼雜58號的SOD活性次之;遼糯15、遼糯11、遼粘03、遼雜37的SOD活性沒有明顯差別。而遼雜57號的SOD活性在成熟期最低，甚至接近無活性，遼雜66號次之，遼雜62、遼雜61、遼雜73的SOD活性均大幅低于遼糯10等高SOD活性品種且相互之間不存在明顯差異（圖1）。

2.2 不同品種成熟期POD活性比較

不同品種高粱在成熟期（除個別品種外）POD活性差異不明顯：成熟期POD活性最高的品種是遼糯10號，遼雜73的POD活性次之，但兩者間差距甚微并顯著高于其余品種;而遼雜61的成熟期POD活性最低且僅為遼糯10的50%，遼雜66、遼糯11等其余品種POD活性稍高于遼雜61，但不存在顯著差異（圖2）。

2.3 不同品種成熟期CAT活性比較

不同高粱品種在成熟期時CAT活性存在顯著差異，遼雜73成熟期的CAT活性最高且明顯高于其余品種，遼糯15成熟期的CAT活性次之;遼粘03、遼糯10、遼雜61在成熟期的CAT活性不存在顯著差異;而遼雜66在成熟期的CAT活性最低，僅為遼雜73號的10%（圖3）。

2.4 不同品種成熟期MDA含量比較

不同品種高粱的MDA活性在成熟期差異顯著，遼雜66和遼雜57的MDA活性在成熟期顯著高于其余各品種，但兩者間差距甚微。而遼糯15的MDA活性最低，僅為遼雜66的25%（圖4）。

2.5 不同品種可溶性糖含量比較

12個高粱品種間成熟期葉片的可溶性糖含量有差異性，其中遼雜66、遼雜79、遼糯10葉片可溶性糖含量均顯著高于其余品種;遼雜66的可溶性糖含量最高，是遼雜61的2倍以上;遼雜73、遼糯15、遼糯11、遼雜37品種間可溶性糖含量差異不大（圖5）。

2.6 高粱蔗糖磷酸合成酶（SS）活性分析

成熟期不同高粱品種葉片的SS活性存在顯著差異，其中遼雜66的SS活性最高，為39.3 mg/（g·h），活性顯著高于其他品種;遼雜61的SS活性最低（圖6）。

結(jié)果表明，高粱葉片可溶性糖含量與其SS活性呈顯著正相關(guān)（R=0.794 7，P<0.01）的關(guān)系，這說明高粱葉片SS活性的提高可直接促進體內(nèi)可溶性糖的積累。其次，進行SS活性與可溶性糖含量之間的相關(guān)性分析，結(jié)果表明SS活性與可溶性糖含量之間的相關(guān)系數(shù)為R2=0.631 5，在范圍中線性關(guān)系好（圖7），回歸方程為y=0.504 9x+9.733。

2.7 高粱蔗糖合成酶（SPS）活性分析

成熟期不同高粱品種葉片的SPS活性存在顯著性差異，在12個品種高粱葉中，遼雜66的 SPS活性最大，為 33.93 mg/（g·h），顯著高于其他各品種，而遼雜61的SPS活性最低（圖8）。

結(jié)果表明，葉片中SPS活性與可溶性糖含量呈顯著正相關(guān)（R=0.885 4，P<0.01）關(guān)系，表明高粱葉片SPS活力對可溶性糖含量具有正向直接關(guān)系。其次，進行上述2個指標(biāo)間的相關(guān)性分析后可知，SPS活性與可溶性糖含量之間的相關(guān)系數(shù)為R2=0.784，在范圍中線性關(guān)系好（圖9），回歸方程為y=0.553 4x+10.25。

2.8 高粱SS及SPS活性相關(guān)性分析

分析成熟期高粱葉片SPS活性與SS活性的相關(guān)性可知，除遼雜79、遼糯11外，其余各品種的SS活性均高于SPS活性，品種間不存在顯著差異（圖10）。SS活性與SPS活性變化趨勢相同，呈顯著正相關(guān)（R=0.855 0，P<0.01）關(guān)系，范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=0.869 2x-0.025（圖11）。

3 結(jié)論

高粱是我國極為重要的旱糧作物，對食品工業(yè)、畜牧業(yè)等方面具有廣泛的現(xiàn)實和潛在價值，因此高粱的改良、有效利用和開發(fā)具有重要意義[9]。而優(yōu)良種質(zhì)資源的選育則是進一步提高產(chǎn)量最佳途徑。同時，植物對逆境的耐受能力與生長發(fā)育和產(chǎn)量之間存在著密切的聯(lián)系。

抗氧化酶類是清除植物體內(nèi)活性氧的重要組成部分，是確保植物體正常生長的重要酶類[10]。植物體內(nèi)的抗氧化酶類主要有SOD、POD和CAT等。其中，SOD是植物面對氧化脅迫時的第一道防線，當(dāng)植物體內(nèi)保持較高SOD活性時，說明此時植物體擁有較強的抗逆境傷害能力[11];POD是植物細胞內(nèi)清除H2O2的主要酶類，可減輕H2O2積累對植物體造成的傷害[12];CAT 能夠避免活性氧自由基對植物造成傷害，其主要作用途徑在于清除β-脂肪酸氧化、線粒體電子傳遞和光呼吸等過程中產(chǎn)生的過氧化氫（H2O2）[13]，同時MDA含量在一定程度上反映膜脂過氧化作用水平和膜結(jié)構(gòu)的受害程度[14]。可溶性糖含量是評價高粱利用價值的重要指標(biāo);蔗糖磷酸合成酶（SPS）和蔗糖合成酶（SS）是參與高等植物調(diào)控蔗糖代謝的2種關(guān)鍵酶，其中SPS可催化蔗糖的合成，SS既可催化蔗糖的合成又可催化蔗糖的分解[15]。

該研究以12種高粱品種為試驗材料，在成熟期對葉片隨機取材，測定其抗性生理生化指標(biāo)（SOD活性、POD活性、CAT活性、MDA含量）及糖代謝途徑相關(guān)指標(biāo)（SPS活性、SS活性、可溶性糖含量），綜合分析上述指標(biāo)的測定結(jié)果可得出以下結(jié)論：

（1）遼糯10號、遼雜58號、遼糯15號SOD活性最高，表明此時植物可有效清除自由基，減少超氧陰離子對植物體的傷害，有效抵抗外界氧化脅迫。

（2）遼糯10號、遼雜73號、遼雜58號POD活性最強，而遼雜73號、遼糯15號、遼雜57號CAT活性達到最高值，表明此時植物可快速分解清除體內(nèi)H2O2，從而在一定程度上減輕H2O2對植物體的毒害。

（3）遼糯15號、遼粘03號、遼糯11號的MDA含量最低，MDA是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物之一，其含量高低在一定程度上反映膜脂過氧化作用水平和膜結(jié)構(gòu)的受害程度，含量越低時，其抗逆性越強。

（4）遼雜66號、遼雜79號、遼糯10號3個品種葉片中的可溶性糖含量最高而且明顯高于其他品種。

（5）遼雜66號、遼糯10號、遼雜57號3個品種葉片中的SS活性最高，說明高粱葉片SS活性對可溶性糖含量具有正向直接關(guān)系。

（6）遼雜66號、遼雜79號、遼糯10號高粱葉片中SPS活性最大，分析其與可溶性糖含量之間的相關(guān)性，得出高粱葉片SPS活性對可溶性糖含量具有正向直接關(guān)系。

（7）遼雜66號、遼糯10號SPS活性、SS活性及可溶性糖含量均顯著高于其余品種，可推測SS和SPS共同參與了植物體內(nèi)糖代謝過程的調(diào)控，通過改變其活性進而共同調(diào)節(jié)糖分的積累。

綜上所述，遼糯10號同時具有抗逆性強、可溶性糖含量高的雙重優(yōu)勢，因此是12個不同品種高粱中生物學(xué)性能最優(yōu)異且均衡的品種，可在大規(guī)模農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中保證其存活率并提高單位面積產(chǎn)量;遼糯15號SOD和CAT活性最高，同時MDA含量最低，說明遼糯15號具有最強的抗逆性;遼雜66號SS和SPS活性最高，從而對糖分積累有促進作用，利于實現(xiàn)高產(chǎn)。篩選出上述擁有不同優(yōu)良性狀的品種可用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上因地制宜的種植，定位相關(guān)性狀基因，雜交育種制備作物優(yōu)質(zhì)新品種等研究領(lǐng)域，為更有效地獲得理想作物種質(zhì)資源奠定理論基礎(chǔ)。

4 討論

該試驗旨在通過研究不同高粱品種間抗性生理生化指標(biāo)的差異，探索高粱中可溶性糖的含量與SS和SPS活性的關(guān)系，以期從多維度揭示高粱抗旱耐鹽堿機制，豐富其抗逆生理內(nèi)容;發(fā)掘并進一步了解高粱糖分積累機制，明確高粱糖分積累分子調(diào)節(jié)機制的內(nèi)在機理。

以該試驗結(jié)果為理論依據(jù)，建立有效選育抗性強、產(chǎn)量高的優(yōu)質(zhì)高粱種質(zhì)資源的重要途徑，為后續(xù)制定強化高粱抗性及提高產(chǎn)量的技術(shù)措施，篩選近緣作物優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，提高作物育種水平，篩選差異表達基因，進而完成蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析，最終挖掘調(diào)控高粱抗性強弱及糖分積累的關(guān)鍵基因及解析其分子調(diào)控機制奠定堅實的理論基礎(chǔ)。

從未來發(fā)展的角度而言，隨著分子生物學(xué)與分子遺傳學(xué)的迅猛發(fā)展及其在農(nóng)業(yè)育種方面的廣泛利用，傳統(tǒng)的育種方案已不能滿足當(dāng)今對優(yōu)質(zhì)農(nóng)作物選育的需求，而通過利用比較基因組學(xué)與功能基因組學(xué)等近些年來興起的生物技術(shù)手段，加強對高粱高產(chǎn)高抗等相關(guān)優(yōu)質(zhì)性狀的基因定位、基因克隆和分子標(biāo)記等方面研究，在不久的將來，有理由相信優(yōu)質(zhì)高粱育種工作必將煥發(fā)新的活力。

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