宏基因組在動(dòng)物腸道微生物中的應(yīng)用研究進(jìn)展

余歡 李輝

摘要 腸道微生物與機(jī)體之間始終保持著一種動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)系，它們不僅在機(jī)體的消化吸收方面發(fā)揮作用，而且在機(jī)體免疫、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝等方面起著重要調(diào)節(jié)作用。近年來，隨著宏基因組研究的快速發(fā)展，人們利用宏基因組在動(dòng)物腸道菌群上進(jìn)行了廣泛研究，腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)及其在生理代謝途徑中發(fā)揮的作用在此基礎(chǔ)上得到了更全面的認(rèn)識(shí)。綜述宏基因組在腸道微生物方面的研究進(jìn)展，旨在為動(dòng)物生產(chǎn)相關(guān)領(lǐng)域的研究提供參考。

關(guān)鍵詞 宏基因組;腸道微生物;全基因組測(cè)序;16S rRNA

中圖分類號(hào) S852.6? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）01-0018-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.005

Research Progress in the Application of Metagenomics in Animal Gut Microbes

YU Huan1，2，LI Hui1，2

（1.Key Laboratory of Plateau Mountain Animal Genetics， Breeding and Propagation， Ministry of Education， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025; 2. College of Animal Science， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025）

Abstract There is always a dynamic balance between intestinal microorganisms and the body. They not only play a role in digestion and absorption， but also play an important regulatory role in immunity， nutrient metabolism and other aspects of the body. In recent years， with the rapid development of the research on metasomes， people have conducted extensive researches on the intestinal flora of animals by using metasomes， on the basis of which the structure of intestinal microflora and the role they play in physiological metabolic pathways have been more comprehensively understood. Review the research progress of metagenomics in intestinal microorganisms， aiming to provide reference for the research in the field of animal production.

Key words Metagenomics;Intestinal microorganisms;Whole genome sequencing;16S rRNA

基金項(xiàng)目 貴州省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合支撐〔2019〕2285號(hào)）;貴州省地方家禽產(chǎn)業(yè)聯(lián)合攻關(guān)項(xiàng)目（黔財(cái)農(nóng)〔2020〕175號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介 余歡（1996—），女，四川自貢人，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。

通信作者，教授，博士，從事種質(zhì)資源保護(hù)與利用研究。

收稿日期 2021-04-11

微生物廣泛存在于自然界中，腸道微生物在動(dòng)物機(jī)體整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，其最重要的代謝功能就是對(duì)動(dòng)物自身不能利用的碳水化合物進(jìn)行酵解，提高養(yǎng)分的利用率，從而滿足機(jī)體的生長(zhǎng)及繁殖。機(jī)體對(duì)難以消化的糖類如麥芽糊精等的利用就是通過腸道微生物的作用實(shí)現(xiàn)的[1]。除此之外，腸道內(nèi)的微生物菌群在機(jī)體的生理、免疫和營(yíng)養(yǎng)狀況等方面也發(fā)揮著作用[2]。相較于傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)技術(shù)，用宏基因組學(xué)技術(shù)研究腸道微生物，不僅大大提升了人們對(duì)腸道微生物的了解，而且能夠更快速、客觀、全面地檢測(cè)菌群種類與結(jié)構(gòu)組成。因而，越來越多的學(xué)者采用宏基因組的方法進(jìn)行腸道微生物的研究。

腸道微生物有著數(shù)目龐大、種群繁多、分類復(fù)雜的顯著特點(diǎn)。采用宏基因組的手段對(duì)腸道微生物進(jìn)行研究能夠更全面地認(rèn)識(shí)動(dòng)物微生物群的種類和結(jié)構(gòu)功能，探索飼糧的變化與動(dòng)物腸道微生物之間的關(guān)系，能夠更客觀全面地認(rèn)識(shí)動(dòng)物的消化機(jī)理，在預(yù)防與治療腸道疾病或者與微生物菌群變化有關(guān)的疾病時(shí)提供相應(yīng)的理論支持等。

1 宏基因組的概念

宏基因組學(xué)（metagenomics）是以特定環(huán)境里包含的所有微生物的基因?yàn)檠芯繉?duì)象，把微生物菌群的數(shù)量結(jié)構(gòu)及功能和外部環(huán)境存在的關(guān)系作為研究目的的一種微生物研究手段。Handelsman等[3]在1998年把宏基因組解釋為：環(huán)境中一切微生物的總和，包括特定環(huán)境中可培養(yǎng)與不可培養(yǎng)的所有微生物基因，主要為特定環(huán)境中真菌和細(xì)菌基因組的總和。

2 宏基因組技術(shù)

宏基因組技術(shù)流程主要有4個(gè)步驟：①特定環(huán)境中樣品基因的富集處理;②提取樣品中的DNA;③宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建與篩選;④目的克隆基因的檢測(cè)。其中宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建與篩選是技術(shù)流程的關(guān)鍵點(diǎn)。宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建就是在分子克隆原理和技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過原位裂解法或異位裂解法盡可能多地提取出樣品中全部的DNA，為了獲得完整的目的基因或者基因簇，在對(duì)樣品DNA進(jìn)行提取時(shí)保持較大片段的完整性[4]。文庫(kù)的篩選包括：①基于功能篩選，就是根據(jù)克隆產(chǎn)生的新生物，對(duì)其進(jìn)行活性的篩選。Tyson等[5]在研究小鼠的腸道微生物時(shí)篩選出了一種新的非培養(yǎng)微生物基因，基于此試驗(yàn)，β-葡聚糖酶的活性克隆被發(fā)現(xiàn)。②基于序列篩選，是對(duì)已知功能的基因進(jìn)行探針設(shè)計(jì)或者PCR引物設(shè)計(jì)，然后對(duì)該基因進(jìn)行雜交或者PCR擴(kuò)增篩選陽(yáng)性克隆。③化合物結(jié)構(gòu)篩選，是在宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)入以及未轉(zhuǎn)入外源基因或發(fā)酵液、提取液的色譜圖比較的基礎(chǔ)上進(jìn)行篩選。④底物誘導(dǎo)基因表達(dá)篩選，是在底物誘導(dǎo)克隆子分解代謝基因的基礎(chǔ)上進(jìn)行篩選[6]。

3 宏基因組測(cè)序方法

宏基因組樣本測(cè)序方法包括全基因組測(cè)序（de novo 測(cè)序）和擴(kuò)增子測(cè)序，其中全基因組測(cè)序是基于由高通量測(cè)序技術(shù)提取環(huán)境樣品微生物DNA片段的序列信息，從而評(píng)估腸道菌群的組成以及功能[7]，主要用于基因識(shí)別、基因代謝通路分析、環(huán)境分類分析等[8]，它在研究微生物分子進(jìn)化、基因組成、基因調(diào)控等方面有著重要意義。擴(kuò)增子測(cè)序或稱標(biāo)簽序列，是對(duì)一些在進(jìn)化中有著高保守、短序列的基因序列進(jìn)行微生物群落多樣性的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等方面的分析[9]。擴(kuò)增子測(cè)序主要采用的是16S rRNA基因序列[10]，選擇16S rRNA 一方面因?yàn)樗诩?xì)菌RNA中占比80%以上，另一方面因?yàn)榕c16S rRNA相比，5S rRNA有較短的序列，23S rRNA 有較快的堿基突變率，其中18S rRNA是16S rRNA在真核生物中的同源體。

4 腸道微生物的功能

腸道微生物中的細(xì)菌數(shù)量超過99%，嚴(yán)格厭氧菌高達(dá)97%，只有3%是需氧菌。腸道微生物參與維持胃腸道微生態(tài)動(dòng)態(tài)平衡，調(diào)節(jié)宿主的能量?jī)?chǔ)存與代謝[11]，激活腸道免疫系統(tǒng)與機(jī)體相互作用[12]，參與多個(gè)代謝途徑的調(diào)控，它們不僅在消化、免疫、機(jī)體發(fā)育等方面起著重要作用，而且在腸道功能和屏障完整性的維持以及繁殖性狀的表現(xiàn)等方面發(fā)揮著相應(yīng)功能[13]，因而被稱為動(dòng)物的“第二基因組”。

腸道微生物在不同個(gè)體之間的群落組成不同，即使是同一個(gè)體，不同部位的組成也略有差異。飲食、環(huán)境、年齡、遺傳等因素都對(duì)腸道微生物群落結(jié)構(gòu)有著或多或少的影響。研究發(fā)現(xiàn)，人類腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)與飲食習(xí)慣有很大關(guān)系，飲食以碳水化合物為主發(fā)現(xiàn)含有較多的普氏桿菌屬，而以高蛋白、高脂肪食物為主發(fā)現(xiàn)以擬桿菌屬為主[14-15]。機(jī)體通過自身的適應(yīng)性應(yīng)答或疾病等方式對(duì)環(huán)境的改變做出回應(yīng)，與此同時(shí)，腸道內(nèi)的微生物菌群也會(huì)做出相應(yīng)的變化，用以完成機(jī)體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性調(diào)節(jié)[16]。研究表明，隨著年齡的增長(zhǎng)，腸道微生物的變化呈現(xiàn)出一定的規(guī)律，比如厭氧菌含量呈現(xiàn)出一定量的增加，而雙歧桿菌、乳桿菌和擬桿菌等含量相對(duì)減少[17-18]。由腸道微生物產(chǎn)生的短鏈脂肪酸（SCFAs）參與著機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)和自身免疫炎癥過程[19]，其途徑主要是激活G蛋白偶聯(lián)受體以及抑制組蛋白去乙?；竅20];SCFAs通過為腸黏膜細(xì)胞提供能量，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)以及代謝，通過降低腸道內(nèi)環(huán)境的pH來減少有害菌，從而維持腸道功能的穩(wěn)定[21-22]。膽汁酸可以促進(jìn)腸道對(duì)脂質(zhì)和維生素的消化吸收，在機(jī)體免疫方面發(fā)揮作用，腸道微生物可以促進(jìn)初級(jí)膽汁酸轉(zhuǎn)變?yōu)榇渭?jí)膽汁酸，進(jìn)而對(duì)體內(nèi)膽汁酸含量進(jìn)行調(diào)控[23]。

近年來，腸道微生物與一些常見疾病之間的研究也在進(jìn)行中。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂與兒童孤獨(dú)癥有關(guān)[24];帕金森病的發(fā)病[25]伴隨著腸道微生物群失調(diào);腸道微生物的變化可以IBD的治療起到反饋?zhàn)饔肹26];腸道微生物還與肥胖的治療、Ⅱ型糖尿病的治療、癌癥的治療等有著重要關(guān)系[27-29]。這些研究表明，腸道微生物菌群的數(shù)量與結(jié)構(gòu)對(duì)診斷和治療疾病有重要作用。

腸道微生物在腸道甚至整個(gè)機(jī)體上都起著重要作用，因而了解其群落構(gòu)成以及功能顯得尤為重要。早期研究腸道微生物的方法是微生物培養(yǎng)，傳統(tǒng)研究是對(duì)其進(jìn)行體外培養(yǎng)，然后對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究。然而，只有1%的微生物能夠進(jìn)行常規(guī)分離培養(yǎng)，局限性非常大，能夠進(jìn)行體外培養(yǎng)的微生物只占微生物總量的很少一部分。在宏基因組手段的幫助下，避開了對(duì)微生物菌種進(jìn)行純培養(yǎng)的障礙，直接從自然界獲取遺傳信息、活性物質(zhì)和功能基因，技術(shù)上比用純分離培養(yǎng)法有了很大的進(jìn)步，大大縮短了時(shí)間，能夠更清晰地認(rèn)識(shí)微生物的結(jié)構(gòu)和功能，拓寬了微生物資源的利用空間。

在腸道微生物基因集構(gòu)建方面，從2010年起人、鼠和豬的腸道微生物參考基因集就已經(jīng)被構(gòu)建出來[30-33]。近年關(guān)于雞的腸道微生物基因集構(gòu)建有了重大進(jìn)展，張艷[34]獲得了雞的十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)直腸等的首個(gè)腸道微生物宏基因集，并對(duì)相關(guān)基因序列進(jìn)行了功能注釋。王恒超[35]構(gòu)建了第一個(gè)完善的雞腸道微生物的基因集。人類及部分動(dòng)物的腸道微生物基因集的構(gòu)建，能夠幫助人們定位微生物、監(jiān)測(cè)人類及動(dòng)物的健康狀態(tài)，在疾病的治療方面也可以發(fā)揮重要作用。

5 宏基因組在動(dòng)物腸道微生物的應(yīng)用研究

動(dòng)物的品種、生長(zhǎng)階段、飼料、腸道段落等與腸道微生物多樣性的變化都有關(guān)聯(lián)。Yang 等[36]研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物品種與腸道微生物區(qū)系組成有關(guān)，不同豬種的腸道微生物組成也不相同。Kim等[37]研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物不同生長(zhǎng)階段的腸道微生物組成也各不相同。張輝等[38]通過對(duì)不同處理組中梅花鹿的瘤胃液樣品進(jìn)行宏基因組測(cè)序，結(jié)果顯示，飼喂粗纖維較多的玉米秸葉，優(yōu)勢(shì)菌群為能降解纖維的瘤胃球菌屬和纖維桿菌屬;飼喂含碳水化合物較多的柞樹葉時(shí)，普雷沃菌屬等為優(yōu)勢(shì)菌群，表明飼喂柞樹葉更能促進(jìn)新陳代謝，更適合東北梅花鹿?fàn)I養(yǎng)需求以及瘤胃微生物的繁殖和生長(zhǎng)。溫康等[39]通過對(duì)朗德鵝的腸道微生物進(jìn)行16S rRNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)填飼組朗德鵝的空腸和回腸中的厚壁菌門以及放線菌門的相對(duì)豐度明顯增加，其中放線菌門數(shù)量的增加可能和鵝肥肝不發(fā)生病變有關(guān)系。Danzeisen等[40]研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加莫能霉素可減少雞回腸中氏菌屬（Roseburia）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、腸球菌屬（Enterococcus），增加糞球菌屬（Coprococcus）、還原菌屬（Anaerofilum）以及硫酸鹽，在同時(shí)添加威里霉素或泰樂菌素的對(duì)照組中，出現(xiàn)大量埃希氏菌屬（Escherichia coil）。譚振[41]證實(shí)在飼料效率存在差異的情況下，相同豬種的糞便及腸道各段微生物之間存在差異，回腸中的優(yōu)勢(shì)菌屬是厭氧桿菌屬（Anaerobacter）和Turicibacter，而在結(jié)腸中普氏菌屬（Prevotalla）、顫桿菌克（Oscillibacter）和琥珀酸弧菌屬（Succinivibrio）則相對(duì)更加富集，表明高低飼料效率組在盲腸位置上差異的通路主要與丙酮酸相關(guān)代謝途徑有關(guān)，結(jié)腸微生物差異與多個(gè)參與到輔酶因子和維生素代謝有關(guān)。

通過對(duì)腸道微生物菌群的變化進(jìn)行測(cè)定，可以探究不同飼料對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的影響。張孟陽(yáng)等[42]用16S rRNA測(cè)序手段對(duì)海蘭褐蛋仔雞進(jìn)行分析，得出結(jié)論如下：發(fā)酵飼料可使仔雞腸道脫硫弧菌屬的相對(duì)豐度降低，在腸道疾病方面起到預(yù)防的作用;厚壁菌門的相對(duì)豐度增加可促進(jìn)仔雞生長(zhǎng)發(fā)育。

同種動(dòng)物在不同環(huán)境中長(zhǎng)大，其腸道微生物菌群也不相同;相同環(huán)境下，對(duì)動(dòng)物采取不一樣的處理其腸道微生物菌群也不一樣。在宏基因組的幫助下，可以對(duì)菌群的變化進(jìn)行直觀分析，判斷這些改變是否對(duì)動(dòng)物有益、能否在生產(chǎn)實(shí)踐上進(jìn)行利用。在常規(guī)環(huán)境下長(zhǎng)大的新西蘭兔腸道微生物多樣性顯著高于同一批成長(zhǎng)于SPF（specific pathogen free）環(huán)境下的新西蘭兔，其中常規(guī)環(huán)境組的厚壁菌門顯著高于SPF組，由厚壁菌門產(chǎn)生的SCFAs會(huì)對(duì)其免疫力起到增強(qiáng)作用[43]。對(duì)新西蘭白兔采取禁食軟糞的措施，會(huì)影響到其腸道發(fā)育以及腸道微生物的多樣性，這可能與擬桿菌屬的增加以及瘤胃球菌屬減少有關(guān)，此外還發(fā)現(xiàn)了顫桿菌克（Oscillibacter）與Akkermansia菌屬可能對(duì)新西蘭兔的體重和脂質(zhì)代謝有調(diào)節(jié)作用[44]。通過對(duì)不同飼養(yǎng)環(huán)境下的黑葉猴腸道菌群進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門和擬桿菌門能夠在纖維物質(zhì)消化方面起作用，梭菌屬、普雷沃氏菌屬在分解纖維素以及碳水化合物的降解方面起到重要作用[45]。這些研究表明了腸道微生物的變化受到多種因素的影響，對(duì)腸道微生物的菌群進(jìn)行調(diào)節(jié)不僅可以預(yù)防疾病的發(fā)生還可以對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行有效調(diào)節(jié)，以此滿足生產(chǎn)生活的需求。

6 小結(jié)

動(dòng)物腸道內(nèi)棲居著豐富的微生物菌群，它們和腸道環(huán)境保持著動(dòng)態(tài)平衡，形成一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的腸道微生態(tài)系統(tǒng)，腸道微生物對(duì)宿主的生長(zhǎng)和發(fā)育發(fā)揮著重要作用，影響著機(jī)體的健康。目前，腸道微生物菌群的調(diào)控已經(jīng)逐漸應(yīng)用于人類疾病的預(yù)防和治療。但是，關(guān)于通過調(diào)控腸道微生物來影響動(dòng)物生產(chǎn)方面的研究鮮有報(bào)道，在今后的研究中可以把腸道微生物菌群的結(jié)構(gòu)和功能與動(dòng)物的生產(chǎn)實(shí)踐相聯(lián)系，以期開發(fā)出新的畜禽飼料，預(yù)防畜禽的疾病，促進(jìn)畜禽的健康養(yǎng)殖，減少因疾病引起的損失等。因此，用宏基因組的方法研究這些菌群有著非常重要的實(shí)踐意義。

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