基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討柴胡-黃芩藥對(duì)治療癌性發(fā)熱的作用機(jī)制▲

謝虹亭 謝飛宇 龍思丹 陳美池 薛 鵬 朱世杰

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京市 100029；2 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院腫瘤科，北京市 100102)

癌性發(fā)熱是中晚期癌癥患者常見的并發(fā)癥之一，以持續(xù)低熱、反復(fù)難愈為主要臨床特點(diǎn)。發(fā)熱會(huì)引起患者身心不適，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量、營(yíng)養(yǎng)狀況及治療效果。癌性發(fā)熱是除感染外導(dǎo)致癌癥患者體溫升高的主要原因，在癌癥相關(guān)性發(fā)熱中占比高達(dá)41%[1]。癌性發(fā)熱是由癌癥本身引起的副腫瘤綜合征，特指非感染性發(fā)熱，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。有學(xué)者認(rèn)為癌性發(fā)熱是由壞死的癌細(xì)胞和骨髓細(xì)胞釋放的白細(xì)胞介素(interleukin,IL)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、干擾素等細(xì)胞因子造成下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞功能紊亂所致[2]。西醫(yī)常用糖皮質(zhì)激素或非甾體抗炎藥對(duì)癥治療，這些藥物雖然起效快，但藥效持續(xù)時(shí)間短、發(fā)熱易復(fù)發(fā)，還會(huì)引起胃腸道功能紊亂、肝腎功能損害等不良反應(yīng)，不利于癌癥患者的長(zhǎng)期預(yù)后[3]。

中醫(yī)的“整體觀”“辨證論治”和中藥的“多成分””多靶點(diǎn)”在癌性發(fā)熱治療中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，能提高患者的生活質(zhì)量[4]。癌性發(fā)熱屬于中醫(yī)內(nèi)傷發(fā)熱病范疇，其基本病機(jī)是臟腑功能失調(diào)、氣血陰陽(yáng)失和。對(duì)于癌癥患者，體內(nèi)癥積影響氣血運(yùn)行，瘀血、痰濕、癌毒蘊(yùn)郁而生，此類癥積產(chǎn)物導(dǎo)致氣機(jī)升降失調(diào)、陰陽(yáng)開合失司，因而發(fā)熱。少陽(yáng)膽為臟腑之樞，與肝共調(diào)全身氣機(jī)升降；少陽(yáng)三焦為氣血津液之樞，乃營(yíng)衛(wèi)氣血運(yùn)行之通道也。因此，癥積引起的少陽(yáng)樞機(jī)不利可用和解之法，解郁積、和陰陽(yáng)，使陰平陽(yáng)秘，癌熱自消。小柴胡湯是和解少陽(yáng)法的代表方劑，柴胡與黃芩是其核心藥對(duì)。有文獻(xiàn)報(bào)告以柴胡類方為代表的和解少陽(yáng)法是治療癌性發(fā)熱的基本方法[5]。一項(xiàng)基于數(shù)據(jù)挖掘的癌性發(fā)熱中醫(yī)用藥規(guī)律研究表明，柴胡-黃芩藥對(duì)使用的支持度高達(dá)到32.52%[6]?？梢姴窈忘S芩被廣泛用于治療癌性發(fā)熱。但目前系統(tǒng)地闡釋柴胡-黃芩藥對(duì)治療癌性發(fā)熱的活性成分和作用機(jī)制的研究仍較少。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)為基礎(chǔ)[7]，從整體水平研究“藥物-靶點(diǎn)-疾病”的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，進(jìn)而指導(dǎo)新藥研發(fā)及藥理作用研究，其整體性和系統(tǒng)性與中醫(yī)整體觀和辨證論治不謀而合[8]。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，探討柴胡-黃芩藥對(duì)治療癌性發(fā)熱的活性成分和作用機(jī)制，為進(jìn)一步藥理實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 柴胡-黃芩藥對(duì)的活性化學(xué)成分及其相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP；https://old.tcmsp-e.com/molecule.php)檢索“柴胡”和“黃芩”兩味中藥的化學(xué)成分，并設(shè)置口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、藥物相似性(drug likeness，DL)≥0.18初步篩選活性化學(xué)成分，然后在該平臺(tái)上檢索活性化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，剔除無(wú)靶點(diǎn)的化學(xué)成分，獲得柴胡、黃芩的活性化學(xué)成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)[9]。最后，在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)中，將限定物種設(shè)置為人類，再對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)基因名轉(zhuǎn)換[10]。

1.2 癌性發(fā)熱相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 以“cancerous fever”和“neoplastic fever”為關(guān)鍵詞，在GeneCards?數(shù)據(jù)庫(kù)[11](https://www.genecards.org)、OMIM?數(shù)據(jù)庫(kù)[12](http://www.omim.org)和TTD數(shù)據(jù)庫(kù)[13](http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)中進(jìn)行癌性發(fā)熱相關(guān)靶點(diǎn)的搜索，搜索時(shí)間為2000年1月1日至2022年1月1日。若GeneCards?數(shù)據(jù)庫(kù)中靶點(diǎn)過多，則設(shè)定其“Score值”的中位數(shù)為閾值，篩選出大于閾值的疾病相關(guān)靶點(diǎn)作為目標(biāo)靶點(diǎn)。綜合3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)結(jié)果并刪除重復(fù)項(xiàng)以獲得最終的疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 柴胡-黃芩藥對(duì)治療癌性發(fā)熱相關(guān)靶點(diǎn)的獲取及其蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將柴胡、黃芩活性化學(xué)成分的相關(guān)靶點(diǎn)與癌性發(fā)熱相關(guān)靶點(diǎn)上傳Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)繪制韋恩圖，從而獲得交集靶點(diǎn)，即柴胡-黃芩藥對(duì)治療癌性發(fā)熱的相關(guān)靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)上傳至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org)，構(gòu)建其蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)數(shù)據(jù)[14]，然后使用CytoScape 3.7.2軟件制作PPI網(wǎng)絡(luò)圖[15]。利用CytoScape 3.7.2軟件中的MCODE插件，根據(jù)默認(rèn)的緊密聯(lián)系參數(shù)推測(cè)潛在蛋白質(zhì)功能模塊，并通過Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)分析模塊中靶點(diǎn)參與的生物學(xué)進(jìn)程，將其結(jié)果根據(jù)LgP進(jìn)行由小到大排序，且以P≤0.01為篩選條件，選取符合條件的前3位生物學(xué)進(jìn)程對(duì)其功能進(jìn)行描述[16]。

1.4 交集靶點(diǎn)的功能富集和通路富集分析 基于Metascape平臺(tái)(http://metascape.org/gp/index.html)對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。GO功能富集分析包括生物過程、分子功能和細(xì)胞成分。將各分析結(jié)果根據(jù)P值進(jìn)行由大到小排序，且以P≤0.01為篩選條件，選取符合條件的前20位GO功能、KEGG通路。運(yùn)用微生信平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com)實(shí)現(xiàn)篩選結(jié)果的可視化。

1.5 藥物成分-交集靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將柴胡和黃芩的活性化學(xué)成分、交集靶點(diǎn)及篩選的前20條KEGG通路上傳到CytoScape 3.7.2軟件中，構(gòu)建藥物成分-交集靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。利用CytoScape 3.7.2軟件內(nèi)置的Network Analyzer計(jì)算度值、介度值及緊密度值等拓?fù)鋮?shù)，并根據(jù)度值進(jìn)行由大到小排序，推斷排名前5的藥物活性化學(xué)成分、交集靶點(diǎn)和KEGG通路為柴胡-黃芩藥對(duì)治療癌性發(fā)熱的核心活性化學(xué)成分、核心靶點(diǎn)和核心通路。

1.6 分子對(duì)接 將1.5得出的網(wǎng)絡(luò)中排名前5的交集靶點(diǎn)作為受體蛋白，排名前5的藥物活性化學(xué)成分作為配體蛋白。首先在RCSB-PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)中獲取上述蛋白的“PDB”格式，并在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)下載5種藥物成分的“MOL2”格式。利用AutoDock 1.5.6軟件對(duì)受體蛋白及配體蛋白進(jìn)行去水、加氫、計(jì)算電荷及尋找可旋轉(zhuǎn)化學(xué)鍵等處理，再根據(jù)受體蛋白及配體蛋白大小設(shè)置合適的對(duì)接盒子，并使用“Genetic Algorithm”算法進(jìn)行分子對(duì)接，最后在Pymol中進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié) 果

2.1 柴胡-黃芩藥對(duì)的活性化學(xué)成分及相關(guān)靶點(diǎn) 基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，初步得到17種柴胡活性化學(xué)成分和36種黃芩活性化學(xué)成分，剔除無(wú)靶點(diǎn)的化學(xué)成分后，最終篩選出42種活性化學(xué)成分，其中豆甾醇為柴胡與黃芩的共同成分，故最終獲得12種柴胡活性化學(xué)成分和31種黃芩活性化學(xué)成分，見表1。柴胡活性化學(xué)成分的相關(guān)靶點(diǎn)157個(gè)，黃芩活性化學(xué)成分的相關(guān)靶點(diǎn)80個(gè)，合并后刪除重復(fù)值共得到相關(guān)靶點(diǎn)178個(gè)。

表1 柴胡-黃芩藥對(duì)的主要活性化學(xué)成分

2.2 柴胡-黃芩藥對(duì)治療癌性發(fā)熱相關(guān)靶點(diǎn) 從GeneCards?數(shù)據(jù)庫(kù)獲得癌性發(fā)熱相關(guān)靶點(diǎn)7 142個(gè)，選擇Score值≥10.37的靶點(diǎn)，最終獲得1 145個(gè)癌性發(fā)熱相關(guān)靶點(diǎn)。結(jié)合在OMIM?數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的相關(guān)靶點(diǎn)，去重后合并，最終得到1 562個(gè)癌性發(fā)熱相關(guān)靶點(diǎn)。通過繪制韋恩圖，將178個(gè)主要活性化學(xué)成分相關(guān)靶點(diǎn)與1 562個(gè)癌性發(fā)熱相關(guān)靶點(diǎn)取交集，共獲得98個(gè)交集靶點(diǎn)，即柴胡-黃芩藥對(duì)治療癌性發(fā)熱的相關(guān)靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 柴胡-黃芩藥對(duì)活性化學(xué)成分相關(guān)靶點(diǎn)與癌性發(fā)熱相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖

2.3 柴胡-黃芩藥對(duì)治療癌性發(fā)熱相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò) 利于STRING 11.0及CytoScape 3.7.2構(gòu)建柴胡-黃芩藥對(duì)治療癌性發(fā)熱相關(guān)靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖2。運(yùn)用CytoScape 3.7.2中的 MCODE 插件推測(cè)出PPI網(wǎng)絡(luò)中的2個(gè)潛在蛋白質(zhì)功能模塊，見圖3。使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)潛在蛋白質(zhì)功能模塊中的靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)進(jìn)程分析，根據(jù)P值的對(duì)數(shù)值，保留模塊中前3位的生物學(xué)進(jìn)程并描述其功能。見表2。

圖2 柴胡-黃芩藥對(duì)治療癌性發(fā)熱相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)中的潛在蛋白質(zhì)功能模塊

表2 PPI網(wǎng)絡(luò)中潛在蛋白質(zhì)功能模塊的功能

2.4 柴胡-黃芩藥對(duì)治療癌性發(fā)熱相關(guān)靶點(diǎn)的功能富集和通路富集結(jié)果 基于Metascape數(shù)據(jù)平臺(tái)，對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析(P≤0.01)，得到1 730個(gè)生物過程條目、111個(gè)分子功能條目、72個(gè)細(xì)胞成分條目；進(jìn)行KEGG通路富集分析(P≤0.01)，得到291個(gè)KEGG通路。根據(jù)P值從大到小排序，分別取4種富集分析結(jié)果的前20個(gè)條目，利用作圖平臺(tái)進(jìn)行可視化，見圖4。其中，生物過程條目以對(duì)脂多糖、細(xì)菌、細(xì)菌源和脂質(zhì)等的應(yīng)答，以及對(duì)凋亡信號(hào)通路、血管形態(tài)形成等的調(diào)控為主；分子功能條目則以蛋白激酶結(jié)合、激酶結(jié)合和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等為主；細(xì)胞成分條目主要涉及膜微區(qū)、膜筏、囊泡腔和細(xì)胞外基質(zhì)等；KEGG通路涉及癌癥相關(guān)通路、肝炎通路、TNF信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡通路和IL-17信號(hào)通路等，其中癌癥通路中包含膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌等。

圖4 柴胡-黃芩治療癌性發(fā)熱相關(guān)靶點(diǎn)靶點(diǎn)的功能和通路富集分析氣泡圖

2.5 藥物成分-交集靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖 運(yùn)用CytoScape 3.7.1構(gòu)建藥物成分-交集靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖(圖5)后，通過CytoScape 3.7.1內(nèi)置的Network Analyzer分析柴胡-黃芩藥對(duì)治療癌性發(fā)熱網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，推測(cè)柴胡的檞皮素(度值為0.63，介度值為83，緊密度值為0.40)、山奈酚(度值為0.43，介度值為28，緊密度值為0.40)、異鼠李素(度值為0.39，介度值為13，緊密度值為0.01)，以及黃芩的漢黃芩素(度值為0.40，介度值為15，緊密度值為0.01)和黃芩素(度值為0.40，介度值為15，緊密度值為0.01)為柴胡-黃芩藥對(duì)治療癌性發(fā)熱的核心活性化學(xué)成分。

前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶(prostaglandin endoperoxide synthase,PTGS)2(度值為0.50，介度值為34，緊密度值為0.11)為柴胡-黃芩藥對(duì)治療癌性發(fā)熱的核心靶點(diǎn)，同時(shí)PTGS1(度值為0.48，介度值為24，緊密度值為0.05)、絲氨酸蛋白酶1(serine protease 1,PRSS1；度值為0.48，介度值為23，緊密度值為0.05)、Caspase-3(度值為0.47，介度值為21，緊密度值為0.02)、蛋白激酶Bα(protein kinase Bα,AKT1；度值為0.46，介度值為21，緊密度值為0.01)亦為柴胡-黃芩藥對(duì)治療癌性發(fā)熱重要靶點(diǎn)。

柴胡-黃芩藥對(duì)主要通過癌癥相關(guān)通路(度值為0.48，介度值為52，緊密度值為0.09)治療癌性發(fā)熱，同時(shí)也涉及肝炎通路(度值為0.39，介度值為30，緊密度值為0.02)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路(度值為0.38，介度值為26，緊密度值為0.01)、TNF通路(度值為0.41，介度值為23，緊密度值為0.01)和IL-17通路(度值為0.41，介度值為21，緊密度值為0.01)等。見圖5。

圖5 藥物成分-交集靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 分子對(duì)接技術(shù)結(jié)果 度值排名前5的交集靶點(diǎn)分別為PTGS2、PTGS1、PRSS1、Caspase-3、AKT1，度值排名前5的活性化學(xué)成分分別為槲皮素、山奈酚、漢黃芩素、黃芩素、異鼠李素。5種受體蛋白與5種配體蛋白的結(jié)合能見表4，結(jié)合能排名前6的分子對(duì)接技術(shù)可視化示意圖見圖6。

表4 5種受體蛋白與5種配體蛋白對(duì)接的平均結(jié)合能(kcal/mol)

PRSS1-槲皮素 AKT1-槲皮素

3 討 論

癌性發(fā)熱的病理機(jī)制仍未完全明確。有學(xué)者認(rèn)為癌性發(fā)熱是由于腫瘤細(xì)胞或腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞釋放的IL-1、IL-6、TNF-α和干擾素觸發(fā)下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞的血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元生成前列腺素E2，從而重置視前區(qū)的熱調(diào)節(jié)設(shè)定點(diǎn)，進(jìn)而引起發(fā)熱反應(yīng)[2,17]。這些細(xì)胞因子在中醫(yī)中被認(rèn)為是癌癥患者臟腑功能失調(diào)后產(chǎn)生的痰濕、瘀血和癌毒等病理產(chǎn)物，可阻滯人體內(nèi)陰陽(yáng)開闔，從而郁積生熱。人體陰陽(yáng)開闔以少陽(yáng)為樞機(jī)，因而癌性發(fā)熱可歸結(jié)為機(jī)體少陽(yáng)樞機(jī)不利而致“郁熱”[18]，多用和解少陽(yáng)法調(diào)達(dá)樞機(jī)。柴胡與黃芩是和解少陽(yáng)的經(jīng)典配伍，《醫(yī)方考》曰“柴胡、黃芩能和解少陽(yáng)經(jīng)之邪”，可見柴芩藥對(duì)在方中起著和解少陽(yáng)、運(yùn)轉(zhuǎn)樞機(jī)的主導(dǎo)作用?！端幤坊x》曰“所謂內(nèi)熱用黃芩，外熱用柴胡，為和解要?jiǎng)保梢姴窈c黃芩合用可外散半表之熱、內(nèi)清半里之熱。張潔等[19]、尚學(xué)彬等[20]和張輝等[21]使用柴胡類方治療癌性發(fā)熱，其有效率分別達(dá)82.7%、93.75%和80.0%。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出柴胡-黃芩藥對(duì)治療癌性發(fā)熱的核心活性化學(xué)成分，主要有檞皮素、山奈酚、異鼠李素、漢黃芩素和黃芩素等。其中，檞皮素不僅能阻斷TNF-α對(duì)細(xì)胞內(nèi)核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)的激活，減少IL-1、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子的產(chǎn)生[22]，還能阻斷磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)通路，從而抑制環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)的生成，而COX是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的關(guān)鍵酶[22]。山奈酚則可通過抑制還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的活性從而抑制NF-κB的表達(dá)[23]，同時(shí)對(duì)COX-1、COX-2均有明顯的抑制作用[24]。異鼠李素能下調(diào)NF-κB的表達(dá)從而減少IL-6的釋放，并能抑制MAPK通路以減少COX-2、IL-1、IL-6和TNF-α等炎癥因子釋放[25]。漢黃芩素能抑制COX-1的合成，從而抑制前列腺素的產(chǎn)生[26-27]。黃芩素能明顯下調(diào)COX-2蛋白的表達(dá)，抑制IL-6、IL-1β和TNF-α等細(xì)胞因子的釋放，并能抑制p38的磷酸化從而抑制NF-κB信號(hào)通路的激活,進(jìn)而發(fā)揮解熱的作用[28-30]。此外，上述成分除了發(fā)揮解熱作用，還具有直接抗腫瘤功效，通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖達(dá)到治療“癌因性”致熱。檞皮素能抑制MAPK/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶途徑(extracellular regulated protein kinase,ERK)[31]、激活Caspase-3/7并抑制B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)的表達(dá)從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[32]。山奈酚還能抑制PI3K/AKT通路從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[33]。異鼠李素則通過升高活性氧簇水平及降低細(xì)胞周期蛋白B1(cyclin B1)的表達(dá)從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯[34]。黃芩素可選擇性調(diào)控MAPK/ERK1、MAPK/ERK2 信號(hào)通路，從而可控制腫瘤細(xì)胞周期阻滯、凋亡和衰老的分子過程[35]。漢黃芩素則通過抑制NF-κB/Bcl-2通路的激活，促進(jìn)Caspase-3和Caspase-9的裂解從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[36]。由此可見，檞皮素、山奈酚、異鼠李素、漢黃芩素和黃芩素不僅能通過減少IL-1、IL-6、TNF-α和COX的生成，從而抑制前列腺素的產(chǎn)生，發(fā)揮解熱作用以治標(biāo)，還能通過抑制MAPK/ERK通路、激活Caspase蛋白、降低細(xì)胞周期蛋白表達(dá)等途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果表明，柴胡-黃芩治療癌性發(fā)熱的核心靶點(diǎn)包括PTGS2、PTGS1、PRSS1、Caspase-3、AKT1。PTGS2和PTGS1分別是COX-2和COX-1的編碼基因。COX是體內(nèi)催化花生四烯酸合成前列腺素家族的關(guān)鍵酶，而前列腺素家族中的前列腺素2是內(nèi)源性致熱源引起發(fā)熱的主要介質(zhì)，其通過增加冷敏神經(jīng)元放電并減少熱敏神經(jīng)元放電來(lái)升高體溫調(diào)定點(diǎn)，從而引起發(fā)熱，阻斷前列腺素2合成的藥物具有明顯的解熱作用[37-38]。PRSS1、Caspase-3和AKT1基因參與了腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的過程。PRSS1主要經(jīng)非受體酪氨酸激酶/信號(hào)傳導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)通路調(diào)控細(xì)胞增殖[39]；Caspase-3則參與死亡受體/死亡配體途徑從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[40]；AKT1是PI3K/AKT信號(hào)通路中核心因子，參與著腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成[41]。目前尚缺乏研究證實(shí)檞皮素、山奈酚、異鼠李素、漢黃芩素和黃芩素對(duì)PTGS2和PTGS1具有直接的抑制作用，但這5種活性化學(xué)成分均能抑制COX的合成，故筆者推測(cè)這5種活性化學(xué)成分可能對(duì)PTGS2和PTGS1基因的表達(dá)有抑制作用，減少前列腺素釋放，從而發(fā)揮解熱作用。雖然上述5種成分直接作用于PRSS1、Caspase-3和AKT1的研究較少，但檞皮素、山奈酚、異鼠李素、黃芩素和漢黃芩素可參與調(diào)控上述靶點(diǎn)的信號(hào)通路，故筆者推測(cè)這5種成分能抑制它們的表達(dá)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。同時(shí)，本研究分子對(duì)接技術(shù)結(jié)果表明，PRSS1、AKT1與檞皮素，AKT1與山奈酚，PTGS1與黃芩素，Caspase-3、PTGS1與異鼠李素的對(duì)接結(jié)合能均<-5，提示篩選出的核心活性化學(xué)成分與核心靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性。

本研究GO功能富集分析和KEGG通路富集分析的結(jié)果顯示，柴胡-黃芩藥對(duì)治療癌性發(fā)熱的作用機(jī)制主要涉及癌癥相關(guān)通路、MAPK通路、干擾素通路、IL-17通路和肝炎通路，上述通路均參與腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡過程。腫瘤細(xì)胞的增殖過程呈異常代謝狀態(tài)，凋亡基因表達(dá)被抑制，同時(shí)釋放IL-1、IL-6、TNF-α和干擾素等細(xì)胞因子，其可誘發(fā)炎癥并級(jí)聯(lián)活化TNF通路[42]。TNF通路的下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑主要有NF-κB激活的信號(hào)傳導(dǎo)、c-Jun氨基末端激酶信號(hào)傳導(dǎo)及細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)。NF-κB被激活后釋放的IL-1、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子在癌性發(fā)熱中起主要作用，這些細(xì)胞因子可直接刺激體溫調(diào)節(jié)中樞引起發(fā)熱[2,17]。此外，這些細(xì)胞因子還可促進(jìn)腫瘤相關(guān)血管生成，保障腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)，并促進(jìn)腫瘤的侵襲[43]，這也為TNF通路提供了啟動(dòng)因子，形成惡性正反饋機(jī)制。IL-17信號(hào)通路主要包括IL-17A信號(hào)通路和IL-17F信號(hào)通路，IL-17A可直接激活NF-κB，并且下調(diào)miR-23b的表達(dá)水平，進(jìn)一步放大IL-17A激活NF-κB信號(hào)的作用；IL-17A與TNF-α具有協(xié)同作用，能共同增強(qiáng)TNF-α所誘導(dǎo)基因的mRNA穩(wěn)定性，增加TNF-α的釋放，從而誘導(dǎo)發(fā)熱[44]。檞皮素、山奈酚、異鼠李素、黃芩素及漢黃芩素一方面可以抑制癌癥相關(guān)通路，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從根源減少炎癥因子釋放；另一方面又能抑制TNF和IL-17兩條信號(hào)通路，防止炎癥因子介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，進(jìn)一步減少致熱細(xì)胞因子的釋放。因此，筆者推測(cè)柴胡-黃芩藥對(duì)通過抗腫瘤和抗炎解熱兩方面來(lái)治療癌性發(fā)熱。

綜上所述，柴胡和黃芩是柴胡類方的關(guān)鍵組成，是“和解少陽(yáng)法”的基礎(chǔ)配伍，藥對(duì)中的檞皮素、山奈酚、異鼠李素、黃芩素和漢黃芩素能夠抑制PTGS2、PTGS1基因表達(dá)從而減少前列腺素合成，并抑制PRSS1、Caspase-3和AKT1表達(dá)從而抑制腫瘤增殖；其通過抑制癌癥相關(guān)通路、TNF通路和 IL-17通路的激活，從而減少IL-1、IL-6、TNF-α等致熱細(xì)胞因子的釋放。柴胡、黃芩能同時(shí)發(fā)揮抗腫瘤和抗炎解熱兩方面的作用以達(dá)到治療癌性發(fā)熱的目的。這為臨床運(yùn)用柴胡類方治療癌性發(fā)熱及腫瘤相關(guān)性發(fā)熱提供了科學(xué)依據(jù)。然而本研究主要是以生物信息學(xué)與海量數(shù)據(jù)計(jì)算的結(jié)果為基礎(chǔ)，后續(xù)將在此基礎(chǔ)上進(jìn)行動(dòng)物或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，進(jìn)而明確柴胡-黃芩藥對(duì)治療癌性發(fā)熱的主要調(diào)控靶點(diǎn)。