利用高通量表型平臺(tái)分析紫葉紫菜薹新組合19-520的表型特征

朱紅芳 李曉鋒 奚丹丹 高璐 張兆輝 朱玉英

摘要：?以紫葉紫菜薹組合19-520和2個(gè)親本材料為試驗(yàn)材料，于播種后75 d，以普通綠葉紫菜薹為對(duì)照，采用高通量表型平臺(tái)進(jìn)行表型測(cè)定和LemnaTec Scanalyzer 3D成像。研究了紫葉紫菜薹組合19-520及其親本株高、幅寬、緊密度、投影面積和植株相對(duì)含水量等指標(biāo)的差異。結(jié)果表明，紫葉紫菜薹組合19-520的株高、幅寬、植株緊密度、投影面積、相對(duì)含水量和花青素相對(duì)含量均較高，表型特征表現(xiàn)優(yōu)良。因此，紫葉紫菜薹組合19-520作為新的紫菜薹組合在綜合表型上表現(xiàn)良好，可進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：?紫菜薹;株高; 投影面積;緊密度;相對(duì)含水量

中圖分類(lèi)號(hào)：?S634.6??文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A??文章編號(hào)：?1000-4440（2021）02-0465-06

Abstract：?The combination of 19-520 and its two parent materials were used as the test meterials and the normal green leaf purple-caitai was used as the control to test the phenotype and make the LemnaTec Scanalyzer 3D imaging by using the high-throughput phenotype platform 75 days after sowing. The differences in plant height， width， compactness， projection area and relative water content of the combination 19-520 and its parents were studied. The results showed that the plant height， width， plant compactness， projection area， relative contents of water and anthocyanin of 19-520 were all better than its parents and the normal green leaf purple-caitai， and the phenotypic characteristics were excellent. As a new purple leaf purple-caitai combination，19-520 has significant comprehensive phenotypic characteristics， which can be further applied in popularization and application.

Key words：?purple-caitai;plant height;projection area;compactness;relative water content

植物遺傳學(xué)、育種學(xué)和生物信息學(xué)的研究離不開(kāi)植物基因型、表型和環(huán)境這3個(gè)因素[1]，生物學(xué)家Freimer等[2]、Houle等[3]和Gjuvsland等[4]先后對(duì)表型進(jìn)行了定義，認(rèn)為表型是生物某一特定的物理外觀或者結(jié)構(gòu)組成，也就是植株個(gè)體在特定環(huán)境條件下表現(xiàn)出來(lái)的性狀特征總和。研究生物表型特征的學(xué)科被稱(chēng)為表型組學(xué)，這一概念由Steven A.Garan在1996年最早提出，他將生物各方面的表型特征作為一個(gè)整體來(lái)研究，這個(gè)研究的整體即為表型組學(xué)。將生物群體詳細(xì)的表型數(shù)據(jù)信息結(jié)合生物群體的基因型特征進(jìn)行分析，是基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)，并可以應(yīng)用于復(fù)雜生物體生命系統(tǒng)的研究中[5]。利用可見(jiàn)光、超光譜、近紅外、遠(yuǎn)紅外以及X光成像技術(shù)構(gòu)建分析平臺(tái)，并利用該平臺(tái)進(jìn)行表型分析的組學(xué)稱(chēng)為高通量表型組學(xué)，利用高通量表型組學(xué)可以在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)大量植物個(gè)體多維表現(xiàn)型的高精度獲取和定量分析現(xiàn)代技術(shù)體系[6]。

近年來(lái)，高通量表型技術(shù)得到快速發(fā)展[6]，各類(lèi)表型測(cè)量?jī)x器和表型平臺(tái)迅速被開(kāi)發(fā)和建立[7]，進(jìn)一步提升了全自動(dòng)、高通量表型成像技術(shù)，能更加準(zhǔn)確、快速、標(biāo)準(zhǔn)地進(jìn)行表型研究[8]，與傳統(tǒng)的植物表型性狀的調(diào)查分析相比，高通量表型技術(shù)測(cè)量分析更省時(shí)省力，受人為因素影響很小，不需要破壞組織進(jìn)行取樣，且能連續(xù)監(jiān)測(cè)植物的生長(zhǎng)狀態(tài)和植物的動(dòng)態(tài)變化[9-10]。在水稻[11]、玉米[12]和谷類(lèi)[13]等作物上逐漸被應(yīng)用。高通量表型技術(shù)的發(fā)展為系統(tǒng)地研究植株表型以及加快植物新品種的選育提供了技術(shù)支撐。

AgriPhenoTM開(kāi)放式科研平臺(tái)由上海澤泉科技股份有限公司在浦東孫橋現(xiàn)代農(nóng)業(yè)園區(qū)投資建設(shè)，該平臺(tái)是國(guó)內(nèi)第一家為植物研究和育種提供高通量植物表型分析、植物基因型分析以及植物表型-基因型聯(lián)合分析服務(wù)的平臺(tái)。引進(jìn)了目前全球先進(jìn)的與表型植物育種相關(guān)的設(shè)施和設(shè)備，為植物生長(zhǎng)、生理生態(tài)變化、基因型和表型結(jié)合分析提供全面服務(wù)[14]。

紫菜薹（Brassica compestris L. var. purpurea Bailey 2n=2x=20）原產(chǎn)于中國(guó)，主栽于湖北、湖南和重慶等長(zhǎng)江流域地區(qū)，又名紅菜薹，是十字花科蕓薹屬亞種之一。紫菜薹的薹色紫紅而鮮亮，薹葉較小，主要食用器官為花薹和薹葉，新鮮的花薹和薹葉看上去肥嫩多汁，嘗起來(lái)脆爽可口，且富含多種礦質(zhì)元素。近幾年，紫菜薹因其紫色的花薹富含豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)尤其是具有保健功能的花青素，已經(jīng)作為優(yōu)質(zhì)高檔的蔬菜在全國(guó)范圍內(nèi)引種栽培[15-16]。花青素分為天竺葵色素、矢車(chē)菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、牽?；ㄉ睾湾\葵色素等6大類(lèi)，它不僅使蔬菜、水果和花卉看起來(lái)五彩繽紛，而且具有抗氧化能力，對(duì)心臟病、動(dòng)脈硬化、靜脈炎、關(guān)節(jié)炎、過(guò)敏、老年性癡呆、冠心病及癌癥等有防治作用。隨著人們生活水平的提高，花青素的保健作用逐步引起人們的重視，對(duì)紫菜薹新品種的要求也越來(lái)越高，為此本課題組經(jīng)過(guò)多年的育種工作，創(chuàng)制了葉片、葉柄和菜薹均富含花青素的新種質(zhì)，并選育出具有發(fā)展?jié)摿Φ淖先~紫菜薹新組合19-520。

本試驗(yàn)借助上海澤泉科技股份有限公司的AgriPhenoTM開(kāi)放式科研平臺(tái)對(duì)已育成的紫葉紫菜薹新組合19-520進(jìn)行表型數(shù)據(jù)收集，分析該組合在生長(zhǎng)中的表型特征。為紫葉紫菜薹的推廣和應(yīng)用，提供更多表型數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)地概況

該試驗(yàn)于2019年12月至2020年1月在上海澤泉科技股份有限公司的玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行，該公司位于上海自由貿(mào)易試驗(yàn)區(qū)，屬北亞熱帶季風(fēng)氣候。

1.2?試驗(yàn)材料

供試紫菜薹是由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所經(jīng)過(guò)多年的培育獲得的紫葉紫菜薹新組合19-520及19-520的親本P1、P2。該組合屬于晚熟類(lèi)型，葉片、葉柄、葉脈以及花薹均為紫色，花薹略帶蠟粉;親本P1屬于中晚熟類(lèi)型，葉片、葉柄、葉脈以及花薹也均為紫色，花薹無(wú)蠟粉;親本P2屬于晚熟類(lèi)型，葉片、葉柄、葉脈以及花薹也均為紫色，花薹略有蠟粉。對(duì)照（CK）為普通綠葉紫菜薹，葉柄、主葉脈和花薹均為紫色，花薹略帶蠟粉。

1.3?試驗(yàn)處理

2019年8月10日選取飽滿、整齊一致的種子，點(diǎn)播在穴盤(pán)中，基質(zhì)為泥炭和蛭石的混合物，體積比為3∶1。播種后30 d進(jìn)行大棚定植，45 d后每個(gè)材料選擇3株大小一致的植株，進(jìn)行表型成像，每株選取第三片功能葉，分別進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定?；ㄞ烽L(zhǎng)到35 cm左右時(shí)取CK、新組合19-520以及新組合19-520的親本P1和P2的葉片、葉柄和花薹測(cè)定花青素的含量，每個(gè)品種（組合）選擇9株，每3株混合取樣，作為1個(gè)重復(fù)，共3次重復(fù)，測(cè)定方法參照試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司產(chǎn)品）說(shuō)明書(shū)，應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定樣品中花青素（ANTH）水平。

1.4?測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.4.1?圖像獲取?先選擇高通量表型平臺(tái)上的可見(jiàn)光成像系統(tǒng)進(jìn)行成像，然后利用德國(guó)LemnaTec公司的Scanalyzer3D成像軟件Lemna Control進(jìn)行圖片獲取，拍照時(shí)可以選擇可見(jiàn)光與近紅外雙鏡頭對(duì)放入平臺(tái)的供試材料進(jìn)行拍照，并對(duì)供試材料進(jìn)行無(wú)損成像?？梢?jiàn)光鏡頭和近紅外鏡頭的成像角度均選擇頂部、側(cè)面0°和90°?？梢?jiàn)光鏡頭參數(shù)設(shè)置為，頂部exposure 20、focus 2 000、zoom 2 000，側(cè)面exposure 20、focus 3 500、zoom 1 500;近紅外鏡頭參數(shù)設(shè)置為，頂部exposure 30 030、focus 500、zoom 1 500，側(cè)面exposure 30 030、focus 100、zoom 1 500。成像后選擇單株頂部、側(cè)面0°和側(cè)面90°的原始圖像各1張，并保存至系統(tǒng)的Lemna Base文件中[14]。

1.4.2?數(shù)據(jù)分析?數(shù)據(jù)分析根據(jù)何紅梅等[9]報(bào)道的步驟進(jìn)行，首先，Lemna Mine導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)（以pixel為單位）。然后，利用像素轉(zhuǎn)換系數(shù)（pix-el/mm）將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)為單位的數(shù)據(jù)在Excel 2010軟件上整理。最后，利用LemnaTec Scanalyzer 3D的分析軟件Lemna Grid編輯圖像，并計(jì)算紫菜薹植株生長(zhǎng)相關(guān)的表型數(shù)據(jù)。表型數(shù)據(jù)的計(jì)算分析主要包括株高、幅寬、總投影面積、緊密度和植株相對(duì)含水量。其中株高和幅寬采用側(cè)面 0°與側(cè)面 90°數(shù)據(jù)的平均值，總投影面積為側(cè)面0°、90°與頂部數(shù)據(jù)的總和。所獲得的樣本數(shù)據(jù)都用Excel進(jìn)行整理，并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。利用SPSS 20軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

2?結(jié)果與分析

2.1?紫菜薹表型及分析圖的獲得

紫菜薹在高通量表型平臺(tái)上，通過(guò)可見(jiàn)光和近紅外進(jìn)行表型成像后，每一個(gè)單株都獲得3張RGB圖像，分別為紫菜薹植株頂部圖像、側(cè)面0°和側(cè)面90°圖像，如圖1所示，a為植株頂部的成像，b1 和b2分別為側(cè)面0°和側(cè)面90°成像，并列出親本P1和P2，紫葉紫菜薹組合19-520及CK的相關(guān)表型圖像及其分析圖。根據(jù)可見(jiàn)光和遠(yuǎn)紅光成像的圖片分析可以獲得植株的株高、幅寬、緊密度、相對(duì)含水量等重要的農(nóng)藝表型特征。

2.2?紫菜薹的株高與幅寬

植株的株高和幅寬是衡量植株高矮和水平寬窄的重要指標(biāo)，紫菜薹植株的株高和幅寬是利用可見(jiàn)光側(cè)面成像得到的。植株株高計(jì)算的是植株根基部到頂部之間的距離，幅寬計(jì)算的是植株水平寬度。由圖2可知，紫葉紫菜薹組合19-520的植株幅寬為662.54 mm，與CK差異不顯著，與雙親P1和P2差異顯著。紫葉紫菜薹組合19-520的植株株高為736.57 mm，與CK及其雙親P1和P2差異顯著。說(shuō)明紫葉紫菜薹組合19-520植株高，水平幅寬寬，在生長(zhǎng)勢(shì)上比其親本具有一定的雜交優(yōu)勢(shì)。

2.3?紫菜薹的緊密度

緊密度是衡量植株緊密程度的指標(biāo)，本試驗(yàn)的緊密度根據(jù)頂部獲得的表型數(shù)據(jù)，按照植株的投影面積與最小外接多邊形面積的比值分析，比值越大，植株越緊密。由圖3可見(jiàn)，紫葉紫菜薹組合19-520的頂部緊密度為0.50，比CK及其親本P1和P2顯著增加。紫葉紫菜薹組合19-520在其親本和CK中的頂部緊密度表現(xiàn)為最高，說(shuō)明紫葉紫菜薹組合19-520植株在生長(zhǎng)過(guò)程中葉片、葉柄最為緊密。

2.4?紫菜薹的投影面積分析

光投射在物體上所留下影子的面積為投影面積，受投影不同角度的影響而產(chǎn)生不同的投影面積，其中總投影面積為紫菜薹植株頂部、側(cè)面0°、側(cè)面90°的投影面積之和[17]。如圖4所示，紫葉紫菜薹組合19-520的總投影面積最大，顯著高于CK、P1和P2的總投影面積。

2.5?紫菜薹的相對(duì)含水量分析

植株相對(duì)含水量主要是通過(guò)近紅外成像獲得[18]，在近紅外分析圖中，相對(duì)含水量根據(jù)成像圖片中植物深淺分級(jí)，顏色越深，相對(duì)含水量越高，灰度分級(jí)也就越低[9]。本試驗(yàn)中以頂部和側(cè)面0°的成像進(jìn)行植株相對(duì)含水量分析。頂部近紅外成像共分為10級(jí)，灰度值介于80～200。從圖5可知，4份材料的相對(duì)含水量均主要集中在2～5級(jí)，其余的等級(jí)所占百分比較少。組合19-520及其親本的2級(jí)相對(duì)含水量所占百分比均低于CK。4份材料中3級(jí)相對(duì)含水量所占百分比均最高，其中組合19-520的3級(jí)相對(duì)含水量所占百分比最大，為58.89%，其次是CK和P1，分別為57.67%和57.13%，P2最小，為33.05%。除親本P2以外，其他3份材料植株頂部2～5級(jí)相對(duì)含水量占比均為90%左右。

側(cè)面0°近紅外成像分析的灰度值也共分為10級(jí)，介于60～200，由圖5的側(cè)面成像可知，4份材料的相對(duì)含水量主要集中在1～5級(jí)，組合19-520的1級(jí)相對(duì)含水量所占百分比為2.76%，其親本P1、P2及CK基本沒(méi)有1級(jí)。 2級(jí)相對(duì)含水量所占百分比最高是組合19-520，為19.19%，其次分別為P2、CK、P1。3級(jí)相對(duì)含水量是4份材料中相對(duì)含水量占比均為最高的，從高到低依次為親本P2（58.28%）、組合19-520（39.40%）、CK（37.72%）、親本P1（20.37%）。除親本P1以外，其他3份材料植株頂部的2～5級(jí)相對(duì)含水量占比均大于90%。

2.6?紫菜薹的花青素含量

由表1可見(jiàn)，紫菜薹花青素相對(duì)含量在葉片、葉柄和花薹中存在著較大的差異。紫葉紫菜薹組合19-520的葉片和葉柄的花青素相對(duì)含量介于2個(gè)親本之間，葉片的花青素相對(duì)含量比CK高96.53%，葉柄的相對(duì)含量則比CK高36.31%。而花薹的花青素相對(duì)含量則不僅高于2個(gè)親本，而且高于CK，差異顯著。

3?討論

隨著市場(chǎng)需求的增大，紫菜薹種植面積逐漸增加，相關(guān)研究也越來(lái)越受到關(guān)注，目前對(duì)紫菜薹的研究主要集中在紫色性狀和分蘗性狀方面[19]，有關(guān)表型的研究很少。本試驗(yàn)利用AgriPhenoTM表型平臺(tái)溫室Scanalyzer3D儀器，以普通綠葉紫菜薹為對(duì)照，對(duì)紫葉紫菜薹新組合及其雙親進(jìn)行表型分析。從其葉片、葉柄和花薹的顏色和測(cè)定的花青素相對(duì)含量等指標(biāo)可知，紫葉紫菜薹組合19-520葉片，葉柄和花薹花青素含量均較高。本試驗(yàn)結(jié)果表明，特色紫葉菜薹組合19-520在幅寬、株高和緊密度上較親本及普通綠葉紫菜薹好，為紫菜薹的表型育種提供了數(shù)據(jù)支撐。

本試驗(yàn)中紫葉紫菜薹組合19-520總投影面積均高于其雙親和對(duì)照，表明了其在生物量和葉面積上比其雙親和對(duì)照高，這與Hairmansis等[11]的結(jié)論一致，認(rèn)為不同角度的投影面積可以簡(jiǎn)單地評(píng)估植株的生物量或葉面積的大小。

植株的相對(duì)含水量是衡量植株品質(zhì)的一個(gè)指標(biāo)，其含水量越高，干物質(zhì)含量就相對(duì)減少，則會(huì)影響產(chǎn)品品質(zhì)[9]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，紫葉紫菜薹組合19-520及其親本和對(duì)照主要以2～5級(jí)的相對(duì)含水量為主，均占到整個(gè)植株相對(duì)含水量的90%左右，其干物質(zhì)含量占比相差不多，品質(zhì)差異不大。通過(guò)使用溫室型Scanalyzer3D儀器，獲得了大量的表型數(shù)據(jù)，我們?cè)诒姸嗟谋硇蛿?shù)據(jù)中，選擇株高、幅寬、緊密度、投影面積和植株相對(duì)含水量等幾個(gè)主要農(nóng)藝性狀指標(biāo)，對(duì)紫葉紫菜薹組合19-520及其雙親和普通綠葉紫菜薹進(jìn)行表型差異分析，結(jié)果表明，高通量表型儀器及其分析軟件能快速獲取植株的表型數(shù)據(jù)，并根據(jù)育種的需要篩選具有代表性的農(nóng)藝性狀指標(biāo)進(jìn)行分析，迅速掌握植株在生長(zhǎng)過(guò)程中的表型性狀，為培育優(yōu)良新品種以及新品種的表型鑒定和品比試驗(yàn)提供高通量的數(shù)據(jù)，有助于新品種的選育。表型數(shù)據(jù)和基因組數(shù)據(jù)的結(jié)合、比對(duì)和分析，將大大提高人們對(duì)植物數(shù)量性狀的選擇能力，從而促進(jìn)高通量表型育種的發(fā)展。但如何利用表型分析獲得的相關(guān)參數(shù)，以及如何將表型數(shù)據(jù)與產(chǎn)量和品質(zhì)更好地進(jìn)行相關(guān)性分析，還需要進(jìn)一步的研究。后期的工作將對(duì)紫葉紫菜薹的產(chǎn)量和品質(zhì)與其投影面積、葉面積等高通量的表型數(shù)據(jù)的相關(guān)性進(jìn)行進(jìn)一步的分析和研究。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）