外源GABA對(duì)鹽脅迫下金花菜種子萌發(fā)及幼苗抗氧化能力的影響

趙嫚 陳仕勇 李亞萍 周青平 陳有軍 常馨丹

摘要：?以楚雄金花菜種子為研究材料，通過(guò)測(cè)定種子萌發(fā)特性、胚芽鮮質(zhì)量、胚芽干質(zhì)量、胚根鮮質(zhì)量、胚根干質(zhì)量、胚根長(zhǎng)、超氧陰離子（O2·-）含量、過(guò)氧化氫（H2O2）含量、丙二醛（MDA）含量以及抗氧化酶活性，研究外源GABA（γ-氨基丁酸）對(duì)鹽脅迫下金花菜種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，0.5～2.0 μmol/L GABA預(yù)處理提高了鹽脅迫下金花菜種子的發(fā)芽勢(shì)、活力指數(shù)，并顯著縮短了平均萌發(fā)時(shí)間。100 mmol/L鹽脅迫對(duì)幼苗胚芽鮮質(zhì)量無(wú)影響，但顯著降低了胚芽干質(zhì)量、胚根干質(zhì)量、胚根鮮質(zhì)量及胚根長(zhǎng)，而0.5～2.0 μmol/L GABA預(yù)處理誘導(dǎo)了胚芽和胚根鮮質(zhì)量、干質(zhì)量及胚根長(zhǎng)的增加。GABA預(yù)處理不同程度地提高了鹽脅迫下金花菜幼苗超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶 （POD）、過(guò)氧化氫酶 （CAT）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶 （APX）活性，降低了O2·-、H2O2以及MDA含量。GABA能夠激活抗氧化酶活性，降低鹽脅迫誘導(dǎo)的氧化傷害和膜損傷，改善了金花菜在種子萌發(fā)階段的抗鹽性，且在0.5～2.0 μmol/L濃度范圍內(nèi)均有效果。

關(guān)鍵詞：?金花菜;鹽脅迫;種子萌發(fā);GABA;抗氧化保護(hù)

中圖分類(lèi)號(hào)：?S54??文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A??文章編號(hào)：?1000-4440（2021）02-0310-07

Abstract：?Using the seed of Medicago polymorpha cv. Chuxiong as material， the effect of exogenous γ-aminobutyric acid （GABA） on seed germination and seedling growth under salt stress were determined by analyzing seed germination characteristics， fresh and dry weight of embryos and radicles， radicle length， superoxide anion （O2·-） content， hydrogen peroxide （H2O2） content， malonaldehyde （MDA） content and antioxidant enzyme activities. The results showed that the seed germination potential and vigor indexes of M. polymorpha cv. Chuxiong under salt stress were enhanced after pretreated with 0.5-2.0 μmol/L GABA， and the mean germination time was shortened. Salt stress with 100 mmol/L NaCl showed no effect on the fresh weight of embryos， but the dry weight of embryos and radicles， the fresh weight of radicles and radicle length were significantly reduced， while the pretreatment with 0.5-2.0 μmol/LGABA increased the fresh and dry weight of radicles and radical length. Pretreatment of GABA for M. polymorpha cv. Chuxiong seedlings under salt stress improved the activities of superoxide dismutase （SOD）， peroxidase （POD）， catalase （CAT） and ascorbate peroxidase （APX）， decreased the contents of O2·-， H2O2 and MDA in varying degrees. The results suggest that GABA can activate the activities of antioxidant enzymes， reduce the oxidation damage and membrane injury induced by salt stress， leading to the improved salt tolerance of M. polymorpha cv. Chuxiong in seed germination stage， and the effective concentration scope of GABA is 0.5-2.0 μmol/L.

Key words：?Medicago polymorpha L.;salt stress;seed germination;γ-aminobutyric acid （GABA）;antioxidant protection

金花菜（Medicago polymorpha L.），又名南苜蓿、秧草、草頭等，是一種優(yōu)質(zhì)的苜蓿屬牧草，其具有蛋白質(zhì)含量高，粗纖維含量低，品質(zhì)優(yōu)良，營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，同時(shí)也是一種食用蔬菜，含有豐富的鷹嘴豆芽素A、植物皂素、蛋白質(zhì)、鈣和磷等，被認(rèn)為是最富營(yíng)養(yǎng)的野菜，此外金花菜還具有綠肥的功能[1-2]。金花菜主要分布于中國(guó)長(zhǎng)江流域以南等沿海各?。ㄊ?、區(qū)），特別在江蘇、浙江、上海一帶分布較多。但沿海地區(qū)土壤鹽漬化相對(duì)嚴(yán)重，鹽脅迫也成為影響植物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。土壤中鹽分的積累，降低了植物可利用的水的含量，并阻礙其對(duì)養(yǎng)分的吸收。因此，鹽脅迫使植物遭受光合抑制，擾亂代謝平衡，損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，最終抑制植物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量[3]。而如何提高植物的耐鹽性對(duì)于金花菜等植物的種植具有重要意義。

目前植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑被廣泛應(yīng)用于改善植物對(duì)逆境的抗性研究中。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）普遍存在于有機(jī)生物體中，是一類(lèi)非蛋白氨基酸，研究發(fā)現(xiàn)，在干旱、鹽、熱等逆境脅迫下GABA大量積累[4]，但是其積累是因?yàn)橹参锏拿{迫保護(hù)作用。GABA是一種信號(hào)分子，并與植物激素相互協(xié)調(diào)發(fā)揮作用，且在逆境脅迫下，GABA能夠發(fā)揮滲透調(diào)節(jié)、抗氧化保護(hù)以及清除活性氧的功能[5]。在逆境脅迫下，高效的抗氧化系統(tǒng)對(duì)豆科草類(lèi)植物至關(guān)重要，研究發(fā)現(xiàn)抗氧化酶系統(tǒng)在豆科苜蓿屬植物抵御鹽脅迫中發(fā)揮了重要作用[6]。種子萌發(fā)是植物生命階段對(duì)鹽等逆境脅迫最為敏感的階段，近年來(lái)通過(guò)添加外源物質(zhì)緩解植物鹽脅迫已經(jīng)成為一個(gè)重要的研究方向，而GABA作為一種生理活性物質(zhì)，能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，在多種逆境脅迫中具有積極的調(diào)節(jié)作用。因此，本試驗(yàn)研究GABA對(duì)鹽脅迫下金花菜種子萌發(fā)的影響，并探究GABA增強(qiáng)金花菜抗鹽害能力的生理機(jī)制，為鹽脅迫下GABA在金花菜種子萌發(fā)及早期幼苗生長(zhǎng)應(yīng)用中提供理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?供試材料

本研究中供試金花菜選用的是國(guó)審牧草品種楚雄金花菜（Medicago polymorpha cv. Chuxiong），種子由四川省草原科學(xué)院提供。

1.2?試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1?材料培養(yǎng)和處理?挑選出的金花菜種子經(jīng)1%的NaClO消毒8 min，蒸餾水洗凈后待用。取上述種子分別于GABA溶液（濃度為0 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、1.5 μmol/L、2.0 μmol/L）浸泡2 h，該過(guò)程在避光條件下進(jìn)行。本試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)處理，分別是： 1）對(duì)照（CK），將在0 μmol/L GABA溶液中浸種過(guò)的種子接種于蒸餾水浸濕的濾紙;2）鹽脅迫對(duì)照（N），將在0 μmol/L GABA溶液中浸種過(guò)的種子接種于100 mmol/L NaCl溶液浸濕的濾紙（根據(jù)前期鹽脅迫試驗(yàn)篩選出適宜NaCl濃度為100 mmol/L [7]）;3）鹽脅迫+0.5 μmol/L GABA處理（0.5 μmol/L GABA+100 mmol/L NaCl，GN1），將在0.5 μmol/L GABA溶液中浸種過(guò)的種子接種于100 mmol/L NaCl溶液浸濕的濾紙;4）鹽脅迫+1.0 μmol/L GABA處理（1.0 μmol/L GABA+100 mmol/L NaCl， GN2），將在1.0 μmol/L GABA溶液中浸種過(guò)的種子接種于100 mmol/L NaCl溶液浸濕的濾紙;5）鹽脅迫+1.5 μmol/L GABA處理（1.5 μmol/L GABA + 100 mmol/L NaCl， GN3），將在1.5 μmol/L GABA溶液中浸種過(guò)的種子接種于100 mmol/L NaCl溶液浸濕的濾紙;6）鹽脅迫+2.0 μmol/L GABA處理（2.0 μmol/L GABA+100 mmol/L NaCl， GN4），將在2.0 μmol/L GABA溶液中浸種過(guò)的種子接種于100 mmol/L NaCl溶液浸濕的濾紙。每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)的培養(yǎng)皿放置50粒種子，每隔2 d更換1次濾紙。將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為白天23 ℃/16 h，夜間18 ℃/8 h;每天記錄發(fā)芽數(shù)，連續(xù)培養(yǎng)觀察14 d。

1.2.2?測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.2.1?種子萌發(fā)特性的測(cè)定?發(fā)芽率（GR）=14 d內(nèi)種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%;

發(fā)芽勢(shì)（GE）=4 d內(nèi)種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%;

發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑Gt/t （Gt：第t d種子發(fā)芽數(shù);t：相應(yīng)發(fā)芽天數(shù)）[8];

平均萌發(fā)時(shí)間（MGT）=∑Gt×t/∑Gt （Gt：第t d種子發(fā)芽數(shù);t：相應(yīng)發(fā)芽天數(shù)）[9];

活力指數(shù)（VI）= GI×FW（GI：發(fā)芽指數(shù)，F(xiàn)W：幼苗的平均鮮質(zhì)量）;

每個(gè)重復(fù)隨機(jī)挑選5株進(jìn)行胚根長(zhǎng)以及胚芽和胚根鮮質(zhì)量、干質(zhì)量的測(cè)定。

1.2.2.2?幼苗抗逆生理指標(biāo)的測(cè)定?采用Velikova等[10]的方法測(cè)定樣品過(guò)氧化氫（H2O2）含量，采用Elstner等[11]的方法測(cè)定超氧陰離子（O2·-）濃度，采用愈創(chuàng)木酚顯色法[12]測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性，采用核黃素-NBT法[13]測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用紫外吸收法[12]測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）活性，采用Nakano等[14]的方法測(cè)定抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛（MDA）含量[15]。

1.3?數(shù)據(jù)分析

本研究采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和繪圖，采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行方差分析，采用新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2?結(jié)果與分析

2.1?外源GABA對(duì)鹽脅迫下金花菜種子萌發(fā)特性的影響

由圖1可知，100 mmol/L的NaCl影響了金花菜種子的萌發(fā)，外源GABA預(yù)處理顯著提高了金花菜種子的發(fā)芽勢(shì)、活力指數(shù)，縮短了平均萌發(fā)時(shí)間（P<0.05）。0.5～2.0 μmol/L GABA預(yù)處理的金花菜種子發(fā)芽勢(shì)比NaCl脅迫對(duì)照（N）分別提高了15.31%、18.01%、18.01%、22.97%（圖1A），活力指數(shù)分別提高了42.60%、40.43%、43.53%、34.23%（圖1D），平均萌發(fā)時(shí)間從2.34 d分別縮短到2.06 d、2.04 d、2.13 d、2.02 d（圖1E）。此外，在鹽脅迫下外源GABA雖然提高了金花菜種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，但與鹽脅迫對(duì)照差異不顯著（P>0.05）（圖1B，圖1C）。

2.2?外源GABA對(duì)鹽脅迫下金花菜幼苗生長(zhǎng)的影響

由圖2可知，與對(duì)照（CK）相比，鹽脅迫處理（N）顯著降低了金花菜幼苗胚芽干質(zhì)量、胚根鮮質(zhì)量、胚根干質(zhì)量以及胚根長(zhǎng)度（P<0.05），但對(duì)胚芽鮮質(zhì)量無(wú)顯著影響（P>0.05）。鹽脅迫下，經(jīng)0.5～2.0 μmol/L GABA預(yù)處理的金花菜幼苗胚芽鮮質(zhì)量分別比CK顯著增高13.61%、20.34%、20.69%、15.75%， 0.5～1.5 μmol/L GABA預(yù)處理同樣顯著增加了胚根鮮質(zhì)量。與鹽脅迫對(duì)照相比，GABA預(yù)處理顯著增加了鹽脅迫下金花菜幼苗胚芽干質(zhì)量、胚根干質(zhì)量以及胚根長(zhǎng)度，其中經(jīng)0.5～2.0 μmol/L GABA處理的金花菜幼苗胚芽干質(zhì)量、胚根干質(zhì)量、以及胚根長(zhǎng)度恢復(fù)到正常水平，與CK相比無(wú)顯著差異（P>0.05）。

2.3?外源GABA對(duì)金花菜幼苗活性氧產(chǎn)生和膜損傷的影響

如圖3所示，鹽脅迫誘導(dǎo)金花菜幼苗O2·-、H2O2、MDA含量顯著增加，但是外源GABA有效緩解了鹽脅迫下三者的積累。與CK相比，鹽脅迫使金花菜幼苗超氧陰離子含量增加了51.34%，不同濃度的GABA預(yù)處理緩解了鹽脅迫誘導(dǎo)的O2·-的積累，且各GABA處理濃度之間無(wú)顯著差異，與鹽脅迫對(duì)照相比，僅1.0 μmol/L GABA處理顯著降低了O2·-含量（P<0.05）。同時(shí)，與鹽脅迫對(duì)照相比，0.5～2.0 μmol/L GABA處理顯著降低了H2O2和MDA含量，且其H2O2含量恢復(fù)到正常水平;除了0.5 μmol/L GABA處理外，其他GABA處理的MDA含量亦恢復(fù)到正常水平（圖3B，圖3C）。

2.4?外源GABA對(duì)金花菜幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖4可知，鹽脅迫下，外源GABA對(duì)金花菜幼苗抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX活性有顯著的促進(jìn)作用。與CK相比，鹽脅迫和鹽脅迫下不同濃度的GABA預(yù)處理顯著增加了幼苗SOD和POD活性，但在0.5～2.0 μmol/L GABA濃度范圍內(nèi)，SOD和POD活性不隨GABA濃度的變化而變化。同樣的，鹽脅迫誘導(dǎo)金花菜幼苗CAT、APX活性增加，而鹽脅迫下GABA預(yù)處理進(jìn)一步誘導(dǎo)2個(gè)酶活性增加，分別比鹽脅迫對(duì)照增加140.75%、59.79%、84.08%、89.34%和22.23%、13.48%、47.86%、38.41%，且0.5 μmol/L GABA預(yù)處理的金花菜幼苗CAT活性顯著高于其他濃度GABA預(yù)處理（P<0.05）。

3?討論

種子萌發(fā)是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，容易受到干旱和鹽等非生物脅迫的影響[16]，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)種子萌發(fā)過(guò)程同樣受植物激素和生理活性物質(zhì)的調(diào)控。GABA是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，由谷氨酸脫羧酶催化合成和多胺降解而來(lái)，易溶于水，其生化特性和脯氨酸、甜菜堿類(lèi)似，是一種促進(jìn)細(xì)胞正常生長(zhǎng)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及抵御環(huán)境脅迫中發(fā)揮作用[17]。本試驗(yàn)探究了外源GABA對(duì)鹽脅迫下金花菜種子萌發(fā)的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)0.5～2.0?μmol/L GABA能夠有效緩解鹽脅迫對(duì)金花菜種子萌發(fā)的抑制作用，主要表現(xiàn)在顯著提高了發(fā)芽勢(shì)、活力指數(shù)以及縮短了平均萌發(fā)時(shí)間，同時(shí)顯著增加了幼苗胚芽和胚根的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量以及胚根長(zhǎng)。張志清等[18]研究發(fā)現(xiàn)，小麥（Triticum aestivum L.）在萌發(fā)的0～8 h內(nèi)，內(nèi)源GABA含量逐步增加，羅黃穎等[19]研究發(fā)現(xiàn)，10 mmol/L的GABA同樣促進(jìn)了鹽脅迫下設(shè)施番茄（Lycopersicon esculentum Mill）種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。以上研究結(jié)果說(shuō)明種子萌發(fā)需要GABA一定程度的積累，可能是由于其能夠促進(jìn)乙烯的合成，而研究發(fā)現(xiàn)乙烯能夠消減鹽脅迫對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用[20]，且不同植物所需的最適GABA濃度有差異。

鹽脅迫誘導(dǎo)ROS累積，對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷以及相關(guān)脂質(zhì)過(guò)氧化，最終引起MDA含量增加，研究發(fā)現(xiàn)MDA的累積量可以反映植物受氧脅迫的程度[21]。如鹽脅迫誘導(dǎo)O2·-、H2O2以及MDA含量在黑麥草中顯著增加，而外源硅在緩解鹽脅迫的同時(shí)降低了三者的含量[22]。本研究結(jié)果表明，鹽脅迫誘導(dǎo)O2·-、H2O2、MDA含量顯著增加，但0.5～2.0 μmol/L GABA預(yù)處理降低了三者的含量，其中1.0 μmol/L GABA緩解O2·-積累的效果最好，各GABA濃度對(duì)H2O2的緩解效果無(wú)差異，而0.5 μmol/L GABA對(duì)MDA的緩解效果最差。由此說(shuō)明，GABA同樣能夠緩解鹽脅迫引發(fā)的氧化脅迫對(duì)金花菜幼苗的傷害。

為維持活性氧代謝平衡，植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中已經(jīng)形成一套完整的酶類(lèi)和非酶類(lèi)抗氧化系統(tǒng)，其中ROS清除酶包括：超氧化物酶歧化酶（SOD）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）、過(guò)氧化氫酶（CAT）以及過(guò)氧化物酶（POD），這些抗氧化酶位于植物細(xì)胞的不同部位，但同時(shí)發(fā)揮清除活性氧的作用。研究發(fā)現(xiàn)，酶活性越高，植物受到逆境脅迫的傷害就越小[23-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下金花菜幼苗SOD、POD、CAT、APX活性升高，但在鹽脅迫下0.5～2.0 μmol/L GABA預(yù)處理進(jìn)一步誘導(dǎo)了抗氧化酶活性增加。Wang等[27]研究發(fā)現(xiàn)，GABA同樣提高了鹽脅迫下玉米抗氧化酶活性，也有研究發(fā)現(xiàn)在逆境脅迫下超表達(dá)乙烯誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子JERF3能提高抗氧化酶活性[28]，而外源GABA能夠增加乙烯的合成，因此GABA可能通過(guò)影響植物激素含量及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，提高抗氧化酶活性，緩解逆境對(duì)植物的傷害。

4?結(jié)論

鹽脅迫降低了金花菜種子的發(fā)芽率和活力，并延長(zhǎng)了平均萌發(fā)時(shí)間，抑制了幼苗地上部分和地下部分的生長(zhǎng)。外源施用0.5～2.0 μmol/L GABA緩解了鹽脅迫對(duì)金花菜種子萌發(fā)的不利影響，通過(guò)提高SOD、POD、CAT以及APX活性，清除鹽脅迫誘導(dǎo)的ROS積累，降低了細(xì)胞膜過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的累積，最終提高種子發(fā)芽率、種子活力及幼苗胚根、胚芽質(zhì)量。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）