轉(zhuǎn)錄組測序分析毒死蜱與醚菊酯混配對二化螟毒殺的增效機制

徐鹿 羅光華 金瑜劍 徐德進 徐廣春 顧中言

摘要：?為明確毒死蜱與醚菊酯混配對二化螟毒殺的增效機制，采用聯(lián)合毒力指數(shù)法篩選毒死蜱與醚菊酯混配的增效比例，利用轉(zhuǎn)錄組測序分析毒死蜱與醚菊酯混配的增效機制。結(jié)果表明，毒死蜱與醚菊酯以1∶2（質(zhì)量比）混配時表現(xiàn)出增效作用，Illumina HiSeqTM X Ten測序獲得高質(zhì)量的二化螟轉(zhuǎn)錄組。去離子水處理與毒死蜱處理、去離子水處理與醚菊酯處理、去離子水處理與增效混配劑處理、毒死蜱處理與增效混配劑處理、醚菊酯處理與增效混配劑處理的差異表達基因分別為465、392、1 874、117、25個。對毒死蜱與醚菊酯混配增效主要涉及的代謝過程進行通路分析，結(jié)合維恩交集法進行分析，發(fā)現(xiàn)解毒代謝酶可能介導毒死蜱與醚菊酯混配的增效機制。實時熒光定量PCR結(jié)果證實差異基因的表達量與測序數(shù)據(jù)匹配。本研究結(jié)果可為解析殺蟲劑混配增效機制提供分子基礎，為優(yōu)化殺蟲劑混配比例，建立二化螟抗性治理策略提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：?二化螟;毒死蜱;醚菊酯;轉(zhuǎn)錄組測序;增效

中圖分類號：?S482.3;S481??文獻標識碼：?A??文章編號：?1000-4440（2021）02-0317-09

Abstract：?To reveal the synergistic mechanism of chlorpyrifos and ethofenprox mixture in poisoning Chilo suppressalis， the synergistic ratios of chlorpyrifos and ethofenprox mixture were screened by combined toxicity index method， the synergistic mechanism of chlorpyrifos and ethofenprox mixture were analyzed by transcriptome sequencing. The results indicated that chlorpyrifos and ethofenprox mixed at a 1∶2 mass ratio showed significant synergism on C. suppressalis. HiSeqTM X Ten platform was used to obtain C. suppressalis transcriptome with high quality data. 465， 392， 1 874， 117 and 25 differentially expressed genes were obtained between the groups of deionized water and chlorpyrifos， deionized water and ethofenprox， deionized water and synergistic mixture， chlorpyrifos and synergistic mixture， ethofenprox and synergistic mixture. Pathway analysis showed that synergistic effect of chlorpyrifos and ethofenprox mixture was mainly involved in the metabolic process， and it was speculated that detoxification metabolic enzymes might mediate synergism mechanism of chlorpyrifos and ethofenprox combined with Venn intersection algorithm. The expression of significant different genes was highly matched with transcriptome sequencing data by quantitative real-time polymerase chain reaction （PCR）. The results can provide a molecular basis for analyzing synergism mechanism of insecticide mixtures， and provide a theoretical basis for optimizing ratio of insecticide mixtures and establishing resistance control strategy of C. suppressalis.

Key words：?Chilo suppressalis;chlorpyrifos;ethofenprox;transcriptome sequencing;synergism

殺蟲劑混配是殺蟲劑應用的普遍技術(shù)，是治理害蟲抗藥性的重要策略[1]。害蟲的抗藥性會致使殺蟲劑使用效率下降，導致可使用的殺蟲劑數(shù)量減少。新型殺蟲劑的研發(fā)速度不及害蟲抗藥性的發(fā)展速度。殺蟲劑混配通過優(yōu)化殺蟲劑組合延緩害蟲抗藥性的發(fā)展[2]。殺蟲劑混配存在增效、相加和拮抗3種作用，僅增效配比的殺蟲劑可合理應用[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，氯菊酯與毒死蜱增效混配殺蟲劑可顯著增加對抗性褐飛虱的毒力，提高田間的防治效果[4]。施用化學農(nóng)藥是治理害蟲的主要措施，殺蟲劑增效混配是治理害蟲抗藥性，延長殺蟲劑使用壽命的重要手段，研究殺蟲劑混配的增效機制是其應用的基礎。殺蟲劑混配增效作用是在害蟲體內(nèi)通過一種藥劑影響另一種藥劑或是2種藥劑相互影響，從而提高混配殺蟲劑的毒力[5]。有研究指出，殺蟲劑混配產(chǎn)生增效是因為混配單劑之間相互影響，引起害蟲體內(nèi)部分生理生化變化，包括表皮穿透性的提高，害蟲體內(nèi)解毒代謝酶的抑制以及靶標部位作用能力增強3個方面[6]，但目前對殺蟲劑混配增效機制的認識仍然不足。轉(zhuǎn)錄組測序可用于研究害蟲體內(nèi)相關(guān)基因表達和調(diào)控路徑，為解析殺蟲劑混配增效機制提供新方法[7]。

二化螟[Chilo suppressalis（Walker）]是一種危害水稻生產(chǎn)的多食性害蟲，主要分布于亞洲、中東和南歐，在中國長江流域及以南稻區(qū)危害嚴重。由于雜交稻的推廣和耕作制度的改革，二化螟的發(fā)生量逐年增加，幼蟲鉆蛀取食水稻莖葉，造成嚴重減產(chǎn)[8]。據(jù)統(tǒng)計，中國二化螟年發(fā)生面積約為1.4×107 hm2，年經(jīng)濟損失約達1.15×1010元[9]。二化螟防治主要依靠化學農(nóng)藥，但二化螟對大多數(shù)常規(guī)殺蟲劑已經(jīng)產(chǎn)生了抗性[10]。毒死蜱在中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部取得登記，成為防治水稻害蟲二化螟的常規(guī)藥劑，但二化螟對毒死蜱已產(chǎn)生高水平抗性。醚菊酯是唯一投入到水稻田中使用的擬除蟲菊酯類殺蟲劑，二化螟對其處于敏感階段[11]。毒死蜱作用于乙酰膽堿酯酶，而醚菊酯以鈉離子通道為靶點，2種殺蟲劑的作用方式不同，二化螟產(chǎn)生抗藥性的機制不同，毒死蜱和醚菊酯可以混配使用。本研究擬篩選毒死蜱與醚菊酯混配的增效比例，通過轉(zhuǎn)錄組測序鑒定毒死蜱與醚菊酯混配的增效基因，解析混配殺蟲劑的增效機制，以期為二化螟的治理以及農(nóng)藥減施增效提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?供試蟲源

本研究的供試蟲源為2013年采自安徽省蕪湖市水稻田的二化螟，在不接觸任何殺蟲劑的條件下，在室內(nèi)以南粳46水稻連續(xù)飼養(yǎng)。飼養(yǎng)方法為無土水稻育苗法[10]。飼養(yǎng)條件為：溫度（28±1） ℃，光周期16 L∶8 D，相對濕度>80%。

1.2?殺蟲劑毒力測定

采用人工飼料藥膜法[12]測定殺蟲劑毒力。將97%毒死蜱（CPF）和95%醚菊酯（PEPE）原藥用丙酮溶解于50 ml離心管中作為母液，用去離子水從中稀釋出5～6個系列濃度，用來處理3齡二化螟幼蟲，以去離子水處理為對照。采用Wang等[12]的方法制備人工飼料，在每孔飼料表面加入100 μl藥液，置于室溫下晾干。每孔接入1頭3齡幼蟲，每個濃度處理48頭，重復3次，接蟲后用黑色棉布覆蓋，再蓋上培養(yǎng)皿蓋，并用橡皮筋扎緊，飼養(yǎng)72 h后檢查死亡情況，統(tǒng)計死亡數(shù)并計算致死中濃度（LC50）。

1.3?殺蟲劑聯(lián)合作用測定

采用聯(lián)合毒力指數(shù)（CI）法評估毒死蜱與醚菊酯混配的增效、拮抗、相加作用[13]，通過毒死蜱和醚菊酯的LC50設置混配比例，CI的計算公式為：

LC1mx和LC2mx分別指當死亡率為x時殺蟲劑1和殺蟲劑2混用的致死劑量;LC1x和LC2x分別指死亡率為x時殺蟲劑1和殺蟲劑2單獨使用的致死劑量;CIx是當死亡率為x時的聯(lián)合毒力指數(shù)。當殺蟲劑混合使用表現(xiàn)為相加作用時，CI=1;當殺蟲劑混合使用表現(xiàn)為增效作用時，CI<1;殺蟲劑混合使用表現(xiàn)為拮抗作用時，CI>1。死亡率為50%的情況下，計算混配殺蟲劑的毒力及其聯(lián)合作用的CI值。混配殺蟲劑的毒力用混合使用時和單獨使用時的死亡率差值計算，其增效作用的毒力計算公式為：M（1+2）=100%-（M1+M2）。M1和M2：分別指殺蟲劑1和殺蟲劑2單獨使用時的死亡率;M（1+2）：指殺蟲劑1和殺蟲劑2混配使用時的死亡率。

1.4?轉(zhuǎn)錄組測序

使用毒死蜱、醚菊酯以及毒死蜱與醚菊酯混配劑處理30～40頭二化螟3齡幼蟲6 h，每個處理重復3次，去離子水處理作為對照，處理后樣品放入液氮中冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩２捎肨rizol試劑盒提取二化螟總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白定量儀檢測提取的總RNA的完整度、純度和濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩悠穋DNA文庫的構(gòu)建和測序由上海祥音生物科技有限公司操作，測序在Illumina HiSeqTM X Ten儀器上完成，重復3次。將測序的原始數(shù)據(jù)去除adaptor序列和低質(zhì)量的讀長得到過濾數(shù)據(jù)，用HISAT v2.0.4軟件比對二化螟基因組進行分析，使用TopHat v2.0.11軟件比對參考基因組。用Bowtie2 v2.2.6軟件分析每百萬基因片段中來自某一基因每千堿基長度的片段數(shù)目，評估基因表達豐度（FPKM），利用DEGSeq軟件分析2個樣本之間的差異表達基因，采用維恩作圖軟件v1.6.17分析多個樣本之間的共表達差異基因。

1.5?實時熒光定量PCR驗證

用SV Total RNA Isolation System Kit試劑盒提取二化螟幼蟲總RNA，按方法1.4的方法對總RNA的完整度、純度和濃度進行檢測并保存。cDNA第一鏈的合成采用PrimeScriptTM RT Reagent Kit試劑盒，按說明書操作。采用熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)在ABI Prism 7300定量PCR儀上驗證鑒定的毒死蜱與醚菊酯混配增效基因表達量變化?；炫湓鲂Щ蚝蛢?nèi)參基因（Actin A1和G3PDH）引物使用Beacon Designer 7.0軟件進行設計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，根據(jù)SYBR Green Premix Ex Taq的試劑盒說明書進行擴增。采用PCR儀自帶軟件進行數(shù)據(jù)分析，設3個生物學重復。采用2-△△Ct法計算目標基因的相對表達量。

1.6?數(shù)據(jù)處理

用Abbott公式校正各處理死亡率。利用POLO Plus邏輯幾率值軟件中的幾率值分析評估死亡率為50%的藥劑劑量、置信區(qū)間以及幾率死亡率與劑量對數(shù)的斜率。采用單因素方差分析中的Tukey顯著性差異檢測進行多組比較。所有統(tǒng)計分析均采用SPSS13.0軟件進行。

2?結(jié)果與分析

2.1?毒死蜱與醚菊酯混配對二化螟毒殺的增效、拮抗作用

毒死蜱、醚菊酯對二化螟3齡幼蟲的LC50分別為254.34 mg/L和352.26 mg/L（表1）。毒死蜱與醚菊酯以1∶2（質(zhì)量比）混配，致死中濃度為115.54 mg/L，聯(lián)合毒力指數(shù)為0.42（表2），表現(xiàn)出增效作用。

2.2?二化螟轉(zhuǎn)錄組特征分析

通過Illumina HiSeqTM X Ten平臺對毒死蜱、醚菊酯、毒死蜱與醚菊酯增效混配劑、去離子水處理構(gòu)建的12個cDNA文庫（T01～T12）進行測序，4個處理分別產(chǎn)生48.205 6 M、44.179 1 M、45.864 2 M和51.061 5 M的平均過濾讀長，產(chǎn)生7.230 9 G、6.626 9 G、6.879 6 G和7.659 2 G的平均過濾堿基，測序質(zhì)量控制后顯示Phred數(shù)值大于20和30的堿基占比分別在97.00%和90.00%以上。所有cDNA文庫的鳥嘌呤與胞嘧啶含量百分比為44.92%～47.95%，獲得了高質(zhì)量的二化螟轉(zhuǎn)錄組（表3）。二化螟轉(zhuǎn)錄組的原始數(shù)據(jù)提交到NCBI，獲取短讀存檔登錄號（S￣R￣R￣1￣1￣4￣9￣6￣7￣2￣0￣、S￣R￣R￣1￣1￣5￣0￣8￣5￣1￣9￣、S￣R￣R￣1￣1￣6￣1￣2￣5￣6￣4￣、S￣R￣R￣1￣1￣6￣1￣3￣3￣9￣9￣、￣S￣R￣R￣1￣1￣6￣1￣2￣5￣9￣8￣、￣SRR11612564、SRR11612730、SRR1161283￣5￣、￣S￣R￣R￣1￣1￣6￣1￣2￣9￣3￣8￣、S￣R￣R￣1￣1￣6￣1￣3￣3￣5￣9￣、S￣R￣R￣1￣1￣6￣1￣3￣3￣6￣0和S￣R￣R￣1￣1￣6￣1￣3￣3￣9￣6￣）。

2.3?毒死蜱與醚菊酯混配增效處理的差異基因表達量及通路分析

基于FPKM分析毒死蜱、醚菊酯、毒死蜱與醚菊酯增效混配劑、去離子水處理下樣品的相關(guān)性，各處理下樣品間基因表達的皮爾遜相關(guān)系數(shù)分別為0.82、0.91、0.94和0.98（圖1），表明獲得的測序數(shù)據(jù)可靠。去離子水處理與毒死蜱處理、去離子水處理與醚菊酯處理、去離子水處理與增效混配劑處理、毒死蜱處理與增效混配劑處理、醚菊酯處理與增效混配劑處理的差異表達基因（DEG）（圖2A）分別為465、392、1 874、117、25個，其表達量比值分別為-3.91～4.38、-4.11～6.25、-5.66～10.95、-2.65～3.24和-2.01～2.48，樣品間基因表達模式存在顯著差異（圖2B）。采用京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析DEG的功能，去離子水處理與毒死蜱處理之間的465個DEG主要富集代謝中的全局代謝總括（41個）、脂質(zhì)代謝（28個）、外源物降解代謝（23個）以及富集環(huán)境信息處理的信號轉(zhuǎn)導（27個）（圖3A）;去離子水處理與醚菊酯處理之間的392個DEG主要富集代謝中的全局代謝總括（61個）、脂質(zhì)代謝（33個）、外源物降解代謝（24個）以及富集環(huán)境信息處理的信號轉(zhuǎn)導（20個）（圖3B）;去離子水處理與增效混配劑處理之間的1 874個DEG主要富集代謝中的全局代謝總括（232個）、核苷酸代謝（127個）、碳水化合物代謝（90個）、氨基酸代謝（84個）、脂質(zhì)代謝（82個）、外源物降解代謝（59個），富集環(huán)境信息處理的信號轉(zhuǎn)導（140個）、信號分子與相互作用（78個）、膜傳輸（65個），富集遺傳信息處理的轉(zhuǎn)錄（70個）、翻譯（54個）以及折疊、分類和降解（52個），富集細胞過程的細胞群落（58個）以及細胞生長和死亡（73個）（圖3C）;毒死蜱處理與增效混配劑處理之間的117個DEG主要富集代謝中的全局代謝總括（13個）、核苷酸代謝（6個）、碳水化合物代謝（6個）、氨基酸代謝（7個）、脂質(zhì)代謝（8個）、外源物降解代謝（6個）以及富集環(huán)境信息處理的信號轉(zhuǎn)導（11個）（圖3D）;醚菊酯處理與增效混配劑處理之間的25個DEG主要富集代謝中的全局代謝總括（6個）、碳水化合物代謝（2個）、氨基酸代謝（2個）、脂質(zhì)代謝（2個）、外源物降解代謝（2個）以及富集環(huán)境信息處理的信號轉(zhuǎn)導（2個）（圖3E）。上述研究結(jié)果表明，毒死蜱與醚菊酯混配增效機制主要涉及代謝過程。結(jié)合維恩交集法篩選去離子水處理與增效混配劑處理、毒死蜱處理與增效混配劑處理、醚菊酯處理與增效混配劑處理三者的共表達差異基因，結(jié)果（圖4A）發(fā)現(xiàn)CYP341B2、同向轉(zhuǎn)運體和核酸酶基因HARBI1共表達，代謝通路中的解毒代謝酶可能介導毒死蜱與醚菊酯的增效機制。

采用qRT-PCR分析上調(diào)的CYP341B2、UGT340C2、CYP341A15、氣味結(jié)合蛋白70基因（OBP70）、多抗藥相關(guān)蛋白基因（MRP）、表皮蛋白22基因（CP22）、表皮蛋白27基因（CP27），以及下調(diào)的熱激蛋白90基因（Hsp90）、CYP6AB45、CYP6AE60的表達量，結(jié)果（圖4B）表明qRT-PCR基因表達量與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)相匹配。

3?討論

殺蟲劑輪用和混配是治理害蟲抗藥性的普遍策略，在單一殺蟲劑使用模式下，輪用殺蟲劑并不能殺死全部抗性害蟲，而在殺蟲劑混用模式下，理論上可以殺死全部抗性害蟲[14]。有研究結(jié)果表明，二化螟對敵百蟲、對硫磷、甲基對硫磷、硫磷、殺蟲單、殺蟲雙、氟蟲腈（已禁用）、阿維菌素和雙酰胺類殺蟲劑已經(jīng)產(chǎn)生了中等至高等水平的抗性[15-17]。二化螟幼蟲于水稻莖稈中渡過生命周期，這層天然屏障加大了防治難度，但施用化學農(nóng)藥仍是治理二化螟的重要手段。由于二化螟具有較強的抗藥性，可以考慮將無交互抗性的敏感藥劑與抗性藥劑混用。毒死蜱與醚菊酯以1∶2（質(zhì)量比）混配明顯增強對二化螟的毒力，混配劑的致死效果優(yōu)于單劑，可以延長化學農(nóng)藥的使用壽命。要想優(yōu)化毒死蜱與醚菊酯的混配比例，促進殺蟲劑持續(xù)使用，需解析毒死蜱與醚菊酯混配劑的增效機制。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序方法分析毒死蜱與醚菊酯的協(xié)同增效機制，轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)生44.179 1～51.061 5 M的平均過濾讀長和6.626 9～7.659 2 G的平均過濾堿基，高于報道的二化螟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[18]，檢測到的表達基因總數(shù)與二化螟基因組中注釋的基因總數(shù)接近[19]，獲得的Phred數(shù)值大于20和30的堿基數(shù)占比以及鳥嘌呤與胞嘧啶含量百分比數(shù)據(jù)，反映出高的測序質(zhì)量。皮爾遜相關(guān)系數(shù)是檢測試驗可靠性和樣本選擇的重要指標，二化螟生物學重復樣品間皮爾遜相關(guān)系數(shù)大于0.8，表明樣品間的表達模式相似度高，確保后續(xù)的差異基因分析。

DEG的KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，毒死蜱與醚菊酯增效混配差異表達基因主要分布于代謝、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理和細胞過程，主要參與碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、信號轉(zhuǎn)導、外源物降解代謝。碳水化合物代謝作為生物體內(nèi)重要的代謝途徑，為細胞中許多生理反應和過程提供能量和底物來源。毒死蜱與醚菊酯增效混配劑處理二化螟后碳水化合物代謝基因數(shù)量明顯增加，表明二化螟解毒毒死蜱與醚菊酯增效混配劑會消耗大量能量。氨基酸代謝通過氧化產(chǎn)生能量滿足機體需要，氨基酸參與殺蟲劑的代謝過程。二化螟暴露于毒死蜱與醚菊酯增效混配劑中，氨基酸代謝通路中多個基因顯著表達，表明毒死蜱與醚菊酯混配劑的T01～T12見表3。

協(xié)同增效過程需要氨基酸的合成和分解。當糖缺乏時，脂質(zhì)代謝可為生物體提供能量，是細胞內(nèi)重要的生理過程。脂質(zhì)代謝通路中的多個基因在二化螟暴露于毒死蜱與醚菊酯增效混配劑中后顯著表達，推測這些差異表達基因可能會改變脂質(zhì)代謝，從而影響二化螟的繁殖。信號轉(zhuǎn)導涉及生物體的各種生理過程[20-21]，二化螟暴露于毒死蜱與醚菊酯增效混配劑中后，差異表達基因數(shù)量高于其他通路，推斷二化螟接觸殺蟲劑后通過信號轉(zhuǎn)導通路傳遞殺蟲劑信號，進而啟動各種生理反應避免殺蟲劑致死效應。外源物降解代謝是昆蟲接觸殺蟲劑后產(chǎn)生的主要生理過程，解毒代謝酶和轉(zhuǎn)運體參與其中，解毒代謝過程是一個生化代謝途徑，將外源物分解成無毒的形式，本研究鑒定出解毒代謝差異共表達基因，表明解毒代謝酶可能介導毒死蜱與醚菊酯混配劑協(xié)同增效機制。本研究鑒定的代謝過程相關(guān)通路的差異表達基因在毒死蜱與醚菊酯混配劑對二化螟毒殺增效中起到關(guān)鍵作用，但其功能還需進一步研究，昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)和CRISPR/Cas9基因編輯可為其功能研究提供支持[22-23]。本研究結(jié)果表明，毒死蜱與醚菊酯在特定比例下混配對二化螟毒殺產(chǎn)生增效作用，通過轉(zhuǎn)錄組測序分析毒死蜱與醚菊酯對二化螟毒殺的增效機制，其結(jié)果為殺蟲劑混配劑配比的優(yōu)化以及二化螟抗性治理策略的建立提供理論依據(jù)。

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（責任編輯：王?妮）