熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）MF11對根結線蟲病的防效評價

周冬梅 何亮亮 李偉山 馮輝 趙敏 糾敏 魏利輝

摘要：?在根結線蟲危害嚴重的番茄田塊采集健康植株的根際，從中分離并篩選對根結線蟲病具有防治作用的生防菌株。采用稀釋分離法以及離體試驗獲得16株能顯著殺滅南方根結線蟲二齡線蟲（J2）的菌株，其中菌株MF11對J2的致死率最高?；谏砩治?、gyrB 和16S rRNA基因堿基序列比對，確定菌株MF11為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。菌株MF11發(fā)酵液浸泡番茄幼苗24 h后，J2在番茄根尖的聚集數量顯著減少，侵入番茄根尖的蟲量下降80.65%，表明菌株MF11可降低J2對番茄的侵染力。溫室試驗結果表明， 菌株MF11發(fā)酵液處理可以顯著降低番茄植株86.53%根結數，以及70.2%的卵塊數。田間試驗結果表明，菌株MF11發(fā)酵液處理降低了根結線蟲病的病情指數，其平均防效達66.71%，與10%噻唑膦顆粒劑處理防效相當。綜上所述，菌株MF11不僅對根結線蟲具有毒殺作用，還能降低根結線蟲的侵染、發(fā)育和繁殖能力，從而有效防治作物根結線蟲病。

關鍵詞：?南方根結線蟲;生防菌;熒光假單胞菌;防治效果

中圖分類號：?S432.4+5??文獻標識碼：?A??文章編號：?1000-4440（2021）02-0326-07

Abstract：?Rhizosphere of healthy tomato plants in fields severely infected by root-knot nematode was collected to isolate and screen biocontrol strains with antagonistic effects on diseases caused by Meloidogyne incognita.?16 bacterial strains with significant nematocidal activity on the second-stage larvae （J2） of M.?incognita were obtained by separation method of dilution and in vitro experiment.?Among them， MF11 strain showed the highest lethality rate to J2.?The MF11 strain was identified to be Pseudomonas fluorescens based on physiological， biochemical analysis and gene sequence alignment between gyrB and 16S rRNA.?The number of J2 aggregated around the root tips of tomatoes decreased significantly 24 h after the tomato seedlings immersed in the fermentation broth of MF11 strain.?The number of root-knot nematode invading the root tips of tomato reduced by 80.65%， indicating that MF11 strain could reduce the infecting effect of J2 to tomato.?Experimental results in the greenhouse showed that， tomato plants treated with MF11 strain fermentation broth could decrease the number of root-knots by 86.53% and reduce the egg mass in MF11-treated tomato roots by 70.52% significantly.?The results of field experiment showed that， the disease indexes of diseases caused by root-knot nematode in tomato plants treated with MF11 reduced compared with that of water control， with an average control efficacy of 66.71%， which was the same as the treatment by fosthiazate 10% granules.?In summary， MF11 strain not only has toxic action on root-knot nematode， but can also decrease the infection， growth and fertility abilities of root-knot nematode to control the diseases caused by root-knot nematode in crops effectively.

Key words：?Meloidogyne incognita;biocontrol bacteria;Pseudomonas fluorescens;control efficacy

根結線蟲（Meloidogyne spp.）是世界性分布的威脅農業(yè)生產的主要土傳病原物之一[1]。根結線蟲侵染后可導致植物組織發(fā)生變化，致使寄主更易受到青枯、枯萎、根腐等病原菌的侵染，造成復合病害，加重這些土傳性病害的發(fā)生嚴重度[2]。由于寄主廣泛，不同生態(tài)環(huán)境下根結線蟲的發(fā)生流行規(guī)律存在差異，從而導致作物根結線蟲病的防控十分困難[3-4]。在中國對農作物以及蔬菜危害嚴重且造成重大經濟損失的主要有南方根結線蟲（M. incognita）、花生根結線蟲（M. arenaria）、爪哇根結線蟲（M. javanica）、北方根結線蟲（M. hapla）以及象耳豆根結線蟲（M. enterolobii） [5]。其中由南方根結線蟲（M. incognita）引起的根結線蟲病害在國內普遍發(fā)生，主要危害番茄、辣椒和黃瓜等蔬菜作物[6-8]。

對于根結線蟲的防治，生產上以化學藥劑為主[9]。由于化學殺線劑對環(huán)境污染嚴重，同時在使用過程中對人畜也不安全，而且導致土壤質地退化、生物多樣性喪失等，因此，人們越來越多地從植物自身即抗性品種選育和生物防治的角度尋求新的防治方法[10-12]。

利用環(huán)境有益微生物來控制病害的發(fā)生以及誘導作物提高抗逆能力是近些年來研究的熱點，尤其這些微生物對環(huán)境無污染，能克服化學藥劑防治帶來的缺陷。Kloepper & Schroth 提出植物根際促生細菌（PGPR）假說，這類細菌可以增強植物對養(yǎng)分的吸收，促進植物生長發(fā)育，誘導植株產生系統性抗性以抵抗不良環(huán)境條件或病原物的侵染[13]。PGPR（如Pseudomonas spp.和Bacillus spp.）已被證實含有裂解根結線蟲細胞壁的酶類和具有引起植物抗性的能力，從而有效防治根結線蟲病害[14-16]。例如，熒光假單胞菌UTPF5的粗提物對爪哇根結線蟲二齡幼蟲的致死率可達到100%，且不同濃度的UTPF5抽提物都能對二齡幼蟲活性產生影響[17]。將水楊酸與熒光假單胞菌CHAO混合使用，可有效激起番茄體內PR1基因的表達，進而有效抵御爪哇根結線蟲的侵染[18]。Wei等從苦瓜根際中篩選到1株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） ，該菌株的上清液能殺死二齡幼蟲和抑制卵的孵化，溫室盆栽和田間試驗結果顯示該菌株能有效防治根結線蟲病害[19]。Choi等對2株芽胞桿菌B. thuringiensis KYC 和 B. velezensis CE的抗根結線蟲能力進行了測定，發(fā)現這2株芽胞桿菌能有效抑制卵的孵化能力以及對二齡幼蟲具有較強的致死作用;溫室試驗結果表明，這2株細菌能夠顯著降低根結數以及卵塊數，顯示出較高的抗線蟲能力[20]。

本研究以分離自南京市六合區(qū)番茄大棚未受根結線蟲侵染的健康植株根際中的一株具有拮抗作用的熒光假單胞菌MF11為研究靶標，通過對二齡幼蟲致死能力檢測以及對根結線蟲吸引能力測定初步分析MF11對根結線蟲病的生防機制，結合盆栽和田間試驗評估MF11作為一種生防資源用于根結線蟲病防治的應用前景。

1?材料與方法

1.1?生防菌的分離和鑒定

供試細菌分離自江蘇省南京市六合區(qū)竹鎮(zhèn)番茄大棚中未受根結線蟲侵染的番茄根際。利用平板稀釋法在R2A培養(yǎng)基上進行分離獲得供試菌株MF11，并根據《常見細菌系統鑒定手冊》對篩選細菌菌株進行生理生化性狀分析[21]。利用細菌基因組試劑盒（康為公司）提取MF11菌株基因組 DNA，用16Sr RNA通用引物 27F/1492R 和gyrB引物UP-1S從基因組DNA 中分別擴增16S rRNA和gyrB基因序列[22]。PCR產物測序結果在NCBI數據庫進行 BLAST 比對分析。采用MEGA 7 基于16S rRNA和gyrB基因堿基序列以Neibour-Joining 法構建系統發(fā)育樹，確定分類地位。

1.2?菌株MF11發(fā)酵液的制備

用接種環(huán)挑取細菌單菌落于LB培養(yǎng)液中，28 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，10 000 r/min離心15 min，收集上清液并通過0.22 μm濾器過濾菌體，獲得MF11發(fā)酵液。發(fā)酵液用無菌水梯度稀釋后備用。

1.3?根結線蟲二齡幼蟲的準備

供試根結線蟲種群最早分離自發(fā)病番茄根組織，并在室內進行單卵塊培養(yǎng)繁殖，經形態(tài)學和分子鑒定，確定為南方根結線蟲1號生理小種。番茄根組織剪碎后，加入10%次氯酸鈉劇烈振蕩并通過500 目篩收集蟲卵，并利用蔗糖密度法純化蟲卵;將收集的蟲卵轉移至線蟲孵化器，25 ℃避光孵育，1～2 d后收集根結線蟲二齡幼蟲（J2）。

1.4?發(fā)酵液對二齡幼蟲活性以及侵染能力的影響

在24孔細胞培養(yǎng)板中依次加入1 ml的發(fā)酵上清液和100頭J2，并將細胞培養(yǎng)板置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，分別在4 h、8 h、12 h、24 h后觀察線蟲活性，統計線蟲死亡頭數，以LB培養(yǎng)液和滅菌水處理作為對照，每個處理3次重復。

番茄種子（Moneymaker）用20% 次氯酸鈉滅菌15 min，滅菌水清洗4～5 次，于滅菌平板保濕黑暗培養(yǎng)4～5 d，待番茄根長約 1.5 cm 時使用。將細菌發(fā)酵液加入無菌培養(yǎng)皿中，然后將番茄幼苗根部浸入發(fā)酵液中，于搖床上80 r/min、28 ℃培養(yǎng)30 min。然后將番茄苗置于0.8%的水瓊脂培養(yǎng)基上，并在番茄根尖下方約2 mm處接種200頭J2懸浮液，25 ℃培養(yǎng)箱中放置12 h。番茄苗經染色、脫色處理后，統計進入番茄根尖的線蟲數量。每個處理20株苗，重復3次。

1.5?發(fā)酵液處理后番茄對線蟲的吸引能力測定

番茄生長條件同方法1.4，將番茄幼苗根部分別浸入不同濃度的生防菌發(fā)酵液和LB培養(yǎng)液中，于搖床上80 r/min、28 ℃培養(yǎng)30 min。將番茄苗取出后置于含有1 500頭 J2的Pluronic F-127凝膠的細胞培養(yǎng)皿中，每孔放2株苗，室溫放置[23]。在體視顯微鏡下分別于1 h、4 h、12 h、18 h、24 h、48 h觀察番茄根對南方根結線蟲的吸引情況，并統計侵入番茄根尖的線蟲數量。

1.6?溫室盆栽試驗

將表面消毒的番茄種子播種于滅菌土壤中，置于25 ℃、16 h光照/8 h黑暗條件下生長。14 d后移栽至含有滅菌基質中（沙∶營養(yǎng)基質=9∶1，質量比），移栽3 d后每株番茄苗灌根10 ml發(fā)酵液。生防菌發(fā)酵液處理7 d后，每株番茄苗接種500頭J2懸浮液，在J2接種后21 d統計根結數，56 d后統計卵塊數。每個處理24株苗，重復3次。

1.7?生防菌對根結線蟲病的田間防效測定

于2019年4月在江蘇省農業(yè)科學院六合示范基地根結線蟲常發(fā)大棚進行防效測定。田間試驗共設置3個處理：10%噻唑膦GR（拜耳）處理（30 kg/hm2）、清水對照、生防菌處理（每株100 ml生防菌發(fā)酵液）。每小區(qū)12 m2，每小區(qū)栽種60棵番茄苗。每處理3次重復，相鄰小區(qū)之間設保護行，隨機排列。40 d后，對所有小區(qū)番茄植株進行分級調查病情[24]：0級，根系無蟲癭，無發(fā)病;1級，根系有少量蟲癭;3級，2/3根系布滿蟲癭;5級，根系布滿小蟲癭并有次生蟲癭;7級，根系形成須根團。根據公式計算病情指數和相對防效[25]：病情指數=∑（各級病植株數×各級代表值）/（調查總植株數×最高級代表值）×100，防治效果=（對照病情指數-處理病情指數）/ 對照病情指數×100%。

2?結果與分析

2.1?菌株MF11對根結線蟲的致死作用

根據菌株發(fā)酵液在4 h、8 h、12 h、24 h時對南方根結線蟲二齡幼蟲的致死率，以12 h線蟲死亡率達到80%及以上為指標共篩選出16株具有拮抗線蟲效果較好的菌株，其中菌株rH15、rH13、rH26、MF11對線蟲致死率較高，達90%以上，MF11的致死率最高為94%（圖1）。后續(xù)試驗以MF11為研究對象，研究其生防機制以及防病效果。

2.2?菌株MF11的鑒定結果

菌株MF11在LB平板上活化培養(yǎng)后的淡黃色透明菌落表面光滑，邊緣整齊（圖2A）;革蘭氏染色結果為革蘭氏陰性菌。如表1所示，菌株MF11為需氧型細菌。氧化酶接觸酶試驗均呈陽性反應，明膠液化。在pH值為5或6的液體培養(yǎng)基中均可以正常生長。菌株還能夠在含1% NaCl、4% NaCl的培養(yǎng)液中正常生長，而在8% NaCl的培養(yǎng)液中卻無法生長。

經測序以及在NCBI數據庫中進行Blast比對，結果顯示，菌株MF11的16S rDNA部分堿基序列以及gyrB基因堿基序列與 Pseudomonas fluorescens堿基序列同源性高達99%。使用MEGA7.0軟件，結合16S rRNA、gyrB基因堿基序列，以Neighbor-joining法構建系統發(fā)育樹，發(fā)現MF11與熒光假單胞菌Pseudomonas fluroescens 位于系統發(fā)育樹同一支，聚為一類（圖2B）。結合生理生化鑒定結果，MF11為熒光假單胞菌（登錄號MW493146）。

2.3?菌株MF11對南方根結線蟲侵染的抑制作用

菌株MF11發(fā)酵液處理番茄幼苗30 min后，將幼苗放入含有1 500頭 J2的Pluronic F-127凝膠中，觀察線蟲在根部的聚集及侵染情況。結果顯示，1～4 h時處理組和對照組番茄根周圍（1 mm內）有零星線蟲聚集，未檢測到線蟲進入根內。8 h時，對照組距根尖1 mm以內的數量已增加到20至30頭，處理組線蟲數量低于20頭。12～18 h時，對照組番茄對線蟲吸引的數量逐漸增加，且有逐漸聚攏成團的趨勢;而處理組線蟲在根尖的聚集數量開始增加，至18 h時開始有聚團現象。24 h后，處理組和對照組線蟲在根尖的聚團現象消失，線蟲進入根內。

對不同時間點的線蟲侵染數量統計結果表明：菌株MF11發(fā)酵液處理的番茄幼根中線蟲數量明顯低于對照（圖3A）。12 h時發(fā)酵液處理的番茄根與對照相比，對線蟲的侵染抑制效果最好，線蟲侵染數量降低了80.65%，其他時間點發(fā)酵液處理與對照相比，均顯著降低了線蟲侵染數量（圖3B）。表明，菌株MF11可降低番茄對根結線蟲的吸引，進而影響線蟲的侵染。

2.4?菌株MF11對南方根結線蟲的溫室盆栽防效

選取對線蟲致死率最高的菌株MF11用于溫室盆栽試驗。試驗結果表明：與對照相比，菌株MF11發(fā)酵液處理番茄植株21 d后，番茄根結數目降低，單位根質量的根結數目減少了86.53%（圖4）。菌株MF11發(fā)酵液處理番茄56 d后，與對照相比，卵塊數降低了70.52%，表明菌株MF11對南方根結線蟲的繁殖能力具有一定的抑制效果（圖4）。

2.5?菌株MF11對南方根結線蟲的田間防效

田間防效測定結果顯示：菌株MF11發(fā)酵液處理的番茄植株病情指數顯著低于清水對照，與10%噻唑膦處理效果無顯著差異（表2）。表明菌株MF11可用于根結線蟲的田間防治。

3?討論

利用根際微生物防治根結線蟲是近些年的研究熱點。由于微生物種群多樣性與植物生長發(fā)育息息相關，從健康植物的根際中篩選到具有生防潛力的微生物的概率將大幅度提高[26]。Zhou等從健康茄子的根際中篩選到2株生防菌株Pseudomonas sp. B1 和 Bacillus sp.B32，溫室盆栽試驗結果顯示B1和B32能夠顯著降低根結線蟲的侵染[27]。本研究從健康番茄植株根際中分離到1株具有良好殺蟲作用及田間防效較高的菌株MF11，經鑒定為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。

生防菌可產生具有毒殺線蟲的活性酶、抗生素、揮發(fā)性物質和毒素等代謝物，通過毒殺作用、抑制卵孵化等方式來防治根結線蟲病害。例如短小芽胞桿菌能夠直接作用于根結線蟲體表，在離體試驗中對根結線蟲起到顯著防效[28];枯草芽胞桿菌可產生抗菌物質、殺線蟲揮發(fā)物以及脂肽類化合物直接殺死二齡幼蟲和卵[29-31]。菌株MF11發(fā)酵液具有較高殺線蟲活性并且隨著時間的延長殺蟲作用明顯，說明菌株MF11的代謝產物含有對南方根結線蟲二齡幼蟲具有毒殺作用的活性物質，代謝產物的活性成分尚有待探究。

植物根系分泌物是由植物根部分泌的各種化學物質，主要包括有機酸、糖類、酚類和各種氨基酸等，是植物根際微生物重要的營養(yǎng)物質，可作為植物和根際微生物間的信號物質參與根際微生物與寄主的識別[32-35]。研究結果表明根系分泌物對線蟲卵的孵化、存活、線蟲運動的方向性、線蟲穿刺以及發(fā)育等有影響。生防菌可通過改變植物根系分泌物組成進而排斥線蟲和影響線蟲發(fā)育以及降低卵孵化效率等[36-38]。本研究發(fā)現熒光假單胞菌MF11處理番茄植株后，番茄根對南方根結線蟲的吸引力顯著下降，從而影響了線蟲的侵染;盆栽試驗中發(fā)現菌株MF11處理后，線蟲產卵率顯著下降，表明菌株MF11的定殖可能影響了植物根系分泌物的組成，進而影響了線蟲與寄主的識別以及線蟲的發(fā)育。菌株MF11影響根結線蟲識別和導向寄主植株根部的具體機制仍不清楚，還需進一步研究。

生防制劑在田間的應用受到土壤溫度、濕度、pH等外界因素的影響，防治效果不穩(wěn)定[39]。本研究中，菌株MF11在田間的防治效果與目前廣泛使用的化學藥劑噻唑膦相當，達到66.71%。但由于化學殺線劑環(huán)境相容性差，危害大，使用成本高，所以熒光假單胞菌MF11可作為化學殺線劑替代品，具有良好的開發(fā)前景。后續(xù)要在其應用技術例如劑型開發(fā)、施用方法等方面進行研究，進一步提高其防治效果。

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（責任編輯：張震林）