血小板自噬在心血管疾病中的研究進(jìn)展▲

蔣志雄 朱智德 盧健棋 祁 祥 何曉羚

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西南寧市 530200；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)博物館，廣西南寧市 530200；3 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科/國家中醫(yī)心血管病臨床醫(yī)學(xué)研究中心分中心，廣西南寧市 530200)

【提要】 自噬是指細(xì)胞在自噬相關(guān)基因的調(diào)節(jié)下，利用溶酶體降解自身受損、變性或衰老的大分子物質(zhì)及細(xì)胞器的自我消化過程，是細(xì)胞維持動態(tài)平衡的重要方式，廣泛存在于真核細(xì)胞。無核血小板存在自噬，自噬可通過影響血小板的活化、黏附、聚集功能，從而參與動脈硬化、動脈血栓形成、心肌梗死過程。對血小板自噬的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究，有助于為心血管疾病的防治尋求更安全高效的方法，減少心血管不良事件的發(fā)生。故本文對血小板自噬在心血管疾病中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

《中國心血管病報告2018》的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，2018年我國心血管疾病患者高達(dá)2.9億，心血管疾病的病死率居疾病譜首位，占居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上[1]。隨著心血管疾病患病率的增高，其占用的醫(yī)療資源也逐漸增多，高額的住院費(fèi)用給社會和家庭造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，并且疾病嚴(yán)重威脅人們的生命健康。血小板是由巨核細(xì)胞分化而來的碎片，隨血液流動運(yùn)行至全身，具有止血、免疫、抗炎等作用，參與動脈粥樣硬化、動脈血栓形成、心肌梗死等過程，在心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展中占重要地位?？寡“逯委熓侵委熜难芗膊〉闹匾侄?，可通過抑制血小板的活化、黏附、聚集等功能來防止斑塊及血栓形成，減少心血管不良事件的發(fā)生。但是抗血小板藥物導(dǎo)致的拮抗作用及出血風(fēng)險，有增加心腦血管意外的可能。因此，為心血管疾病的治療尋求高效安全的靶點(diǎn)十分重要。自2012年我國學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)血小板中存在自噬并影響血小板功能后[2]，有關(guān)血小板自噬在與血小板功能密切相關(guān)的動脈血栓形成、心肌缺血再灌注損傷等疾病中的研究逐漸增多，通過干預(yù)血小板自噬改善疾病表型成為治療疾病的新思路。本文對血小板自噬在心血管疾病中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為心血管疾病的防治提供參考。

1 細(xì)胞自噬

自噬指細(xì)胞在自噬相關(guān)基因的調(diào)節(jié)下利用溶酶體降解自身受損、變性或衰老的大分子物質(zhì)及細(xì)胞器的自我消化過程[3]。該現(xiàn)象最早由Clark和Novikoff發(fā)現(xiàn)，他們通過電鏡在小鼠的腎組織中觀察到包含線粒體等細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)的膜性結(jié)構(gòu)，并將其命名為致密小體；1963年，de Duve將這種細(xì)胞中存在的包裹細(xì)胞質(zhì)的膜囊泡結(jié)構(gòu)現(xiàn)象正式命名為自噬[4-5]。1992年，日本學(xué)者大隅良典教授首次報告了蛋白在酵母細(xì)胞囊泡中自噬性降解的現(xiàn)象，并發(fā)現(xiàn)了參與自噬過程的自噬相關(guān)基因[6]。自此有關(guān)自噬的研究進(jìn)入新的階段，有研究者發(fā)現(xiàn)典型的自噬途徑包括34個以上的自噬相關(guān)基因，其中近半數(shù)基因可在哺乳動物中被觀察到[7]。自噬過程包括激活、目標(biāo)識別、自噬體形成、溶酶體融合和降解，均由已定義的自噬相關(guān)基因蛋白驅(qū)動[8]。根據(jù)哺乳動物細(xì)胞中不同的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑和底物，自噬可以分為大自噬、微自噬、分子伴侶介導(dǎo)的自噬[9]。

自噬對維持正常生命活動及細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)平衡具有重要作用，在饑餓、缺氧、營養(yǎng)缺乏、藥物的誘導(dǎo)下，自噬可被激活，產(chǎn)生氨基酸、核苷酸、糖和脂肪酸等代謝燃料，從而維持細(xì)胞的生命活動[10-11]。但自噬又是一把“雙刃劍”，基礎(chǔ)水平的自噬有助于清除受損的細(xì)胞器，為生命活動提供“原料”；而過度的自噬則會破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能，對細(xì)胞及其生命活動產(chǎn)生不利影響。

2 血小板自噬

2.1 血小板的來源與功能 血小板是由巨核細(xì)胞分化而來的無核細(xì)胞質(zhì)碎片，表面含有成熟巨核細(xì)胞的CD41、CD61(整合素αⅡbβ3)、CD42(糖蛋白Ⅰb)和糖蛋白Ⅴ等特異性標(biāo)志物，同時含有大量來自巨核細(xì)胞的mRNA，可以合成蛋白質(zhì)并參與血小板功能的調(diào)節(jié)[12-13]。血小板的主要生理功能是介導(dǎo)血栓形成和止血，參與血栓形成、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等過程[12-13]。一般情況下，血小板在人體循環(huán)中的壽命為7～10 d，在小鼠中為4～5 d[14-15]。而巨核細(xì)胞由造血干細(xì)胞分化而來，抑制造血干細(xì)胞的自噬活動可影響巨核細(xì)胞的形成和血小板功能[16]。在敲除自噬相關(guān)蛋白(autophagy-related protein,ATG)17基因的小鼠模型中，巨核細(xì)胞的生成和分化受到影響，這導(dǎo)致血小板的生成減少、體積變大、止血功能減弱[17]?？梢?，自噬在血小板的生成及功能中發(fā)揮著重要作用。

2.2 血小板自噬對血小板功能的影響 以往對自噬的研究大多聚焦于真核細(xì)胞，2014年，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉偉團(tuán)隊首次報告血小板自噬，并發(fā)現(xiàn)血小板自噬的發(fā)生依賴自噬相關(guān)基因Beclin1，Beclin1+/-小鼠血小板自噬降低及尾部出血時間延長，且血小板黏附和聚集功能受到抑制，而血小板自噬與真核細(xì)胞的自噬一樣，均由Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶(class Ⅲ phosphatidylinositol 3-kinase，PI3KC3)及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,MTOR)介導(dǎo)，并且饑餓及藥物巴氟霉素可以激活自噬[18]。Pieczarka等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在嚴(yán)重非再生性貧血史賓格犬的血小板中可觀察到異常增生的空泡，空泡化是細(xì)胞超微形態(tài)下血小板自噬的過程，可影響血小板功能，這也為血小板自噬提供了超微結(jié)構(gòu)的支持證據(jù)。以上研究提示，細(xì)胞核不是自噬發(fā)生的必要條件，血小板自噬與血小板功能密切相關(guān)。隨后有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，血小板雖然無核，但具有線粒體及溶酶體等自噬發(fā)生的條件，具有自噬過程中所需蛋白，包括unc-51樣激酶蛋白、200 KDa的FAK家族激酶相互作用蛋白、自噬相關(guān)蛋白Beclin1、液泡分選蛋白(vacuolar protein sorting,VPS)34、VPS15、ATG14、核受體結(jié)合因子2、紫外線輻射耐受相關(guān)基因編碼的蛋白、ATG7、ATG12-ATG5的共軛復(fù)合物、ATG3和微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ等[20]。線粒體是血小板發(fā)生自噬的重要場所，血小板中的線粒體自噬主要通過攜帶FUN14結(jié)構(gòu)域蛋白1(FUN14 domain-containing protein 1,FUNDC1)、Parkin蛋白及Bcl-2腺病毒E1B 19 kDa蛋白相互作用蛋白3類似物(Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3 like,BNIP3L)等途徑進(jìn)行介導(dǎo)自噬[21-22]。血小板中線粒體自噬有助于維持血小板質(zhì)量和功能的完整性。血小板功能的改變是血小板自噬的直接結(jié)果，不少研究結(jié)果表明，自噬的增強(qiáng)可導(dǎo)致血小板活化，促進(jìn)止血和血栓形成[23-25]，通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/MTOR通路可減少自噬，從而抑制血小板活化[26]。亦有學(xué)者認(rèn)為自噬損害血小板的黏附和聚集功能，如Paul等[27]的研究證實(shí)，饑餓期間自噬和能量消耗的增加致使顆粒分泌減少及對固定化纖維蛋白原的黏附降低，最終導(dǎo)致血小板無法聚集，增加鼠尾出血時間；而通過補(bǔ)充乙酸鹽，可適度恢復(fù)血小板聚集反應(yīng)。Liu等[28]發(fā)現(xiàn)，具有抗血小板活性作用的R-硫辛酸通過調(diào)節(jié)PI3KC3的活性誘導(dǎo)血小板自噬，并且能夠減少血小板計數(shù)和縮短血小板壽命，從而降低糖尿病血栓形成風(fēng)險。雖然目前對于血小板自噬影響血小板功能的觀點(diǎn)尚未達(dá)成一致，但無論血小板自噬是促進(jìn)還是抑制血小板功能，它對血小板及血小板相關(guān)疾病的調(diào)節(jié)而言都是必需的。

3 血小板自噬與心血管疾病

3.1 血小板自噬與動脈血栓形成 正常情況下，血液在動脈中快速流動，使凝血酶不能在局部聚集，避免形成血栓。在動脈粥樣硬化斑塊破潰、血管完整性被破壞時，纖維蛋白原暴露，從而促進(jìn)血小板黏附、聚集，導(dǎo)致血栓形成。血小板功能的改變在動脈血栓的形成中具有重要作用。Liu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，血小板中的VPS34缺乏可抑制穩(wěn)定的動脈血栓形成，VPS34-/-的血小板其AKT的第473位氨基酸絲氨酸磷酸化水平降低，且VPS34缺乏會影響血小板中的MTOR信號傳導(dǎo)；采用VPS34抑制劑3MA預(yù)處理后，血小板不能正確黏附于膠原蛋白基質(zhì)，血小板的功能受到影響。糖尿病患者血小板過度活化可導(dǎo)致心腦血管事件發(fā)生風(fēng)險升高，并影響抗血小板藥物阿司匹林及氯吡格雷的抗凝效應(yīng)[21,29]。Lee等[21]報告，糖尿病患者血小板中BNIP3L表達(dá)水平增加，而Parkin基因敲除小鼠，尤其是PINK1基因敲除小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平增加、線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡增加和血栓形成。Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，BNIP3L通過與微管相關(guān)蛋白輕鏈3的直接作用來介導(dǎo)血小板線粒體自噬，且敲除BNIP3L基因可導(dǎo)致線粒體損傷、血小板活化降低及三氯化鐵誘導(dǎo)小鼠頸動脈損傷模型的血栓形成減輕。此外，BNIP3L介導(dǎo)的線粒體自噬通過抑制體內(nèi)線粒體蛋白B細(xì)胞淋巴瘤超大基因的自噬降解影響血小板壽命。自噬不僅在靜止?fàn)顟B(tài)下的血小板中發(fā)生，在血小板活化過程中也被誘導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)，敲除ATG7基因后，盡管小鼠血小板計數(shù)及體積正常，但血小板聚集發(fā)生，出現(xiàn)胞質(zhì)顆粒缺陷，導(dǎo)致小鼠尾部出血時間延長，促進(jìn)三氯化鐵誘導(dǎo)小鼠的頸動脈損傷模型血栓形成[23]。雷帕霉素是一種免疫抑制劑，具有免疫抑制、抗炎、抑制細(xì)胞遷移和增殖、促進(jìn)自噬和抑制動脈硬化的作用，常被作為自噬激活劑使用。在APOE-/-動脈粥樣硬化小鼠模型中，采用血小板膜包被納米顆粒作為靶向藥物干預(yù)動物，發(fā)現(xiàn)包裹雷帕霉素的血小板膜包被納米顆粒可顯著減緩動脈粥樣硬化的進(jìn)展并穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊[30]，對血栓形成有抑制作用。雷帕霉素支架是常見的藥物洗脫支架，主要作用是抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，預(yù)防支架內(nèi)再狹窄。但有研究報告，與裸金屬支架相比，雷帕霉素洗脫支架可能會增加支架內(nèi)血栓形成的風(fēng)險[31-32]。為進(jìn)一步探討雷帕霉素洗脫支架誘發(fā)血栓形成的機(jī)制，Jiang等[33]通過構(gòu)建改良的深靜脈血栓形成大鼠模型開展相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素促進(jìn)大鼠體內(nèi)血栓形成，這可能是雷帕霉素通過自噬增強(qiáng)大鼠臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的膜皺褶和血小板功能，導(dǎo)致血小板與大鼠臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的黏附增加。綜上，動脈血栓形成與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，而血小板自噬與動脈血栓形成關(guān)系密切，可通過介導(dǎo)自噬相關(guān)靶基因調(diào)控血小板的活性和功能，從而抑制血小板黏附、聚集和血栓形成，這或可為動脈血栓的治療提供參考依據(jù)。

3.2 血小板自噬與心肌缺血后再灌注損傷 線粒體是真核生物進(jìn)行氧化代謝的場所，是細(xì)胞的能量供應(yīng)中心，其數(shù)量和質(zhì)量影響細(xì)胞的生命活動。心臟許多重要的生理活動，如心肌收縮和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持均需要線粒體源源不斷地供給能量，保護(hù)線粒體功能有助于維持心肌細(xì)胞的存活[34]。因此，完整的線粒體結(jié)構(gòu)對維持心臟活動具有十分重要的作用。心肌缺血后再灌注損傷指冠狀動脈阻塞后在一定時間又重新再通時，雖然缺血心肌得以恢復(fù)灌注，但其組織損傷反而加重的病理過程，常涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、線粒體損傷等機(jī)制[35-37]。其中，線粒體損傷是心肌缺血后再灌注損傷的主要原因，并且線粒體損傷在缺氧、缺血和再灌注的反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[38]。在缺血后再灌注中，血小板衍生的5-羥色胺誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放過氧化氫，導(dǎo)致梗死區(qū)炎癥加重[39]，血小板膜糖蛋白Ⅰb、血小板膜糖蛋白Ⅵ、血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的活化導(dǎo)致血小板功能改變，影響微灌流，進(jìn)一步擴(kuò)大心肌梗死面積[40]。炎癥反應(yīng)是心肌缺血后再灌注損傷發(fā)生和發(fā)展的重要病理過程，可促進(jìn)心臟組織募集免疫細(xì)胞，調(diào)控炎癥反應(yīng)[41-42]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在動脈循環(huán)中，在炎癥介質(zhì)及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的共同作用下，循環(huán)血小板活化，從而釋放免疫調(diào)節(jié)成分[43]。另有研究顯示，血小板活化程度與缺血持續(xù)時間及再灌注損傷程度有關(guān)[44]。在缺血后再灌注損傷發(fā)生后，血小板可被凝血因子、二磷酸腺苷和炎癥細(xì)胞激活[45]。而線粒體的功能增強(qiáng)和代謝水平升高在血小板活化中起至關(guān)重要的作用[46]。缺陷性線粒體自噬引起血小板線粒體功能障礙，使三磷酸腺苷生成減少和鈣動員受損，導(dǎo)致血小板無法激活和聚集[47]。Zhou等[48]研究發(fā)現(xiàn)，在急性缺血后再灌注中，通過攜帶FUNDC1所需的線粒體自噬激活血小板，可擴(kuò)大心肌梗死區(qū)域；過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)是抵抗微血管缺血/再灌注損傷的關(guān)鍵防御劑，褪黑激素通過激活PPARγ抑制FUNDC1所需的線粒體自噬、血小板的線粒體功能和血小板的過度活化。Zhang等[49]報告血小板中的線粒體自噬以FUNDC1和ATG5依賴性方式在體內(nèi)發(fā)生，與缺血后再灌注誘導(dǎo)的心肌損傷有關(guān)，并且血小板中的線粒體自噬在心肌缺血后再灌注損傷中發(fā)揮雙重作用：在急性期時，線粒體自噬通過去除受損的線粒體來維持線粒體質(zhì)量和功能，從而促進(jìn)血小板活化；在慢性期時，缺氧導(dǎo)致的線粒體大量消耗致使血小板活性降低，從而防止過量的缺血后再灌注損傷。

4 小 結(jié)

血小板中存在自噬，并影響血小板功能。與真核細(xì)胞一樣，血小板自噬可被藥物、饑餓、氧化應(yīng)激、炎癥等激活，其主要與FUNDC1、Parkin、BNIP3L、PI3K/AKT/MTOR等途徑相關(guān)。血小板自噬可能是心血管疾病甚至是血小板相關(guān)性疾病防治的重要靶點(diǎn)，對血小板自噬進(jìn)行研究，可為心血管疾病防治提供新的方向。