新生牛血清快速篩選方法的建立

張豆，李月影，申碩，明平剛

武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，湖北武漢430207

Vero細(xì)胞是異倍體貼附依賴性細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)為成纖維細(xì)胞［1-3］，屬于傳代細(xì)胞系。新生牛血清（newborn bovine serum，NBS）是疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞培養(yǎng)不可缺少的重要物質(zhì)，血清中生長激素、結(jié)合蛋白、蛋白酶抑制因子等物質(zhì)在細(xì)胞生長和保護(hù)中發(fā)揮重要作用。血清質(zhì)量會(huì)受小牛產(chǎn)地、個(gè)體差異、出生后采血時(shí)間、季節(jié)等因素的影響［4-9］，導(dǎo)致各批次間質(zhì)量存在差異。因此，在疫苗生產(chǎn)中，要建立NBS的篩選方法。在大批量使用或變換NBS進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)前，需對不同廠家及不同批次的NBS進(jìn)行篩選［10-12］。

武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司研制的新型冠狀病毒滅活疫苗在生產(chǎn)中采用Vero細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)病毒制備疫苗，血清篩選采用細(xì)胞收獲量法，但該方法工作量大，時(shí)間長，不利于血清的大量篩選。因此，需建立更加快速的血清篩選方法。

本研究采用細(xì)胞收獲量測定法、微量終點(diǎn)稀釋測定法、相對增長率測定法、細(xì)胞3次連續(xù)傳代培養(yǎng)法、細(xì)胞倍增時(shí)間測定法對12種來自不同公司，不同批號的NBS進(jìn)行篩選，以期建立適應(yīng)Vero細(xì)胞培養(yǎng)的NBS快速篩選方法。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及血清 Vero細(xì)胞（137代）由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司提供；12批NBS分別來自山西潤生大業(yè)生物材料有限公司［批號分別為200426140（編號為A）和200505140（編號為M）］、內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司［批號分別為20200424（編號為B）和20200524（編號為E）］、蘭州民海生物工程有限公司［批號分別為20200317（編號為D）、20200512（編號為F）、20200605（編號為I）、20200527（編號為J）和20200217（編號為K）］、浙江天杭生物科技股份有限公司［批號分別為18060102（編號為G，為正在車間生產(chǎn)使用的一批血清，設(shè)為對照血清）、20060101（編號為H）和20050104（編號為L）］。

1.2主要試劑及儀器 M199培養(yǎng)基和非動(dòng)物源性重組胰蛋白酶替代物購自美國Gibco公司；PBS（pH 7.4）由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司培養(yǎng)基室提供；碳酸氫鈉購自美國Sigma公司；倒置顯微鏡購自德國Leica公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自美國Thermo公司。

1.3細(xì)胞收獲量測定法 將T175瓶中匯合度為100%的Vero細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，按1∶8比例進(jìn)行傳代，分別加入T25培養(yǎng)瓶中，每批血清用3個(gè)T25培養(yǎng)瓶平行培養(yǎng)。將10 mL含10%待測血清或10%對照血清（實(shí)驗(yàn)前對待測血清和實(shí)驗(yàn)血清進(jìn)行盲編，得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)后揭盲）的培養(yǎng)基加至相應(yīng)T25瓶中，于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)5 d。加入2 mL消化液消化并計(jì)數(shù)，按1∶8傳代比例轉(zhuǎn)移至新的T25瓶中，細(xì)胞共傳代3次，傳代周期為5 d，記錄每1代次的細(xì)胞收獲量。計(jì)算每次計(jì)數(shù)每組3個(gè)樣本的總數(shù)和平均值。分別將3次第1、3、5天的各組細(xì)胞總數(shù)的平均數(shù)求和，并按照求和結(jié)果，從高到低排序并計(jì)分（如有6個(gè)樣品，排在第1的計(jì)6分，第2的計(jì)5分，以此類推排第6的計(jì)1分）。將每種樣品第1、3、5天的計(jì)分累加，并按照從高到低排序，計(jì)分相同的比較第5天的細(xì)胞總數(shù)，多的排在前面（第5天細(xì)胞總數(shù)相同的比較第3天細(xì)胞總數(shù)，第3天細(xì)胞總數(shù)相同的比較第1天細(xì)胞總數(shù)）。排在對照前的視為優(yōu)勝血清，排在對照后的第5天細(xì)胞總數(shù)不低于對照20%的可備用，低于對照20%的淘汰。

1.4微量終點(diǎn)稀釋測定法 在48孔板中加入含10%試驗(yàn)血清或?qū)φ昭宓募?xì)胞培養(yǎng)液，向48孔板第1列的每孔中加入T25瓶中匯合度為100%的Vero細(xì)胞約20 000個(gè)，從第1～12列進(jìn)行倍比稀釋，細(xì)胞數(shù)分別為20 560、10 280、5 120、2 560、1 280、640、320、160、80、40、20、10個(gè)，體積為1 mL。每批血清設(shè)3個(gè)平行組。將48孔板培養(yǎng)板置37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)10 d，觀察在同一細(xì)胞濃度下不同血清的細(xì)胞生長狀況，一般將稀釋度較高的細(xì)胞作為主要觀察對象［13-14］。從第7～11列（初始濃度為320、160、80、40、20個(gè)／孔）開始計(jì)數(shù)，第1～6列細(xì)胞已長滿，12列細(xì)胞數(shù)量太少，均不計(jì)數(shù)。選則第7～10列進(jìn)行評價(jià)。按照結(jié)果從高到低排序并計(jì)分，計(jì)分相同的比較第7列細(xì)胞總數(shù)，數(shù)量多的排在前面（第7列細(xì)胞總數(shù)相同的比較第8列細(xì)胞總數(shù)，第8列細(xì)胞總數(shù)相同的比較第9列細(xì)胞總數(shù)）。排在對照前的視為優(yōu)勝血清，可備用。

1.5相對增長率測定法 將T175瓶中匯合度為100%的Vero細(xì)胞制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，按1.0×105個(gè)／mL的終密度等體積分別加入T25培養(yǎng)瓶中，每批血清使用3個(gè)T25培養(yǎng)瓶平行培養(yǎng)。將10 mL含試驗(yàn)血清或?qū)φ昭宓呐囵B(yǎng)基加至相應(yīng)瓶中，于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)5 d。加入2 mL消化液消化并計(jì)數(shù)，按1∶8的傳代比例轉(zhuǎn)移至新瓶中。細(xì)胞共傳代3次，傳代周期為5 d，計(jì)算每1代次的細(xì)胞收獲量總數(shù)和平均值。并按下式計(jì)算細(xì)胞相對增長率［15］。細(xì)胞總數(shù)不低于對照組20%的可備用，低于對照組20%的淘汰。即相對增長率大于120%的血清可備用。

1.6細(xì)胞3次連續(xù)傳代培養(yǎng)法 將T175瓶中匯合度為100%的Vero細(xì)胞制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，按1.0×105個(gè)／mL的終密度等體積分別加入T25培養(yǎng)瓶中，每批血清使用3個(gè)T25培養(yǎng)瓶平行培養(yǎng)。將同一批細(xì)胞按每瓶1×105個(gè)的數(shù)量接種至T25培養(yǎng)瓶中，于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)5 d后，按每瓶1×105個(gè)細(xì)胞接種于T25瓶傳代，連續(xù)傳代3次并計(jì)數(shù)，計(jì)算每1代次細(xì)胞收獲量的總數(shù)和平均值，并計(jì)算細(xì)胞相對增長率［10］。細(xì)胞總數(shù)不低于對照組20%的可備用，低于對照組20%的淘汰。即相對增長率大于120%的血清可備用。

1.7細(xì)胞倍增時(shí)間測定法 將T25瓶中匯合度為100%的Vero細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。在48孔板每孔接種1.0×104個(gè)／mL細(xì)胞，培養(yǎng)液中含10%試驗(yàn)血清或?qū)φ昭宓募?xì)胞培養(yǎng)液，每孔液體體積為1 mL，充分混勻。每批血清接種21孔。將48孔板培養(yǎng)板置37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每隔24 h取3孔細(xì)胞計(jì)數(shù)，連續(xù)觀察7 d，繪制細(xì)胞生長曲線，并按下式計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間［9］。細(xì)胞生長曲線的最高峰值即血清促進(jìn)細(xì)胞生長的最大增殖量。選擇倍增時(shí)間小于對照組的血清作為備用血清。

式中T為細(xì)胞生長時(shí)間，A=log2Y／X（Y為細(xì)胞峰值前1 d細(xì)胞數(shù)，X為接種細(xì)胞數(shù)）。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 6.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用配對t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞收獲量測定法 12批血清積分結(jié)果由高到低排序?yàn)椋篔（34）、F（32）、K（29）、B（22）、E（20）、A（17）、M（15）、L（14）、G（13）、D（12）、H（11）、I（6），各試驗(yàn)組與對照組G相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為14.26、5.898、14.52、7.142、5.774、15.4、8.072、8.708、23.43、20.28、9.424，P分別為0.004 9、0.027 6、0.004 7、0.019、0.028 7、0.004 2、0.015、0.012 9、0.001 8、0.002 4、0.01）。其中，J、F、K、B、E、A、M、L、G、D、H可作為備用血清。見圖1。

圖1 細(xì)胞收獲量測定法篩選不同批次NBSFig.1 Screening of NBSof various batches by cell harvest assay

2.2微量終點(diǎn)稀釋測定法 12批血清積分結(jié)果由高到低排序?yàn)椋篔（46）、A（41）、K（41）、B（31）、E（30）、M（30）、F（26）、D（23）、L（16）、G（13）、H（10）、I（5），各試驗(yàn)組與對照組G比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為3.867、3.973、3.661、2.862、3.095、2.721、3.105、2.397、2.294、2.967、3.993，P分別為0.001 7、0.001 4、0.002 6、0.012 6、0.007 9、0.016 6、0.007 8、0.03、0.037 7、0.009 8、0.001 3）。其中，J、A、K、B、E、M、F、D、L可作為備用血清，見圖2。

圖2 微量終點(diǎn)稀釋測定法篩選不同批次NBSFig.2 Screening of NBS of various batches by micro end point dilution assay

2.3相對增長率測定法 12批血清篩選結(jié)果由高到低排序?yàn)椋篔、F、A、E、K、L、M、D、B、G、I、H，各試驗(yàn)組與對照組G比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為6.231、11.9、6.757、9.595、9.614、3.256、7.891、5.773、3.075、4.045、3.005，P分別為<0.000 1、<0.000 1、<0.000 1、<0.000 1、<0.000 1、0.007 6、<0.000 1、<0.000 1、0.010 6、0.001 9、0.016 9）。J、F、A、E、K、L、M、D、B、G、I、H組的相對增長率分別為184%、172%、163%、149%、137%、128%、128%、117%、110%、100%、96%、92%，其中J、F、A、E、K、L、M可作為備用血清。

2.4細(xì)胞3次連續(xù)傳代培養(yǎng)法 12批血清篩選結(jié)果由高到低排序?yàn)椋篔、F、A、D、K、E、L、B、G、M、H、I，其中M、H組與對照組G比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為0.343 9和0.206 1，P分別為0.739 8、0.981 8），因此不參與排序；其余各試驗(yàn)組與對照組G比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為5.66、4.484、6.177、6.739、2.571、2.556、2.718、2.541、2.118，P分別為0.005、0.002、0.003、<0.000 1、0.033 1、0.033 8、0.026 3、0.034 7、0.042）。J、F、A、D、K、E、L、B、G、M、H、I組相對增長率分別為166%、164%、136%、135%、121%、120%、118%、112%、111%、100%、99%、98%，其中，J、F、A、D、K、E可作為備用血清。

2.5細(xì)胞倍增時(shí)間測定法 12批血清按細(xì)胞倍增時(shí)間由短到長排序?yàn)镵（16.5 h）、L（16.78 h）、E（16.8 h）、I（17.5 h）、A（17.9 h）、D（17.9 h）、F（21.3 h）、B（22 h）、J（22.1 h）、G（22.3 h）、M（25.8 h）、H（26.2 h），其中J、M、H組與對照組G比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為0.392 2、0.785 4、0.974 2，P分別為0.701 3、0.446 3、0.347 1），因此不參與排序；其余各試驗(yàn)組與對照組G比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為3.6、3.928、4.382、2.838、2.352、2.762、4.148、3.235，P分別為0.003 2、0.001 7、0.007 7、0.01 4、0.035 1、0.016 1、0.001 1、0.006 5）。見圖3。K、L、E、I、A、D、F、B可作為備用血清。

圖3 細(xì)胞倍增時(shí)間測定法篩選不同批次NBSFig.3 Screening of NBS of various batches by doubling time assay

3 討論

對于NBS的篩選有多種方法，本研究主要探索適用于疫苗規(guī)?；a(chǎn)車間NBS快速篩選的方法。考慮到生產(chǎn)車間對于篩選時(shí)間的要求，本研究選擇了細(xì)胞收獲量測定法、微量終點(diǎn)稀釋測定法、相對增長率測定法、細(xì)胞3次連續(xù)傳代培養(yǎng)法、細(xì)胞倍增時(shí)間測定法5種方法對來源于不同廠家的11個(gè)批次的NBS進(jìn)行了篩選，并設(shè)置正在車間生產(chǎn)使用的1批血清作為對照組。

細(xì)胞收獲量測定法是目前武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司篩選NBS的方法，該方法存在時(shí)間長，工作量大的缺點(diǎn)。相對增長率測定法和細(xì)胞3次連續(xù)傳代培養(yǎng)法與細(xì)胞收獲量測定法較相似，相對增長率測定法與細(xì)胞收獲量測定法操作類似，均是連續(xù)傳代3次，按1∶8比例傳代。但相對增長率測定法是在傳代第5天進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算相對增長率相比細(xì)胞收獲量操作簡化了許多，用相對增長量評價(jià)NBS比相對積分的方法更能定量計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。從兩種方法的篩選結(jié)果來看，相對增長率測定法與細(xì)胞收獲量測定法結(jié)果基本一致。

細(xì)胞3次連續(xù)傳代培養(yǎng)法與上述兩種方法不同的是每次以固定的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行傳代。每次接種時(shí)需使各瓶中細(xì)胞數(shù)一樣，而實(shí)際上并不能保證各瓶中細(xì)胞數(shù)一致。以固定比例進(jìn)行3次連續(xù)傳代時(shí)，若開始傳代時(shí)接種的細(xì)胞數(shù)量差別較大，則經(jīng)過3次傳代的累積，會(huì)造成極大的誤差。而本研究中的細(xì)胞3次連續(xù)傳代培養(yǎng)法每次傳代時(shí)均會(huì)進(jìn)行計(jì)數(shù)，以固定的細(xì)胞數(shù)量傳代，可有效減小因?qū)嶋H傳代細(xì)胞量不一致造成的誤差。

微量終點(diǎn)稀釋測定法和細(xì)胞倍增時(shí)間測定法與其他3種方法相比，操作更加簡便，耗時(shí)也短。細(xì)胞倍增時(shí)間測定法用細(xì)胞增長1倍的時(shí)間長短來評價(jià)NBS的質(zhì)量。該種評價(jià)方法不可取，因?yàn)橛械难迨辜?xì)胞在生長初期增殖快，但后期生長放緩，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了該說法。細(xì)胞倍增時(shí)間測定法試驗(yàn)結(jié)果與其他4種方法的試驗(yàn)結(jié)果差距顯著，而其他4種方法試驗(yàn)結(jié)果基本保持一致。

綜上所述，本研究中選擇的5種NBS篩選方法中，微量終點(diǎn)稀釋測定法、相對增長率測定法和細(xì)胞3次連續(xù)傳代培養(yǎng)法是適用于疫苗生產(chǎn)車間的快速篩選方法。