重組人血白蛋白蛋白質(zhì)含量R S20國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的研制

王敏力，王弢，周倩，馬力，陳家啡，曹大偉，梁蔚陽，何永兵，余進(jìn)，李炎，徐苗，侯繼鋒

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院WHO生物制品標(biāo)準(zhǔn)化和評(píng)價(jià)合作中心 衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局生物制品質(zhì)量研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050；2.蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司，甘肅蘭州730046；3.華蘭生物工程股份有限公司，河南新鄉(xiāng)453003；4.博雅生物集團(tuán)股份有限公司，江西撫州344000；5.山東泰邦生物制品有限公司，山東 泰安271000；6.廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州510180；7.四川遠(yuǎn)大蜀陽藥業(yè)有限責(zé)任公司，四川 成都610214；8.上海萊士血液制品股份有限公司，上海200245；9.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川 成都611731

近年，重組人血白蛋白（recombinant human albumin）的研發(fā)進(jìn)展迅速，未來上市后將有助于解決現(xiàn)階段的原料血漿來源緊張和血液制品病毒安全性問題。重組人血白蛋白的表達(dá)體系為酵母（畢赤酵母或釀酒酵母）、水稻胚乳細(xì)胞等。傳統(tǒng)的基因重組藥物的蛋白質(zhì)含量?jī)H需達(dá)到μg／L或mg／L級(jí)別即可滿足臨床需求，而重組人血白蛋白終產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量應(yīng)達(dá)到50~250 g／L，臨床使用時(shí)輸注總量應(yīng)達(dá)到10 g或10 g以上才能起到治療作用，因此，該產(chǎn)品的研制、生產(chǎn)及質(zhì)量控制面臨更多技術(shù)瓶頸，在關(guān)鍵質(zhì)量控制中應(yīng)包括且不限于生產(chǎn)過程中工藝及產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)控制、結(jié)構(gòu)一致性確認(rèn)與控制等［1］。特別應(yīng)嚴(yán)格控制糖基化或糖化的重組人血白蛋白、宿主細(xì)胞殘留蛋白等潛在危害性雜質(zhì)。

因此，為提高在重組人血白蛋白質(zhì)量控制中特別是定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，引入重組人血白蛋白的蛋白質(zhì)含量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品成為迫切需要。本研究采用重組人血白蛋白為原料制備蛋白質(zhì)含量RS20（reference standard 20）國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用凱氏定氮法在多個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行標(biāo)定，以期應(yīng)用于重組人血白蛋白等產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1原料 重組人血白蛋白原料由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，規(guī)格為：200 mg／mL，50 mL／瓶，UPLC-SEC法未檢出多聚體及裂解物，Native電泳法純度＞99.9%。

1.2蛋白質(zhì)含量R S20國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的制備 在符合藥品GMP要求的車間內(nèi)，將原料用滅菌注射用水稀釋至蛋白質(zhì)終濃度約為20 mg／mL后，經(jīng)0.22μm除菌過濾，按1 mL／支分裝，凍干，于-20℃保存。

1.3標(biāo)定方法 參與協(xié)作標(biāo)定的單位包括中國(guó)食品藥品檢定研究院、國(guó)內(nèi)部分血液制品批簽發(fā)授權(quán)藥檢所、血液制品生產(chǎn)企業(yè)等共8家機(jī)構(gòu)（代碼分別為L(zhǎng)AB01~LAB08）。將1.2項(xiàng)制備的樣品于2~8℃條件下運(yùn)輸至8家機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室，按《中國(guó)藥典》三部（2020版）［2］中的凱氏定氮法進(jìn)行檢測(cè)，各實(shí)驗(yàn)室分別進(jìn)行6~10次獨(dú)立測(cè)定。以蛋白質(zhì)含量（0.40 mg／mL濃度級(jí)差遞增）為橫坐標(biāo)，數(shù)據(jù)數(shù)量頻數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品蛋白質(zhì)含量數(shù)據(jù)數(shù)量的頻數(shù)分布圖。

1.4標(biāo)準(zhǔn)品的檢定

1.4.1分裝誤差 于標(biāo)準(zhǔn)品生產(chǎn)過程中分裝（凍干前）前、中、后段，按照分裝企業(yè)SOP規(guī)定隨機(jī)共抽取6支樣品，并測(cè)定裝量，計(jì)算分裝誤差。

1.4.2水分含量 將標(biāo)準(zhǔn)品于2~8℃保存87 d，取3支樣品，按《中國(guó)藥典》三部（2020版）［3］中費(fèi)休氏法-容量滴定法進(jìn)行水分測(cè)定。

1.4.3均勻性 將標(biāo)準(zhǔn)品于2~8℃保存87 d，取5支樣品，按《中國(guó)藥典》三部（2020版）［4］附錄0102項(xiàng)下裝量差異方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.4穩(wěn)定性 將制備的標(biāo)準(zhǔn)品于-20℃保存14個(gè)月，分別于2、3、4、5、6、7、14個(gè)月取樣；分別于-20、4、23、32℃保存6個(gè)月，取樣。按《中國(guó)藥典》三部（2020版）［2］中凱氏定氮法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量。

2 結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)品的協(xié)作標(biāo)定 參加協(xié)作標(biāo)定的8家實(shí)驗(yàn)室對(duì)制備的標(biāo)準(zhǔn)品共進(jìn)行了58次獨(dú)立測(cè)定，實(shí)驗(yàn)室間均值為19.05 mg／mL，95%置信區(qū)間為18.80~19.31 mg／mL，均值標(biāo)準(zhǔn)差為0.308 7 mg／mL，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.109 1 mg／mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.62%。各實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)結(jié)果間及室間檢測(cè)結(jié)果均值均符合正態(tài)分布。見圖1和表1。8家實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白含量數(shù)據(jù)數(shù)量頻數(shù)在18.80~19.20 mg／mL區(qū)間，呈明顯集中趨勢(shì)，表明實(shí)驗(yàn)室誤差與方法偏倚較小。見圖2。

圖1 8家實(shí)驗(yàn)室對(duì)重組人血白蛋白蛋白質(zhì)含量RS20國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)定結(jié)果Fig.1 Calibration results of national standard RS20 for recombinant human albumin protein content by eight laboratories

圖2 重組人血白蛋白蛋白質(zhì)含量RS20國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定結(jié)果的數(shù)據(jù)數(shù)量頻數(shù)分布圖Fig.2 Data frequency distribution of calibration results of national standard RS20 for recombinant human albumin protein content

表1 8家實(shí)驗(yàn)室標(biāo)定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析（mg／mL）Tab.1 Statistical analysis of calibration results by eight laboratories（mg／mL）

2.2標(biāo)準(zhǔn)品檢定結(jié)果

2.2.1分裝誤差 于標(biāo)準(zhǔn)品分裝過程前、中、后段隨機(jī)抽取6支樣品，分裝誤差分別為-0.07%、-0.04%、0.04%、0.01%、0.08%、-0.02%，均在±0.1%以內(nèi)，符合相關(guān)要求。

2.2.2水分含量 3支標(biāo)準(zhǔn)品樣品的水分含量分別為1.44%、2.43%、2.25%，均值約2.0%，均<3.0%，符合相關(guān)規(guī)定。

2.2.3均勻性 5支標(biāo)準(zhǔn)品樣品的裝量差異分別為-0.5%、0.5%、0%、-0.5%、0%，均在±1%以內(nèi)，符合相關(guān)規(guī)定。

2.2.4穩(wěn)定性 標(biāo)準(zhǔn)品于-20℃保存2、3、4、5、6、7、14個(gè)月時(shí)蛋白質(zhì)含量分別為18.09、18.58、18.71、19.36、18.88、18.61、18.48 mg／mL；于-20、4、23、32℃保存6個(gè)月時(shí)蛋白質(zhì)含量分別為18.48、18.82、18.60、18.35 mg／mL。兩者變化均較小，均在LAB01實(shí)驗(yàn)室內(nèi)控范圍（均值±2標(biāo)準(zhǔn)差），即17.87~19.55 mg／mL范圍內(nèi)。表明制備的標(biāo)準(zhǔn)品具有良好的穩(wěn)定性。

3 討論

重組人血白蛋白現(xiàn)階段主要的表達(dá)體系包括畢赤酵母、釀酒酵母、水稻胚乳細(xì)胞等，大腸埃希菌也可成功表達(dá)并獲得較高濃度產(chǎn)物［5-6］，快速發(fā)展的有效純化工藝大幅提高了酵母發(fā)酵及水稻胚乳細(xì)胞來源的白蛋白含量［7-11］。重組人血白蛋白除了可替代血漿來源的蛋白外，還可以結(jié)合藥物融合技術(shù)用于延長(zhǎng)已上市產(chǎn)品藥物的血清半衰期等，應(yīng)用前景廣泛［12-14］。

近期，針對(duì)新型重組人白蛋白在健康人體內(nèi)的安全性、耐受性、免疫原性、藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)進(jìn)行了隨機(jī)劑量放大研究，結(jié)果表明，重組人白蛋白耐受性良好，所有副反應(yīng)均為輕度或中度，且發(fā)生率與人血白蛋白相近，給藥后免疫反應(yīng)相關(guān)抗體或細(xì)胞因子無變化［15］。但重組人血白蛋白超高的蛋白濃度背景、分子的運(yùn)載特性、復(fù)雜繁多的二硫鍵、完整分子量層面結(jié)構(gòu)差異［16］等多個(gè)因素使其質(zhì)量控制和質(zhì)量研究較為復(fù)雜。重組人血白蛋白應(yīng)與人血白蛋白具有相同的空間結(jié)構(gòu)和理化特性［17-18］，對(duì)其中的糖類蛋白物質(zhì)、工藝相關(guān)雜質(zhì)殘留、宿主細(xì)胞蛋白殘留等均應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格控制［19-20］。對(duì)蛋白質(zhì)含量定量的相關(guān)檢測(cè)項(xiàng)目，應(yīng)優(yōu)先選用濃度與待測(cè)物相近的同質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。

本研究采用重組人血白蛋白為原料，按約20 mg／mL的理論蛋白濃度進(jìn)行稀釋，制備了重組人血白蛋白蛋白質(zhì)含量RS20國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品。8家機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室均采用凱氏定氮法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量，對(duì)制備的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)定，測(cè)定本批標(biāo)準(zhǔn)品蛋白質(zhì)含量為18.71~19.66 mg／mL，均值為19.05 mg／mL，95%置信區(qū)間為18.80~19.31 mg／mL，綜合考慮制備過程中配制、除菌過程等因素的影響，認(rèn)為該結(jié)果與理論蛋白濃度基本一致。實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果均值RSD為1.62%，表明實(shí)驗(yàn)室間標(biāo)定結(jié)果差異較小。為提高該批標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性和有效期，本批標(biāo)準(zhǔn)品制備為凍干劑型，于-20℃保存14個(gè)月及分別于-20、4、23、32℃保存6個(gè)月，標(biāo)準(zhǔn)品中的蛋白質(zhì)含量均未發(fā)生趨勢(shì)性變化，滿足技術(shù)預(yù)期要求［21-22］。建議本標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)存放于2~8或-20℃冷凍存放及運(yùn)輸。

綜上所述，本研究制備的標(biāo)準(zhǔn)品符合各項(xiàng)預(yù)期技術(shù)指標(biāo)和相關(guān)規(guī)定，規(guī)定代碼為：280030-201901，可用于重組人血白蛋白等產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

志謝衷心感謝蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司、華蘭生物工程股份有限公司、博雅生物集團(tuán)股份有限公司、山東泰邦生物制品有限公司、廣東省藥品檢驗(yàn)所、四川遠(yuǎn)大蜀陽藥業(yè)有限責(zé)任公司、上海萊士血液制品股份有限公司、四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院所有參與本次標(biāo)準(zhǔn)品生產(chǎn)研制和協(xié)作標(biāo)定的工作人員