郭垠利,劉承波
1.貴州師范學(xué)院化學(xué)與材料學(xué)院,貴州貴陽550018;
2.江陵縣人民醫(yī)院檢驗科,湖北荊州434100
臨床上替普瑞酮(geranylgeranylacetone,GGA)主要應(yīng)用于胃腸道的潰瘍疾病治療中。在多個腦區(qū)的神經(jīng)元中、肝臟組織細胞中、腦梗塞以及光損傷等造成的細胞損傷中,GGA通過誘導(dǎo)蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的表達而使熱休克因子-1(heat shock factor 1,HSF-1)磷酸化,調(diào)節(jié)HSF-1的轉(zhuǎn)錄活性,使熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)70表達量升高,抑制ROS的生成功能,從而達到保護細胞損傷的作用[1-3]。Apoptozole(AP)是HSP70的抑制劑,通過抑制HSP70與APAF-1的相互作用,誘導(dǎo)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶caspase依懶性的凋亡反應(yīng)[4]。APRILE等[5]研究發(fā)現(xiàn),人類分子伴侶HSP70抑制帕金森病相關(guān)蛋白α-突觸核蛋白的淀粉樣蛋白原纖維的伸長,并且能夠與錯誤折疊的蛋白相互作用,阻止聚集物的形成,協(xié)助錯誤折疊的α-突觸核蛋白降解,該機制能夠有效抑制神經(jīng)退化性病變。
在生物機體內(nèi),細胞凋亡的各個通路間并不是獨立的,而是存在相互調(diào)節(jié)的作用。該調(diào)節(jié)主要通過Bcl-2原癌基因的編碼產(chǎn)物Bcl-2蛋白家族來實現(xiàn)。Bcl-2家族按其功能可分為抗凋亡的Bcl-2亞族和促凋亡的Bax亞族,而Bax是線粒體凋亡信號通路上游的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[6]。HSP70能夠依賴其所具有的分子伴侶的功能及ATPase的活性,通過caspase依賴或caspase非依賴的活動參與細胞凋亡信號通路的多個環(huán)節(jié)。有研究表明,誘導(dǎo)HSP70的過表達能夠有效抑制促凋亡蛋白Bax從胞質(zhì)向線粒體的轉(zhuǎn)移,抑制線粒體釋放促凋亡因子,從而調(diào)控線粒體的上游通路,進一步抑制凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3的誘導(dǎo)表達[7]。同時,DARLING等[8]的研究也表明,在神經(jīng)元細胞中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡同樣依賴于Bax的傳遞。其通過抑制Bax蛋白抑制因子1(Bax inhibitor-1,BI-1)的表達,進一步抑制pro-caspase-12前體的堆積,誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的特異性蛋白酶caspase-12的切割活化,進一步啟動凋亡執(zhí)行因子caspase-3的表達,從而促使凋亡發(fā)生。
帕金森(Parkinson disease,PD)是一種中老年常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其主要臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、步態(tài)不穩(wěn)、運動遲緩等運動障礙,以及非運動癥狀如神經(jīng)異常、嗅覺衰退、睡眠障礙疾?。?-10]。在65歲以上人群中,PD發(fā)病率約2%[11]。隨著全球人口老齡化程度日益加劇,PD臨床發(fā)病率呈逐年上升趨勢。據(jù)有關(guān)組織機構(gòu)預(yù)測,至2040年,全球PD患者人數(shù)將由2015年的620萬急增至1 290萬,不僅會嚴重影響患者生活質(zhì)量,而且會給患者家庭以及社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)[12-13]。在對PD的分子病理學(xué)研究中,通常通過1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-te-trahydropyridine,MPTP)誘導(dǎo)構(gòu)建PD的毒理學(xué)模型。MPTP作為一種具有神經(jīng)毒性的物質(zhì),在大腦內(nèi)轉(zhuǎn)化為高毒性的1-甲基-4苯基吡啶離子MPP+,并在多巴胺能(dopaminergic,DA)神經(jīng)元中聚集,從而誘導(dǎo)DA神經(jīng)元的退行性病變[14]。MPP+是體外構(gòu)建PD模型的常用藥物,其被DA神經(jīng)元轉(zhuǎn)運蛋白攝取后,聚集在線粒體內(nèi),通過產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),增加活性氧,抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ活性,阻斷NADH氧化磷酸化系統(tǒng),使三磷酸腺苷生成減少,最終導(dǎo)致黑質(zhì)內(nèi)DA神經(jīng)元變性死亡。因此,本研究用MPP+作用于PC12細胞誘導(dǎo)PD細胞模型,通過研究GGA對MPP+藥物誘導(dǎo)的PD細胞模型中HSP70蛋白的表達及細胞凋亡的影響,探討其抗細胞凋亡機制及在PD患者腦中的神經(jīng)保護作用。
1.1細胞 PC12細胞株(大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細胞株)購自中國科學(xué)院昆明動物研究所。
1.2主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO;胎牛血清和馬血清購自美國Hyclone公司;青霉素鏈霉素雙抗、MTT購自北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒購自美國Bio-RAD公司;小鼠抗Bax(sc-20067)、HSP70(sc-66048)、caspase-3(sc-56053)單抗及兔抗pro-caspase-12(sc-5627)多抗、鼠抗β-actin(sc-47778)單抗購自美國Santa Cruz Biotechnology公司;GGA購自日本衛(wèi)材中國藥業(yè)公司;MPP+、AP購自美國Sigma;HRP標(biāo)記的Goat anti-Rabbit、Goat anti-Mouse購自美國KPL公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.3細胞培養(yǎng) 用RPMI164培養(yǎng)基(含10%滅活供體馬血清、5%滅活胎牛血清和1%雙抗)于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)PC12細胞,當(dāng)細胞融合度達90%時,棄上清,加入新鮮的培養(yǎng)基,用移液器吹散細胞,平均分裝至2個玻璃培養(yǎng)皿中。
1.4P D模型的建立及其細胞存活率檢測 采用MTT法。用培養(yǎng)液懸浮對數(shù)生長期PC12細胞,調(diào)整細胞懸液濃度為5×105個/mL,加入細胞懸液,100μL/孔,設(shè)6個復(fù)孔;用0.3 mmol/L MPP+刺激貼壁的PC12細胞0、3、6、12和24 h,并根據(jù)刺激時長不同,分別將上述給藥細胞設(shè)為0、3、6、12、24 h組,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);加入MTT溶液,20μL/孔,繼續(xù)培養(yǎng)4 h;終止培養(yǎng),吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液,加入二甲基亞砜,150μL/孔,置搖床低速震蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解;酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測各孔A值。
1.5P D模型的分組處理 為檢測PD模型中凋亡標(biāo)記分子蛋白Bax及pro-caspase-12的表達,將細胞模型分為2組:不給藥的control組、0.3 mmol/L MPP+刺激6 h的給藥組;為了檢測GGA誘導(dǎo)HSP70表達抑制凋亡的作用,將PD模型細胞分為4組:PD模型構(gòu)建成功的control組、0.2 mmol/L GGA給藥組(GGA組)、1μmol/L HSP70抑制劑單獨給藥組(AP組)及0.2 mmol/L GGA與1μmol/L HSP70抑制劑聯(lián)合用藥組(GGA+AP組)。
1.6B a x、pro-caspase-12、caspase-3、H S P70蛋白表達的檢測 采用Western blot法。用RIPA細胞裂解液裂解細胞,取10μg總蛋白,經(jīng)10%SDS-PAGE分離后,電轉(zhuǎn)至PVDF膜,加入10%脫脂奶4℃封閉過夜;分別加入鼠抗Bax、caspase-3和HSP70單抗及兔抗pro-caspase-12多抗,同時以鼠抗β-actin單抗作為內(nèi)參(均1∶5 000稀釋),37℃孵育1 h;抗原抗體結(jié)合后,以1×TPBS緩沖液洗滌3次,每次5 min,分別加入HRP標(biāo)記的Goat anti-Mouse和Goat anti-Rabbit(均1∶10 000稀釋),37℃孵育l h;用1×TPBS緩沖液洗滌5次,每次10 min,ECL顯影檢測蛋白表達情況。Image軟件計算灰度值,目的蛋白與β-actin灰度值的比值即為目的蛋白相對表達量。
1.7統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準差(x±s)表示,兩組間比較采用t檢驗;多組間比較采用單因素方差分析,事后多重比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α為0.05,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1細胞存活率 MTT法檢測結(jié)果表明,與0 h組相比,用0.3 mmol/L MPP+刺激PC12細胞3、6、12和24 h后細胞存活率均顯著下降(t分別為6.659、8.647、11.24和12.31,P均<0.01)。見圖1。表明PD模型構(gòu)建成功。本文選擇6 h組作為PD建模成功試驗組。
圖1 MPP+刺激PC12細胞凋亡的檢測Fig.1 MPP+stimulated apoptosis of PC12 cells
2.2P D模型中B a x、pro-caspase-12蛋白的表達 與control組相比,給藥組Bax蛋白的表達(0.600 0±0.140 5)明顯升高(t=4.272,P<0.05),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性的含半胱氨酸的pro-caspase-12蛋白的聚集(-0.365 2±0.046 02)顯著下降,切割活化極顯著上升(t=7.937,P<0.01)。見圖2。2.3GG A和A P對P C12細胞中H S P70蛋白表達的影響 與control組相比,GGA組HSP70蛋白的表達明顯升高(t=4.569,P<0.01),而AP組明顯降低(t=2.855,P<0.05);GGA+AP組HSP70蛋白的表達較GGA組明顯降低(t=4.085,P<0.01)。見圖3和圖4。2.4GG A和A P對P C12細胞中B a x、pro-caspase-12和caspase-3蛋白表達的影響 與control組相比,GGA組Bax蛋白的表達被明顯抑制(t=2.370,P<0.05),而AP組明顯升高(t=3.546,P<0.01);GGA組pro-caspase-12蛋白的表達明顯升高(t=4.881,P<0.01),而AP組明顯降低(t=3.142,P<0.05)。GGA+AP組pro-caspase-12蛋白的表達較GGA組明顯降低(t=4.312,P<0.01)。GGA組caspase-3蛋白的表達較control組明顯降低(t=3.458,P<0.01),而AP組明顯升高(t=4.284,P<0.01)。GGA+AP組的Bax和caspase-3蛋白的表達與GGA組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.497,P>0.05)。見圖5和圖6。
圖2 PD模型中Bax、pro-caspase-12蛋白表達的Western blot檢測Fig.2 Western blotting of Bax and pro-caspase-12 proteins expressed in PD cell model
圖3 GGA和AP對PC12細胞HSP70蛋白表達影響的Western blot檢測Fig.3 Western blotting of effects of GGA and APon HSP70 expression in PC12 cells
圖4 GGA和AP對HSP70蛋白表達的影響Fig.4 Effects of GGA and APon HSP70 protein expression
圖5 GGA和AP對Bax、pro-caspase-12和caspase-3蛋白表達影響的Western blot分析Fig.5 Western blotting of effects of GGA and AP on expressions of Bax,pro-caspase-12 and caspase-3
圖6 GGA和AP對Bax(A)、pro-caspase-12(B)和caspase-3(C)蛋白表達的影響Fig.6 Effects of GGA and APon expressions of Bax(A),pro-caspase-12(B)and caspase-3(C)
PD是一種腦神經(jīng)退化性疾病,其具體的發(fā)病機制目前尚不明確。研究結(jié)果顯示,PD的發(fā)病機制可能與早期環(huán)境、氧化應(yīng)激、遺傳因素、線粒體功能障礙、年齡因素、免疫異常、細胞凋亡等諸多因素有關(guān)[15]。MPP+可通過抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ的活性導(dǎo)致線粒體功能紊亂,并產(chǎn)生大量的ROS,進而產(chǎn)生氧化應(yīng)激。而ROS是引起DA神經(jīng)元凋亡的重要原因之一,本研究結(jié)果顯示,MPP+刺激PC12細胞后,細胞啟動促凋亡反應(yīng),促進定位于胞漿中的促凋亡分子Bax蛋白轉(zhuǎn)移至線粒體膜上,在線粒體外膜插入形成通道,釋放Ca2+,對Bax有協(xié)同作用并抑制pro-caspase-12的聚集,從而促進pro-caspase-12切割活化,進而導(dǎo)致PD中DA神經(jīng)元凋亡[16]。
HSP70是細胞在缺氧、高熱、創(chuàng)傷、感染等外界環(huán)境刺激下產(chǎn)生的一種高度保守的蛋白質(zhì),持續(xù)性的氧化應(yīng)激反應(yīng)能使細胞內(nèi)HSP70蛋白表達量降低。有文獻報道,可通過提高動物體內(nèi)HSP70表達量,有效對抗因氧化應(yīng)激造成的相關(guān)損傷[17]。GGA是一種主要用于治療胃潰瘍的萜類藥物,同時也被認為是一種有效、低毒的HSP70誘導(dǎo)劑。目前在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)12種caspases,作為凋亡執(zhí)行者的caspase-3則是神經(jīng)元凋亡的重要標(biāo)志物[18]。我們在研究中發(fā)現(xiàn),GGA能顯著升高PD模型中HSP70水平,降低促凋亡因子Bax和caspase-3水平,并誘導(dǎo)caspase-12前體pro-caspase-12的聚集,抑制凋亡蛋白caspase-12的切割活化。同時,AP刺激PD模型,抑制HSP70表達,促進促凋亡因子Bax、caspase-3蛋白的表達,并抑制pro-caspase-12聚集,誘導(dǎo)caspase-12切割活化。GGA通過誘導(dǎo)PD模型中HSP70過表達,降低促凋亡因子Bax和caspase-3表達,抑制pro-caspase-12切割活化,進而抑制caspase依賴的凋亡途徑的激活。
本研究結(jié)果顯示,預(yù)防性給予GGA能夠調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達,GGA對于MPP+藥物誘導(dǎo)的PD模型中神經(jīng)凋亡具有保護作用。但由于PD的發(fā)病機制較為復(fù)雜,仍需進一步深入探討其可能的機制。GGA通過作用于藥物靶點HSP70蛋白,調(diào)節(jié)Bax蛋白的表達,減少caspase-12釋放,抑制caspase-3活性,從而減輕MPP+誘導(dǎo)的細胞凋亡。本研究為臨床上治療PD提供了新的思路,為將來徹底治愈PD提供了可能。