兩種工藝制備雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗的安全性及免疫原性評價(jià)

張峰典，張穎，李文娟，梅可佳，張朔，孫超，孫宏亮

1.吉林省藥品審核查驗(yàn)中心，吉林 長春130062；

2.長春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林 長春130012

腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）是由漢坦病毒（Hantavirus，HV）引發(fā)的一種自然疫源性疾?。?］，患者主要表現(xiàn)為出血、發(fā)熱及腎損傷等癥狀，該病在我國較高發(fā)，約占全世界病例的90%［2-3］。該病毒可分為30多個(gè)血清型，Ⅰ型和Ⅱ型在我國較流行［3］，其中感染野鼠型患者死亡率較高，而感染家鼠型患者致死率相對較低［4］。目前尚無特效治療藥物，預(yù)防該病最有效的措施仍是接種疫苗［5-6］。

我國生產(chǎn)的雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞主要有原代地鼠腎細(xì)胞和原代沙鼠腎細(xì)胞兩種，均采用10 L轉(zhuǎn)瓶工藝進(jìn)行培養(yǎng)，操作復(fù)雜且可控性差。細(xì)胞工廠因具有操作簡單、可控性好等優(yōu)點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于疫苗行業(yè)［7］，但應(yīng)用于雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗的制備尚未見相關(guān)報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)利用細(xì)胞工廠工藝制備雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗，并與原有10 L轉(zhuǎn)瓶工藝制備的滅活疫苗進(jìn)行比較，評價(jià)其免疫原性及安全性。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及病毒 原代地鼠腎細(xì)胞來源于12～14日齡SPF級健康地鼠腎臟，由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司制備；PS-6株（雙價(jià)腎綜合征出血熱病毒Ⅰ型毒種）工作種子庫（批號：出工P20151202）和L99株（雙價(jià)腎綜合征出血熱病毒Ⅱ型毒種）工作種子庫（批號：出工L20151205）為長春生物制品研究所有限責(zé)任公司疫苗三室保存。

1.2實(shí)驗(yàn)動物 SPF級小白鼠（10～12日齡，雌雄各半，體重10～12 g，共360只）、清潔級大耳白家兔（6月齡，雄性，體重2.0～2.5 kg，共6只）和SPF級豚鼠（6～8周齡，雌雄各半，體重250～400 g，共36只）均由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司動物室飼養(yǎng)并提供。本實(shí)驗(yàn)均以科研為目的對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行養(yǎng)殖和使用，且按照《國家實(shí)驗(yàn)動物管理法規(guī)》（國務(wù)院令第676號）動物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.3主要試劑及儀器 10 L轉(zhuǎn)瓶購自四川蜀牛玻璃儀器廠；40層細(xì)胞工廠購自康寧生命科學(xué)有限公司；Protein Molecular Weight Marker（low）購自日本TaKaRa公司；Sepharose 4FF凝膠柱購自美國GE公司。

1.4雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗的制備 分別應(yīng)用40層細(xì)胞工廠、10 L轉(zhuǎn)瓶兩種不同工藝培養(yǎng)原代地鼠腎細(xì)胞，按0.01～0.1 MOI分別接種出血熱病毒Ⅰ型和Ⅱ型工作種子批毒種，用病毒維持液培養(yǎng)72～96 h后收獲病毒液，每隔3～4 d收獲1次，添加新的病毒維持液后，可重復(fù)收獲3～5次，但10 L轉(zhuǎn)瓶僅可重復(fù)收獲1～2次，細(xì)胞即明顯脫落。收獲的病毒液經(jīng)病毒滅活、超濾濃縮、Sepharose 4FF凝膠柱層析純化、除菌過濾后即為單價(jià)原液，將出血熱病毒Ⅰ型和Ⅱ型單價(jià)原液按照1∶1等體積混合，再加入氫氧化鋁佐劑（終濃度為0.50 mg／mL）和人血白蛋白穩(wěn)定劑（0.2%），制備為雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗半成品。此外，10 L轉(zhuǎn)瓶工藝制備疫苗時(shí)還需加入終濃度為50μg／mL的硫柳汞防腐劑。采用細(xì)胞工廠和轉(zhuǎn)瓶工藝各制備3批疫苗（批號分別為GY01、GY02、GY03和ZY01、ZY02和ZY03）。對單價(jià)原液和成品進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢定。

1.5病毒形態(tài)觀察 分別取1批細(xì)胞工廠工藝制備的單價(jià)原液Ⅰ型（批號：GY01-Ⅰ）和單價(jià)原液Ⅱ型（批號：GY01-Ⅱ）及1批10 L轉(zhuǎn)瓶工藝制備的單價(jià)原液Ⅰ型（批號：ZY01-Ⅰ）和單價(jià)原液Ⅱ型（批號：ZY01-Ⅱ），用透射電子顯微鏡觀察負(fù)染后的病毒形態(tài)。

1.6病毒鑒定 分別取1批細(xì)胞工廠工藝制備的單價(jià)原液Ⅰ型（批號：GY02-Ⅰ）和單價(jià)原液Ⅱ型（批號：GY02-Ⅱ）及1批10 L轉(zhuǎn)瓶工藝制備的單價(jià)原液Ⅰ型（批號：ZY02-Ⅰ）和單價(jià)原液Ⅱ型（批號：ZY02-Ⅱ），經(jīng)SDS-PAGE分離病毒原液，濃縮膠濃度為3%，分離膠濃度為12%，考馬斯亮藍(lán)染色，進(jìn)一步對蛋白條帶進(jìn)行觀察。

1.7安全性分析

1.7.1家兔刺激試驗(yàn) 家兔右側(cè)后肢股四頭肌局部消毒后，經(jīng)肌肉注射兩種工藝制備的疫苗1 mL，陰性對照注射同體積同濃度的氫氧化鋁佐劑。家兔均于給藥后48 h處死，縱向切開股四頭肌，通過肉眼觀察判斷注射部位肌肉的刺激反應(yīng)。注射劑刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)如下［8］：0級為給藥部位無肉眼可見明顯反應(yīng)；1級為給藥部位輕度充血（直徑在0.5 cm以下）；2級為給藥部位中度充血（直徑在1.0 cm以下）；3級為給藥部位重度充血、紅腫、肌肉變性；4級為出現(xiàn)肌肉褐色變性、壞死（直徑在0.5 cm以下）；5級為肌肉嚴(yán)重變性，出現(xiàn)大片壞死。

1.7.2豚鼠主動過敏性試驗(yàn) 取6只豚鼠，經(jīng)腹腔注射兩種工藝制備的疫苗，0.5 mL／只，每日1次，連續(xù)注射3日，每日觀察豚鼠行為、特征。并將6只豚鼠于首次致敏前稱量體重，平均分成兩組，分別在第1次注射后第14及21日經(jīng)前后肢靜脈注射供試品溶液1 mL，觀察30 min，看是否出現(xiàn)過敏性反應(yīng)，若在一只動物身上出現(xiàn)豎毛、發(fā)抖、干嘔、連續(xù)噴嚏3聲、連續(xù)咳嗽3聲、紫癜和呼吸困難等現(xiàn)象中的2種或2種以上，或出現(xiàn)二便失禁、步態(tài)不穩(wěn)，或倒地、抽搐、休克，或死亡現(xiàn)象之一者，判定為過敏性反應(yīng)。

1.8免疫原性分析 分別將兩種不同工藝制備的疫苗經(jīng)后腿肌內(nèi)接種家兔，1.0 mL／只，每批4只。繼續(xù)飼養(yǎng)14 d后，進(jìn)行第2次免疫，方法和劑量與第1次免疫相同。第1次免疫后4周采血，分離血清，按照《中國藥典》三部（2015版）各論“雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗（地鼠腎細(xì)胞）中的3.4.6效價(jià)測定法”測定中和抗體滴度，家兔的Ⅰ型和Ⅱ型出血熱病毒中和抗體滴度均應(yīng)不低于《中國藥典》三部（2015版）標(biāo)準(zhǔn)1∶10。

2 結(jié)果

2.1病毒顆粒形態(tài) 電鏡觀察顯示，細(xì)胞工廠工藝制備的單價(jià)原液Ⅰ、Ⅱ型和10 L轉(zhuǎn)瓶工藝制備的單價(jià)原液Ⅰ、Ⅱ型病毒顆粒均為100 nm左右的粗糙圓形顆粒，均與HV一致，見圖1。

圖1 兩種工藝制備的Ⅰ型和Ⅱ型單價(jià)原液的電鏡觀察（×40 000）Fig.1 Electron microscopy of typesⅠandⅡvaccine bulks prepared by two processes（×40 000）

2.2病毒鑒定 12%SDS-PAGE分析顯示，細(xì)胞工廠工藝制備的單價(jià)原液Ⅰ、Ⅱ型和10 L轉(zhuǎn)瓶工藝制備的單價(jià)原液Ⅰ、Ⅱ型主要顯示兩條蛋白帶，相對分子質(zhì)量分別為70 000～73 000和約50 000，見圖2。

圖2 兩種工藝制備的Ⅰ型和Ⅱ型單價(jià)原液的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE profile typesⅠandⅡvaccine bulks prepared by two processes

2.3安全性

2.3.1家兔刺激試驗(yàn) 兩種工藝分別制備的3批疫苗對家兔注射部位的肌肉均無刺激性，均為1級反應(yīng)；病理觀察顯示，注射局部肌肉組織均未見與疫苗相關(guān)的病理變化，兩種工藝制備的疫苗家兔刺激試驗(yàn)結(jié)果無明顯差異，見圖3。表明兩種工藝制備的疫苗安全性一致。

圖3 兩種工藝制備的疫苗注射部位肌肉刺激性試驗(yàn)Fig.3 Muscle irritation at injection site of vaccines prepared by two processes

2.3.2豚鼠主動過敏試驗(yàn) 采用兩種工藝制備的疫苗均未出現(xiàn)豚鼠過敏性反應(yīng)，未觀察到豚鼠發(fā)抖、干嘔、豎毛、連續(xù)噴嚏或咳嗽3聲及以上，也未發(fā)現(xiàn)紫癜和呼吸困難等現(xiàn)象中的2種或以上，所有豚鼠均未出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)、抽搐、倒地、休克、二便失禁等癥狀或死亡。

2.4免疫原性 每批疫苗免疫的4只家兔其Ⅰ型和Ⅱ型出血熱病毒中和抗體滴度均大于1∶10，高于《中國藥典》三部（2015版）標(biāo)準(zhǔn)，表明兩種工藝制備的雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗免疫原性均良好。

3 討論

細(xì)胞工廠具有細(xì)胞貼壁緊密且不易脫落的特點(diǎn)，更適合貼壁細(xì)胞的生長，因此，越來越多的疫苗生產(chǎn)用貼壁細(xì)胞應(yīng)用細(xì)胞工廠培養(yǎng)。目前，細(xì)胞工廠培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展迅速，相較于轉(zhuǎn)瓶，其具有操作便捷，可控性好，占用空間較少等優(yōu)點(diǎn)，受到國內(nèi)外研究者的高度關(guān)注［9-10］，相關(guān)研究表明，其優(yōu)勢優(yōu)于轉(zhuǎn)瓶，且相較于生物反應(yīng)器，無類似的應(yīng)用限制（符合生產(chǎn)要求的車間供液管路及氣體管路）。鑒于以上優(yōu)勢，細(xì)胞工廠將越來越廣泛地應(yīng)用于疫苗行業(yè)。

本研究對采用細(xì)胞工廠和原10 L轉(zhuǎn)瓶工藝分別制備的疫苗進(jìn)行了疫苗特性、免疫原性研究及安全性評價(jià)，結(jié)果表明，兩種工藝制備的雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗質(zhì)量高度相似，細(xì)胞工廠工藝能夠替代原10 L轉(zhuǎn)瓶工藝。細(xì)胞工廠工藝操作簡便，可減少開口次數(shù)，大幅降低染菌風(fēng)險(xiǎn)，而且節(jié)約成本；另外，細(xì)胞工廠更適合細(xì)胞生長，且細(xì)胞質(zhì)量均一，能夠大幅提高產(chǎn)品的批間一致性［11-12］，因此，細(xì)胞工廠工藝的應(yīng)用將越來越廣泛，有望逐步替代轉(zhuǎn)瓶工藝［13-15］。但細(xì)胞工廠工藝制備的雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗應(yīng)用于人體的安全性及免疫原性仍需進(jìn)一步臨床評價(jià)。