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    miR-433在子癇前期患者中的表達及對滋養(yǎng)層細胞遷移和侵襲的影響研究

    2022-02-11 10:13:02張月霞張永苗
    國際檢驗醫(yī)學雜志 2022年2期
    關(guān)鍵詞:滋養(yǎng)層熒光素酶胎盤

    張月霞,李 翔,張永苗,董 莉

    1.南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院婦產(chǎn)科,江蘇南京 210014;2.南京市中醫(yī)院檢驗科,江蘇南京 210022;3.南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗科,江蘇南京 210014

    子癇前期(PE)是一種妊娠并發(fā)癥,是造成胎兒和產(chǎn)婦死亡的主要原因[1]。全球有3%~8%的妊娠期女性受到PE的影響[2-3]。PE主要表現(xiàn)為在妊娠中期或晚期、分娩過程中或分娩后出現(xiàn)的產(chǎn)婦高血壓、蛋白尿、血小板減少等癥狀,危及產(chǎn)婦和胎兒的生命。滋養(yǎng)層細胞的異常增殖和遷移侵襲會促進胎盤釋放可溶性因子從而導致PE的發(fā)生[4]。研究發(fā)現(xiàn),微小RNA在滋養(yǎng)層細胞中的異常表達可影響PE的進展[5-7]。微小RNA-433(miR-433)與多種腫瘤細胞的擴散、遷移侵襲有關(guān)[8-9]。然而,目前鮮見miR-433對PE患者滋養(yǎng)層細胞的影響研究。因此,本研究旨在探討miR-433在PE患者中的表達及其影響機制,為PE患者的治療提供新的靶點。

    1 資料與方法

    1.1一般資料 收集于2018年3月至2019年12月南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院就診的23例PE妊娠期女性和25例健康妊娠期女性的胎盤標本(孕32~40周)。術(shù)后(PE妊娠期女性行剖宮產(chǎn)術(shù),健康妊娠期女性行引產(chǎn)術(shù)及會陰側(cè)切術(shù))立即將胎盤組織在液氮中快速冷凍,-80 ℃保存,待進一步試驗。

    PE的診斷標準:既往血壓正常,孕20周后,收縮壓≥140 mm Hg或舒張壓≥90 mm Hg,24 h尿蛋白≥0.3 g[9]。納入標準:孕32~40周,符合PE診斷標準的妊娠期女性,自愿參與。排除標準:高血壓高危情況、血液系統(tǒng)疾病和異常妊娠與其他產(chǎn)科并發(fā)癥。本研究經(jīng)南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會批準,所有患者均簽署書面知情同意。PE妊娠期女性年齡19~34歲,平均(25.12±4.11)歲;體質(zhì)量指數(shù)(BMI)(24.41±2.78)kg/m2;收縮壓(154.06±7.65)mm Hg;舒張壓(102.25±6.48)mm Hg;尿蛋白(3.67±0.73)g/24 h;孕周(35.33±3.28)周;胎兒體質(zhì)量(2.28±0.52)kg。健康妊娠期女性年齡22~31歲,平均(25.37±3.19)歲;BMI(25.63±3.10)kg/m2;收縮壓(109.55±5.93)mm Hg;舒張壓(70.69±5.07)mm Hg;尿蛋白未檢出;孕周(36.05±3.10)周;胎兒體質(zhì)量(3.16±0.74)kg。兩組年齡和BMI比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。

    1.2儀器與試劑 人滋養(yǎng)層細胞HTR-8/SVneo、AR和JEG-3及人胚腎細胞293T購自中國科學院細胞庫;RPMI-1640完全培養(yǎng)基、胎牛血清購于Gibco公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR試劑盒購于Takara公司。引物購于上海生工公司。熒光素酶報告基因檢測盒購于Promega公司。JNK1抗體和GAPDH購于Abcam公司。Lipofectamine 3000試劑購于Invitrogen公司;SDS試劑盒、抗體稀釋液、磷酸鹽緩沖液(PBS)購于碧云天公司。 miR-433 mimic、anti-miR-433及各自的陰性對照物(miR-NC和anti-miR-NC)、JNK1過表達質(zhì)粒及其陰性對照均來自上海GeneChem公司。

    1.3方法

    1.3.1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HTR-8/SVneo細胞采用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基置于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。細胞轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 3000試劑說明書進行操作,具體方法如下:將處于對數(shù)生長期的細胞進行消化,將消化后的細胞接種于6孔板內(nèi),使細胞融合度為60%左右,將細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換新鮮培養(yǎng)基,加入目的質(zhì)粒2.5微克/孔,加入轉(zhuǎn)染試劑4.5 μL,“十”字法混勻后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后,處理細胞進行進一步試驗。

    1.3.2qRT-PCR 使用Trizol試劑(美國Thermo公司)根據(jù)試劑操作說明提取細胞和組織總RNA。采用NanoDrop 2000(美國Thermo公司)對提取的RNA進行定量。通過Semi qRT-PCR來定量miRNA。每一次Semi qRT-PCR反應(yīng)使用1 μg總RNA。將miR-433的表達正常化為U6表達作為內(nèi)源性調(diào)控。采用qRT-PCR檢測JNK1表達,選擇GAPDH作為內(nèi)參基因。qRT-PCR反應(yīng)條件和體系參照SYBR試劑盒說明書進行。引物序列見表1。

    表1 引物序列

    1.3.3劃痕試驗 采用劃痕試驗測定細胞遷移能力。方法如下:將處于對數(shù)生長期的細胞用0.25%胰酶進行消化,用RPMI-1640完全培養(yǎng)基進行重懸,取1×105個細胞接種于12孔板中,將12孔板放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達到90%左右,用200 μL Tip在孔內(nèi)劃3條直線,用PBS吸取刮下來的細胞,更換RPMI-1640無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別在0和24 h采用顯微鏡進行拍照,記錄創(chuàng)面的寬度,計算細胞遷移距離。

    1.3.4遷移侵襲試驗 將轉(zhuǎn)染后的HTr-8/SVneo細胞用胰酶進行消化,PBS洗滌,采用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基將細胞重懸后,計數(shù),調(diào)整細胞濃度。將Transwell小室(遷移侵襲試驗需用基質(zhì)膠將小室進行包被),插入24孔板內(nèi),在小室上室內(nèi)加入1×104個細胞(遷移侵襲試驗細胞數(shù)為2×104)。在下室內(nèi)加入500 μL含10%胎牛血清的LRPMI-1640完全培養(yǎng)基。在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)24 h后,取出小室,用棉簽將附著在膜上方的細胞去除。將膜下方的細胞采用甲醇固定20 min,之后用0.1%結(jié)晶紫染色10~15 min,采用光學顯微鏡(DMI6000 B顯微鏡)對染色的細胞進行拍照,計數(shù)每個視野內(nèi)的細胞數(shù)。

    1.3.5Western blot 采用RIPA試劑裂解細胞,收集細胞總蛋白。30 μg蛋白通過12%SDS凝膠電泳分離,然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶在Tris緩沖鹽溶液中室溫封閉1 h,洗滌后用兔抗人JNK1抗體(1∶2 000稀釋)、GAPDH抗體(1∶2 000稀釋)在4 ℃孵育過夜。洗滌后用帶有相應(yīng)的辣根過氧化物酶標記兔二抗(1∶8 000稀釋)在室溫下避光孵育2 h。采用增強化學發(fā)光系統(tǒng)(美國Thermo公司)檢測蛋白印跡。

    1.3.6雙熒光素酶報告基因試驗 為了研究miR-433抑制滋養(yǎng)層細胞侵襲和遷移的機制,筆者利用TargetScan和miRanda來預(yù)測miR-433的直接靶基因并選擇JNK1作為miR-433的候選靶基因進行進一步評估。在pmirGLO載體的SacI/XboI限制性位點之間插入帶有miR-433結(jié)合位點的JNK1的3′-UTR構(gòu)建質(zhì)粒pmirGLO-WT-JNK1。通過去除miR-433的結(jié)合位點構(gòu)建pmirGLO-MUT-JNK1質(zhì)粒。使用lipo3000將pmirGLO-WT-JNK1/pmirGLO-MUT-JNK1和miR-433 mimic或miR-NC共轉(zhuǎn)染到293T細胞中。轉(zhuǎn)染36 h后,使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)(美國Promega公司)檢測熒光素酶活性。

    2 結(jié) 果

    2.1miR-433在PE患者胎盤組織中的表達情況 與正常胎盤組織比較,PE患者胎盤組織內(nèi)miR-433表達明顯上調(diào),見圖1。此外,在HTR-8/SVneo、JAR和JEG-3 3種滋養(yǎng)層細胞株中,miR-433在JAR細胞中表達最高,在HTR-8/SVneo細胞中表達最低,見圖2。隨后采用劃痕試驗檢測了上述3種滋養(yǎng)層細胞的遷移能力,發(fā)現(xiàn)miR-433表達最高的JAR細胞的遷移能力最弱,明顯低于miR-433表達最低的HTR-8/SVneo細胞,見圖3。

    注:與正常胎盤組織比較,aP<0.01。

    注:與JAR細胞比較,aP<0.05;與JEG-3細胞比較,bP<0.05。

    注:與JAR細胞比較,aP<0.05;與JEG-3細胞比較,bP<0.05。

    2.2miR-433抑制HTR-8/SVneo細胞的遷移和侵襲能力 通過使用miR-433 mimic和anti-miR-433轉(zhuǎn)染細胞來干擾miR-433的表達進而評估m(xù)iR-433對HTR-8/SVneo細胞遷移和侵襲能力的影響。與轉(zhuǎn)染陰性對照細胞(miR-NC)相比,轉(zhuǎn)染miR-433 mimic后,通過Transwell孔的細胞數(shù)量明顯減少,表明miR-433過表達后細胞遷移和侵襲能力降低,見圖4、5。除此之外,與陰性對照細胞(anti-miR-NC)相比,轉(zhuǎn)染anti-miR-433后,通過Transwell孔的細胞數(shù)量明顯增多,表明抑制miR-433表達后細胞遷移和侵襲能力增加,見圖6、7。

    注:A、B為分別轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-433 mimic后HTR-8/SVneo細胞的遷移情況;C、D為分別轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-433 mimic后HTR-8/SVneo細胞的侵襲情況。

    注:與miR-NC比較,aP<0.05。

    注:A、B為分別轉(zhuǎn)染anti-miR-NC和anti-miR-433后HTR-8/SVneo細胞的遷移情況;C、D為分別轉(zhuǎn)染anti-miR-NC和anti-miR-433后HTR-8/SVneo細胞的侵襲情況。

    注:與anti-miR-NC比較,aP<0.05。

    2.3JNK1為miR-433的下游靶基因 結(jié)果顯示,與miR-433共轉(zhuǎn)染后,熒光素酶相對活性明顯下降,說明miR-433直接抑制JNK1,見圖8、9。此外,通過Western blot檢測miR-433對JNK1表達的影響,結(jié)果表明,miR-433轉(zhuǎn)染明顯抑制了HTR-8/SVneo細胞中JNK1蛋白的相對表達水平,見圖10。

    圖8 JNK1 mRNA與miR-433相互作用的野生型(WT)和突變型(MUT)3′-UTR序列

    注:與miR-NC比較,aP<0.05。

    圖10 轉(zhuǎn)染miR-433 mimic或miR-NC的HTR-8/SVneo細胞中JNK1蛋白相對表達水平

    2.4miR-433通過抑制JNK1的表達影響HTR-8/SVneo細胞的遷移和侵襲能力 為了進一步驗證miR-433通過JNK1影響滋養(yǎng)層細胞的遷移和侵襲能力,筆者將miR-433 mimic和JNK1共轉(zhuǎn)染至HTR-8/SVneo細胞,采用Transwell遷移侵襲試驗檢測在過表達miR-433的細胞中重新表達JNK1對細胞遷移侵襲能力的影響,結(jié)果顯示,過表達JNK1能逆轉(zhuǎn)miR-433對HTR-8/SVneo細胞遷移和侵襲能力的抑制作用(P<0.001),見圖11、12、13。以上結(jié)果表明,miR-433通過抑制JNK1的表達影響HTR-8/SVneo細胞的遷移和侵襲能力。

    注:A、B、C為分別轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-433 mimic、miR-433 mimic+JNK1后HTR-8/SVneo細胞的遷移情況;D、E、F為分別轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-433 mimic、miR-433 mimic+JNK1后HTR-8/SVneo細胞的侵襲情況。

    注:A為遷移細胞數(shù)情況,B為侵襲細胞數(shù)情況;與miR-433比較,aP<0.05。

    圖13 miR-NC、miR-433 mimic及miR-433 mimic+JNK1單獨或共轉(zhuǎn)染至HTR-8/SVneo細胞中JNK1蛋白相對表達水平

    3 討 論

    PE的發(fā)病機制很復(fù)雜,多種因素影響PE的發(fā)生[10-11]。研究發(fā)現(xiàn),人滋養(yǎng)層細胞的異常增殖和侵襲在PE的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[12-14]。因此,研究滋養(yǎng)層細胞增殖和侵襲的機制,為治療PE尋找新的有效的分子靶點具有重要意義。越來越多的研究表明,PE患者胎盤組織中mi-RNA表達存在異常[15-18]。PE患者胎盤組織中表達異常的mi-RNA及其靶基因的鑒定為研究PE的發(fā)生提供了基礎(chǔ)[19]。本研究發(fā)現(xiàn),PE患者胎盤miR-433表達上調(diào),且JNK1被確定為miR-433的下游靶基因,miR-433的上調(diào)通過靶向JNK1抑制滋養(yǎng)層細胞的遷移與侵襲,參與PE的發(fā)生、發(fā)展。

    前期研究發(fā)現(xiàn),miR-433在多種疾病中發(fā)揮重要作用,且miR-433影響多種腫瘤細胞的遷移和侵襲[20-24]。因此筆者猜想它可能影響PE的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在PE患者胎盤組織中,miR-433明顯高表達。同時,在滋養(yǎng)層細胞內(nèi),抑制miR-433的表達可促進細胞的遷移和侵襲,而過表達miR-433可抑制細胞遷移和侵襲。為了探究miR-433影響細胞遷移侵襲的機制,筆者采用生物信息學分析和雙熒光素酶報告基因試驗發(fā)現(xiàn),JNK1為miR-433的下游靶基因,過表達的miR-433可抑制JNK1的表達。這與miR-433在腫瘤組織中的研究存在差異[23]??赡艿脑蚴莔iR-433通過不同靶點在不同疾病中發(fā)揮不同作用。如在非小細胞肺癌組織和細胞中,miR-433表達下調(diào),并通過降低基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2/金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)-2和MMP-9的表達而抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲[20-25]。在乳腺癌中miR-433通過靶向MAPK信號通路抑制乳腺癌細胞生長[26]。在食管鱗狀上皮細胞癌中,miR-433通過靶向GRB2抑制食管鱗癌細胞的增殖和侵襲[27]。此外,TAO等[28]發(fā)現(xiàn),在心臟纖維化的心臟病模型中,miR-433明顯高表達,在新生大鼠心肌成纖維細胞中過表達miR-433可以促進細胞增殖并向肌成纖維細胞分化。值得注意的是,由于miR-433存在多個靶點,并不局限于JNK1,因此,筆者還需要進一步研究其他潛在的靶基因,以進一步研究miR-433在PE發(fā)生過程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

    此外,筆者還研究了miR-433是否通過下調(diào)JNK1在HTR-8/SVneo細胞中發(fā)揮作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),JNK1的過表達部分逆轉(zhuǎn)了miR-433對滋養(yǎng)層細胞遷移和侵襲的抑制作用。總的來說,目前的數(shù)據(jù)表明miR-433通過靶向JNK1參與了PE的發(fā)生,這表明miR-433/JNK1通路可能是PE治療的一個新靶點。此外,SAUL等[29]發(fā)現(xiàn),在重度PE患者中,妊娠早期母體血清中miR-433表達上調(diào)。因此,未來可以進一步探究miR-433在母體血清中的表達情況。

    綜上所述,本研究結(jié)果提示,miR-433在PE患者胎盤組織中高表達,miR-433可能通過靶向JNK1抑制滋養(yǎng)層細胞的遷移和侵襲,參與PE的發(fā)生、發(fā)展。因此,靶向調(diào)節(jié)miR-433/JNK1通路的治療方法可能可以改善PE的治療。

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