突變和修飾β淀粉樣蛋白與阿爾茨海默病

郝秀萍 武林芝

（太原學(xué)院材料與化學(xué)工程系，太原 030032）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是癡呆癥的主要類型，是一種漸進(jìn)性腦部疾病，它逐漸破壞人的記憶和思維能力，最終導(dǎo)致日常行為能力的喪失。在影響病人生活質(zhì)量的同時(shí)，還帶來(lái)源源不斷的社會(huì)問(wèn)題，是目前最受關(guān)注的神經(jīng)和精神疾病之一［1］。AD 的兩大病理特征包括由tau 蛋白形成的細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)和由β 淀粉樣蛋白（Aβ）形成的細(xì)胞外老年斑［2?3］。人們認(rèn)為Aβ的錯(cuò)誤積累在AD 的病理學(xué)中起著核心作用［4］。以Aβ為靶標(biāo)的療法主要針對(duì)的是單體或寡聚體的Aβ40和Aβ42，但以Aβ40 和Aβ42 為靶標(biāo)的臨床治療結(jié)果并不理想，人們對(duì)此進(jìn)行了分析并提出了多靶標(biāo)策略［5］。淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）的水解加工過(guò)程會(huì)產(chǎn)生一系列不同長(zhǎng)度的截短Aβ種類。此外，Aβ肽還會(huì)受到廣泛的翻譯后修飾。雖然大多數(shù)AD病例是散發(fā)性的，但已經(jīng)確定了許多家族性阿爾茨海默病（familial AD）和相關(guān)的腦淀粉樣血管病會(huì)導(dǎo)致AD 的早發(fā)和嚴(yán)重程度的增加，許多FAD的Aβ會(huì)發(fā)生單個(gè)氨基酸突變。大量的研究表明，這些突變Aβ、截短Aβ、被修飾的Aβ會(huì)加快聚集動(dòng)力學(xué)，改變聚集體構(gòu)象，并具有更高的細(xì)胞毒性。這些Aβ 種類可能破壞了腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)并加速了AD神經(jīng)變性。我們調(diào)查了大量的文獻(xiàn)，對(duì)這些Aβ 種類的聚集特性及在AD發(fā)展過(guò)程中可能產(chǎn)生的影響進(jìn)行分類總結(jié)，并評(píng)述了檢測(cè)分析這些Aβ種類的方法。

1 Aβ變體

大多數(shù)AD 病例是散發(fā)的，但一小部分稱為FAD 的AD 病例與早老素1、早老素2 或APP 的突變有關(guān)。根據(jù)這些FAD 首次發(fā)現(xiàn)的地域，分別命名為英國(guó)型（English，H6R）、日本鳥(niǎo)取型（Tottori，D7N）、佛蘭德型（Flemish，A21G）、大阪型（Osaka，E22Δ）、荷蘭型（Dutch，E22Q）、意大利型（Italian，E22K）、北極型（Arctic，E22G）、愛(ài)荷華型（Iowa，D23N）、皮爾蒙特型（Piedmont，L34V）等。位于淀粉樣蛋白序列內(nèi)部的APP 突變會(huì)導(dǎo)致多種疾病表型，包括早發(fā)性癡呆、腦淀粉樣血管病、出血性中風(fēng)等。這些氨基酸取代改變了Aβ 的產(chǎn)生量，增加了Aβ42 與Aβ40 的比率，改變了突變Aβ 變體的聚集潛力，有的還促進(jìn)了有毒聚集體的形成。表1 列出了不同Aβ 突變體肽的聚集特性及其影響。

1.1 突變Aβ肽的影響及相應(yīng)臨床表現(xiàn)

A2T突變是一種保護(hù)性的突變，A2T突變能減少β 分泌酶1（BACE1）對(duì)APP的裂解。體外研究表明，它使淀粉樣蛋白聚集物的形成減少約40%，可以預(yù)防AD 和老年人的認(rèn)知能力下降［6］，但Aβ 42A2T 肽的體外細(xì)胞毒性高于野生型Aβ42，并且在聚集的早期與模型膜相互作用［7］。A2V 變異在純合子個(gè)體中是致病的，雜合子的親屬?zèng)]有受到影響，隱性A2V 突變能增加Aβ 的產(chǎn)生［8］，A2V Aβ的沉積物很大，主要存在血管周圍，在影響小腦的同時(shí)會(huì)減少新紋狀體［9］。English（H6R）Aβ 的細(xì)胞毒性更強(qiáng)［10］，H6R 突變導(dǎo)致His6 結(jié)構(gòu)域不能參與鋅離子的鰲合，而由（EVHH14）?E?11 片段配位的鋅離子能促進(jìn)其形成穩(wěn)定的二聚體［11］。

人們?cè)谝粋€(gè)可能患AD的日本家系中，發(fā)現(xiàn)了D7N錯(cuò)義突變［12］。Aβ D7N突變?cè)鰪?qiáng)了寡聚體的細(xì)胞毒性［10］。Chen等［13］在一個(gè)具有早發(fā)性AD的臺(tái)灣家庭中，鑒別出了位于Aβ 序列內(nèi)的新型APP 突變——D7H，這種突變?cè)黾恿薃β 的產(chǎn)生，提高了Aβ42/Aβ40 的比率，具有更高的神經(jīng)毒性。由于D7H 突變型Aβ 具有一個(gè)額外的金屬離子配位殘基組氨酸，它與Zn2+/Cu2+具有更高的親和力，這可能促使Aβ D7H 具有高致病性。BACE1 酶是Aβ 產(chǎn)生過(guò)程中一種非常重要的切割酶，它有兩個(gè)切割位點(diǎn)，β 位點(diǎn)（1 號(hào)位點(diǎn)）和β′位點(diǎn)（11 號(hào)位點(diǎn)），E11K 突變使得BACE1 切割位點(diǎn)移向了β 位，導(dǎo)致Aβ40 和Aβ42 的水平含量增加了2～3 倍，Aβ42/Aβ 40的比率也略微升高。

APP 687 位的賴氨酸?天冬酰胺取代（根據(jù)Aβ編號(hào)稱為K16N），導(dǎo)致早期具有常染色體顯性遺傳模式的癡呆。K16N突變位于α分泌酶切割位點(diǎn)，使得APP 的分泌受到影響，產(chǎn)生了更多的Aβ 肽。帶有K16N 突變的Aβ 肽的獨(dú)特之處在于該肽本身對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞無(wú)害，然而野生型和突變體肽的等摩爾混合物則顯示出很強(qiáng)的毒性。此外，Aβ42 K16N抑制野生型Aβ42 原纖維的形成。Aβ42 K16N 不易被主要的Aβ降解酶腦啡肽酶清除［14］。

Flemish（AβA21G）AD 是在一個(gè)具有早老性癡呆和腦淀粉樣血管病引起的腦出血家族中發(fā)現(xiàn)的遺傳突變類型［15］。與其他以腦Aβ42為主的FAD病例相反，F(xiàn)lemish AD 病人主要沉積Aβ40，而且大腦中的老年斑主要集中在血管上。Yagi?Utsumi 和Dobson［16］的研究表明，A21G突變改變了Aβ40形成淀粉樣蛋白原纖維的初始成核過(guò)程，從而影響了Aβ 的膜結(jié)合特性。Aβ A21G 肽被腦啡肽酶降解的速度明顯比野生型Aβ 或任何其他突變體肽慢［17］。Aβ42 A21G 和Aβ42 野生型都能誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，特別是N 端截短肽毒性更強(qiáng)［18］，但Wang等［19］對(duì)Aβ42 A21G的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，從細(xì)胞形態(tài)、生存力或細(xì)胞增殖來(lái)判斷，Aβ A21G 和Aβ野生型對(duì)兩種類型的平滑肌細(xì)胞均未引起明顯的毒性。

在一個(gè)患有癡呆癥及AD的日本家系中確定了Aβ E22?，即缺少22 號(hào)谷氨酸的變體Aβ［20］。該突變顯著降低了總Aβ的分泌，但變體Aβ對(duì)蛋白質(zhì)水解的抵抗力更高，并且比野生型Aβ 更有效地抑制大鼠海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)。與無(wú)毒Aβ40 野生型相比，Aβ40 E22Δ在大鼠原代神經(jīng)元培養(yǎng)物中具有神經(jīng)毒性，而Aβ42 E22Δ 的毒性低于Aβ42 野生型，但在神經(jīng)元原代培養(yǎng)物中，每個(gè)細(xì)胞的神經(jīng)突生長(zhǎng)明顯減少［21］。E22G 是在患有AD 的瑞典家庭中發(fā)現(xiàn)的突變類型，這種突變的攜帶者顯示血漿中Aβ42 和Aβ40水平降低［22］，聚集過(guò)程早期形成的中間物會(huì)從神經(jīng)突開(kāi)始引發(fā)細(xì)胞功能障礙，從而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，并引起中度的神經(jīng)膠質(zhì)和炎癥組織反應(yīng)［23?24］。Aβ E22G 突變使其對(duì)腦啡肽酶具有抵抗力，因此，Aβ E22G 不僅可以通過(guò)促進(jìn)原纖維形成，而且可以通過(guò)延長(zhǎng)Aβ 在大腦中的半衰期來(lái)致?。?5］。Bugiani 等［26］對(duì)患有淀粉樣變性與Aβ E22K 突變相關(guān)的遺傳性腦出血患者的臨床研究顯示，受影響的個(gè)體表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的頭痛和多發(fā)性中風(fēng)，大多數(shù)患者隨后出現(xiàn)癲癇和認(rèn)知能力下降。Aβ E22K 突變使其對(duì)腦啡肽酶也具有抵抗力［25］。在患有淀粉樣變性的遺傳性腦出血的荷蘭患者，即淀粉樣變性?荷蘭型（HCHWA?D）中，Aβ 22 位的氨基酸發(fā)生谷氨酰胺（Q）取代谷氨酸（E），導(dǎo)致了Aβ 在這些患者的腦血管壁中沉積，從而導(dǎo)致腦出血和過(guò)早死亡［27］。Aβ E22Q 對(duì)腦啡肽酶也具有抵抗力［25］，Aβ40 E22Q 會(huì)在培養(yǎng)的人腦血管平滑肌細(xì)胞中誘導(dǎo)強(qiáng)大的病理反應(yīng)，包括提高APP 水平和細(xì)胞死亡［28］。在APP Dutch小鼠和HCHWA?D人腦中，Aβ40與Aβ42的比率顯著高于APP野生型小鼠或AD 人腦中的比率［29］。野生型Aβ 容易從腦中轉(zhuǎn)運(yùn)到血漿中，但荷蘭型突變體Aβ 不容易清除出去，這可能導(dǎo)致其在腦血管系統(tǒng)中的大量積累［30］。另外，Aβ E22Q 刺激基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP?2）的表達(dá)和激活，而MMP?2 的表達(dá)和激活增加可能會(huì)導(dǎo)致人腦血管平滑?。℉CSM）細(xì)胞因致病性Aβ而死亡［31］。

Grabowski 等［32］報(bào)告了愛(ài)荷華州三代家庭中APP 的一個(gè)新突變位點(diǎn)，694 位（對(duì)應(yīng)于Aβ 的23號(hào)）天冬氨酸被天冬酰胺取代（D23N），是常染色體顯性癡呆?；颊甙橛羞M(jìn)行性失語(yǔ)性癡呆，白質(zhì)腦病和枕骨鈣化，神經(jīng)病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的腦淀粉樣血管病，廣泛的神經(jīng)原纖維纏結(jié)和斑塊中Aβ40的異常分布。研究表明，D23N突變顯著增加了神經(jīng)元和內(nèi)皮細(xì)胞的肽毒性［33］。

Obici等［34］報(bào)道了一個(gè)常染色體顯性遺傳、復(fù)發(fā)性腦出血的家庭中Aβ 序列內(nèi)的新型突變（L34V），病理檢查發(fā)現(xiàn)該突變導(dǎo)致了嚴(yán)重的腦淀粉樣血管病，但沒(méi)有實(shí)質(zhì)性淀粉樣斑塊或神經(jīng)原纖維纏結(jié)。L34V Aβ形成的寡聚體或原纖維能誘導(dǎo)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞凋亡［35］。

Table 1 A compilation of aggregation characteristics and effects of amyloid β mutant peptides表1 β淀粉樣蛋白突變體肽的聚集特性及其影響

1.2 突變Aβ肽的聚集特性

A2T 突變是一種保護(hù)性的突變，能夠延遲Aβ肽的聚集［36］，顯著改變?chǔ)?發(fā)夾的量并打破其轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌Y(jié)構(gòu)的平衡［7］，而A2V突變會(huì)加速Aβ肽的聚集，使其更快地演變?yōu)棣?折疊構(gòu)象［7，36］。H6R突變能在淀粉樣原纖維形成的延伸階段促進(jìn)原纖維的形成［37］，H6R突變Aβ加快了聚集動(dòng)力學(xué)，使得Aβ 的二級(jí)結(jié)構(gòu)更快地由無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)棣抡郫B結(jié)構(gòu)，并生成尺寸更大的寡聚體，這些寡聚體具有有效的成核能力。D7N 突變體能在淀粉樣原纖維形成的延伸階段促進(jìn)原纖維的形成［37］，并且具有更高的成核效率［38］。E11K Aβ與野生型Aβ的聚集動(dòng)力學(xué)、聚集體形態(tài)及細(xì)胞毒性未見(jiàn)明顯差異［39］。

A21G 突變可以增加Aβ 的分泌，并改變其結(jié)構(gòu)［40］，促進(jìn)富含β 折疊的淀粉樣蛋白原纖維形成過(guò)程中各種二級(jí)結(jié)構(gòu)之間的相互轉(zhuǎn)化［41］。Betts等［17］的研究表明，A21G 突變降低了原纖維的延伸速率。E22?Aβ表現(xiàn)出增強(qiáng)的寡聚特性但沒(méi)有原纖維化的聚集特性［20］，Inayathullah 和Teplow［42］對(duì)E22Δ Aβ40和E22Δ Aβ42的研究結(jié)果闡明了這些突變體肽的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)、原纖維形成動(dòng)力學(xué)、原纖維形態(tài)和原纖維穩(wěn)定性，表明兩種E22Δ Aβ肽均具有異常的β折疊形成傾向，能更快地形成寡聚體和原纖維，并且原纖維的穩(wěn)定性有所增加。此外，E22Δ Aβ42 低聚物似乎與野生型Aβ42 低聚物的大小、形狀均不同［43］。E22Δ Aβ40 具有成核能力，誘導(dǎo)野生型Aβ40 形成原纖維，這些原纖維比同源接種的Aβ40 原纖維的穩(wěn)定性差，但是，E22Δ Aβ 42 對(duì)野生型Aβ 具有很弱的成核能力［44?45］。E22G Aβ 形成原纖維的速率和數(shù)量都比野生型Aβ 高得多［22］。體外聚集實(shí)驗(yàn)表明，野生型和E22K Aβ 均形成了以交叉β結(jié)構(gòu)為特征的原纖維，但具有明顯不同的β折疊結(jié)構(gòu)，與野生型原纖維的平行β折疊結(jié)構(gòu)相比，E22K Aβ42低聚物和原纖維均顯示出反向平行的β 折疊結(jié)構(gòu)［47］。分子動(dòng)力學(xué)模擬研究表明，E22Q Aβ 比野生型Aβ 聚集更快［46］。D23N Aβ 40 形成原纖維的速度比野生型快得多，電子顯微鏡顯示，D23N Aβ40 形成具有多種形態(tài)的原纖維，并且大多數(shù)原纖維呈反平行β折疊結(jié)構(gòu)［48?49］。

2 Aβ修飾肽

根據(jù)淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō)，Aβ 的聚集在AD的發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用。在FAD患者中，Aβ 的聚集是由遺傳突變引起的，但是大約90%的AD患者是散發(fā)性的，什么原因?qū)е铝松l(fā)性AD患者中Aβ 的聚集，目前還不明確。對(duì)老年斑組成的分析表明，聚集的Aβ 以不同的方式被修飾，主要是通過(guò)Aβ 的截短和后修飾，其中，截短肽包括從氨基酸殘基A2 和焦谷氨?；疎3、F4、R5、H6、焦谷氨?；疎11 開(kāi)始的N 端截短肽，以及長(zhǎng)度為16、24、34、37～43的C端截短肽。我們之前的研究總結(jié)了Aβ 截短肽的生理和病理特性［50］。Aβ 的修飾主要包括焦谷氨酸化、天冬氨酸異構(gòu)化、氧化、磷酸化、硝化、瓜氨酸化等。過(guò)多的修飾表現(xiàn)出致病特征，如聚集增加、神經(jīng)毒性增加、抑制海馬體長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的能力等。表2 列出了不同Aβ 修飾肽的聚集特性及其影響。

2.1 Aβ修飾肽的產(chǎn)生與鑒定

從3 號(hào)或11 號(hào)谷氨酸開(kāi)頭的N 端截短Aβ 肽容易發(fā)生焦谷氨酸化。從AD患者的神經(jīng)斑和腦血管壁中，純化并定量了以焦谷氨?；ˋβ pE3）形式從E3 殘基開(kāi)始的Aβ 肽，N 端截短的Aβ pE3 占神經(jīng)斑塊中Aβ 的51%［51?52］。Sullivan 等［53］使用特異性抗體在老年癡呆癥大腦皮層的老年斑中識(shí)別到了Aβ pE3和Aβ pE11，并且Aβ pE11是最內(nèi)層核心的主要形式。蛋白質(zhì)或肽中天冬氨酸和天冬酰胺的異構(gòu)化通過(guò)在生理?xiàng)l件下經(jīng)由琥珀酰亞胺作為中間體的非酶促反應(yīng)產(chǎn)生L?異天冬氨酸。已經(jīng)在體內(nèi)多種胞內(nèi)蛋白以及神經(jīng)退行性腦組織中病理沉積的蛋白中鑒定出了異天冬氨酸［54?55］。在7 位或23 位異構(gòu)化的Aβ 肽差異性地沉積在AD 大腦的老年斑和血管淀粉樣蛋白中。氧化應(yīng)激和淀粉樣斑塊的形成是AD 的兩個(gè)關(guān)鍵標(biāo)志。Aβ 中35 位的一部分甲硫氨酸（Met）在AD 大腦斑塊中被氧化成甲硫氨酸亞砜（Met（OX））。在AD 大腦中發(fā)現(xiàn)了磷酸化淀粉樣蛋白，使用反義肽方法，確定了人類細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK?1）負(fù)責(zé)Aβ 的磷酸化［56］。細(xì)胞外的Aβ在細(xì)胞表面和人腦的腦脊液中被蛋白激酶磷酸化。Kumar 等［57］開(kāi)發(fā)了新的抗體來(lái)根據(jù)S26 的磷酸化狀態(tài)特異性區(qū)分Aβ 肽，利用新抗體，在神經(jīng)元內(nèi)和腦血管中發(fā)現(xiàn)大量的磷酸化Aβ。AD 的部分炎癥反應(yīng)是誘導(dǎo)型一氧化氮合酶NOS 的上調(diào)，導(dǎo)致NO 產(chǎn)生增加，NO 通過(guò)誘導(dǎo)翻譯后蛋白質(zhì)修飾促進(jìn)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。在病理?xiàng)l件下，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)變?yōu)檫^(guò)氧亞硝酸鹽和二氧化氮等副產(chǎn)物形成蛋白質(zhì)酪氨酸硝化作用。Aβ 是NO靶標(biāo)之一，其在Y10 處被硝化［58］。瓜氨酸化和脫酰胺是衰老相關(guān)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在中性pH值下會(huì)增加Aβ 上的負(fù)電荷數(shù)量［59］。在AD 大腦所有已識(shí)別的蛋白質(zhì)翻譯后修飾類型中，乙?；瘍H影響總修飾肽的約10%，但乙?；腁β和tau聚集體水平增加最高［60］。Aβ 肽有兩個(gè)潛在的乙?；稽c(diǎn)，K16和K28。

2.2 Aβ修飾肽的聚集特性

含焦谷氨酰的肽比相應(yīng)的全長(zhǎng)Aβ 肽更容易形成β折疊結(jié)構(gòu)，并且更穩(wěn)定，聚集傾向更高，誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性更強(qiáng)［61?62］。體外實(shí)驗(yàn)表明，23 位的異構(gòu)化修飾大大增強(qiáng)了Aβ的聚集。23位的自發(fā)異構(gòu)化誘導(dǎo)Aβ發(fā)生構(gòu)象變化形成β轉(zhuǎn)角，β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)在Aβ 肽的聚集和神經(jīng)毒性中起著至關(guān)重要的作用［63?64］。Met35側(cè)鏈氧化成Met35（OX）顯著阻礙了生理pH下Aβ42的原纖維形成的速率，減少了兩種主要形式的Aβ 產(chǎn)生的纖維總量，Met35（OX）還可以改變Aβ原纖維的形態(tài)并阻止原纖維的形成。甲硫氨酸氧化的Aβ40和Aβ42的纖維形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，纖維長(zhǎng)度明顯減少［65］。也有研究顯示Met（OX）的存在減少了Aβ40 纖維形成的滯后時(shí)間，但延長(zhǎng)了Aβ42 的滯后時(shí)間［66］。8 號(hào)絲氨酸殘基的磷酸化促進(jìn)了寡聚Aβ 組裝體的形成［67］。Jamasbi 等［68］研究了磷酸化Aβ42 合成肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)、聚集特性以及與初級(jí)皮層神經(jīng)元質(zhì)膜的相互作用，結(jié)果表明在合成脂質(zhì)環(huán)境中，磷酸化Aβ42 增加了β 折疊形成，能快速形成聚集體。Aβ 的硝化加速了其聚集，并在APP/PS1 小鼠和AD 大腦的Aβ 斑塊核心中檢測(cè)到硝化Aβ［58］。也有研究表明，酪氨酸硝化顯著降低了Aβ40的聚集［69］。這種積極作用可能是由于在生理pH 值下硝化引起帶負(fù)電荷的Y10 與E11 和H6 或H13 之間的鹽橋相互作用并阻斷Y10 周圍的扭結(jié)，從而防止Aβ 纖維化和聚集［70］。Osaki等［59］研究了瓜氨酸化和脫酰胺對(duì)Aβ纖維化特性的影響，結(jié)果表明Aβ40 的R5→Cit 修飾不影響原纖維化率，并形成與Aβ40 原纖維不同的β折疊結(jié)構(gòu)。Aβ40的N27→D修飾阻礙了原纖維化并誘導(dǎo)了反平行β 折疊聚集體的形成。具有R5→Cit修飾的Aβ42在水性介質(zhì)中的溶解度增加，其原纖維形成速度比Aβ42 慢，但沒(méi)有改變?cè)w維的平行β折疊結(jié)構(gòu)。帶有N27→D修飾的Aβ42部分形成了包含平行β折疊結(jié)構(gòu)的原纖維。K28的乙?；↘28Ac）減慢了Aβ42原纖維化速率但不影響原纖維形態(tài)。另一方面，K16 殘基的乙?；↘16Ac）大大降低了Aβ42 肽的原纖維化特性，也影響了其毒性［71］。

2.3 Aβ修飾肽的影響

Aβ pE3 的存在具有重要的結(jié)構(gòu)意義，因?yàn)樗绕渌问降腁β更具疏水性，因此增加了Aβ的不溶性。此外，Aβ pE3 的N 端受普通氨基肽酶作用的阻斷，可能導(dǎo)致Aβ 在AD 的神經(jīng)斑塊中大量積累。Aβ pE3的細(xì)胞毒性更強(qiáng)，AβpE3?42對(duì)Aβ42原纖維的形成具有抑制作用，與其已知的更大感染力相一致［72］。Youssef 等［73］進(jìn)行的小鼠實(shí)驗(yàn)表明，Aβ pE3?42 可以介導(dǎo)在臨床前AD 階段發(fā)生的神經(jīng)退行性過(guò)程和隨后的認(rèn)知改變。Met35的氧化態(tài)會(huì)影響先前存在的淀粉樣蛋白原纖維和噬斑的穩(wěn)定性，導(dǎo)致細(xì)絲、原纖維和成熟原纖維的形態(tài)發(fā)生變化［74］。與未氧化肽的神經(jīng)毒性相反，氧化的Aβ在皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)物中完全缺乏神經(jīng)毒性作用［75］，這可能是由于氧化態(tài)的Aβ 增強(qiáng)了甲硫氨酸亞砜還原酶A 型（MsrA）基因的表達(dá)和功能來(lái)減少活性氧ROS 的生成［76］。磷酸化的Aβ 肽顯示出增加的神經(jīng)毒性和降低的形成剛果紅陽(yáng)性原纖維的能力［55］。在轉(zhuǎn)基因小鼠和AD 患者大腦中檢測(cè)到磷酸化Aβ，在果蠅模型中，磷酸化Aβ顯示出更高的毒性［67］。Aβ 的磷酸化可以在Aβ 代謝中發(fā)揮雙重作用，一方面它降低了其蛋白水解清除率，另一方面促進(jìn)了其聚集［77］。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證實(shí)野生型Aβ 40比Aβ40Y10（3N）T更具細(xì)胞毒性［69］。對(duì)Aβ42的研究也表明Y10 的硝化可能會(huì)阻止Aβ42 的π?π堆積相互作用，從而抑制其聚集和神經(jīng)毒性［78］。Zhao 等［79］還研究了Aβ42 硝化與有毒Cu（II）的相互作用，結(jié)果表明盡管硝化沒(méi)有改變Aβ42與Cu（II）的結(jié)合或Aβ42?Cu（II）復(fù)合物的過(guò)氧化活性，但硝化改善了Cu（II）誘導(dǎo)的Aβ42 聚集和神經(jīng)毒性。與單獨(dú)的野生型或K28Ac肽聚集體相比，K16Ac 和雙乙酰化（KKAc）肽聚集體顯示出更高的細(xì)胞毒性。然而，野生型和乙?；疉β42 肽聚集體的異質(zhì)混合物表現(xiàn)出更高的自由基形成和細(xì)胞毒性［71］。

3 Aβ變體的檢測(cè)

近年來(lái)，關(guān)于Aβ 的分析檢測(cè)方法研究取得了諸多進(jìn)展，研究者從不同的角度對(duì)其進(jìn)行了評(píng)述［80?82］。由于Aβ40 和Aβ42 是人體內(nèi)Aβ 的主要存在形式，目前建立發(fā)展的檢測(cè)分析方法主要針對(duì)單體狀態(tài)或聚集狀態(tài)下的Aβ40 和Aβ42，關(guān)于Aβ 變體的檢測(cè)方法報(bào)道的比較少。隨著人們對(duì)AD病理特征的深入研究，發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的Aβ 變體起著重要作用，可作為AD 的生物標(biāo)志物。針對(duì)這些Aβ 變體，開(kāi)發(fā)出了一些分析檢測(cè)方法，包括常見(jiàn)的質(zhì)譜法、免疫學(xué)法和電化學(xué)法等。

3.1 質(zhì)譜法（MS）

質(zhì)譜法因其準(zhǔn)確度和精密度而成為一種可靠的檢測(cè)Aβ 方式。由于Aβ 的疏水性、高分子質(zhì)量（>4 ku）和低豐度，使用傳統(tǒng)MS 方法（尤其是在血漿中）對(duì)Aβ 進(jìn)行定量仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，因此，對(duì)Aβ 的質(zhì)譜分析通常與其他分析處理方法如免疫沉淀（IP）法、固相萃?。⊿PE）法、毛細(xì)管等電聚焦（CIEF）法等結(jié)合使用。

Domingo 等［83］開(kāi)發(fā)了一種基于固相萃取和電噴霧電離液相色譜質(zhì)譜（ESI?LC?MS）的無(wú)抗體方法，用于在人腦脊液（hCSF）中同時(shí)鑒定和定量19 種Aβ 亞型（Aβ1?42、1?40、1?38 和16 種Aβ N端截短和翻譯后修飾形式（包括焦谷氨酸形式）的肽。Portelius 等［84］描述了一種方法，它采用免疫沉淀結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜來(lái)確定腦脊液中C 端截短的Aβ 肽的模式，使用與磁珠偶聯(lián)的抗體，在腦脊液中檢測(cè)到18個(gè)C端和2個(gè)N 端截短的Aβ 肽，其中3 個(gè)最強(qiáng)的峰對(duì)應(yīng)于Aβ1?40、Aβ1?17 和Aβ1?38。Murayama 等［85］生成了一種新的單克隆抗體，該抗體對(duì)Aβ5?40/42 的N端具有特異性。蛋白質(zhì)印跡證實(shí)該抗體識(shí)別Aβ5?40 但不識(shí)別Aβ1?40。用抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析，進(jìn)一步檢測(cè)到來(lái)自表達(dá)半胱天冬酶切割的APP 的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中的Aβ5?40。Kaneko 等［86］通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜法（基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜）對(duì)人血漿中進(jìn)行鑒定，檢測(cè)到22 種Aβ 相關(guān)肽，開(kāi)發(fā)了Aβ相關(guān)肽的定量分析，并證明了血漿稀釋線性和定量所需的精確度。Hau?mann 等［87］提出了一種通過(guò)毛細(xì)管等電聚焦免疫測(cè)定、分離和檢測(cè)Aβ N 端截短肽的新方法。CIEF 免疫測(cè)定和免疫沉淀質(zhì)譜分析確定，從殘基R5 開(kāi)始的肽是在細(xì)胞培養(yǎng)模型中存在BACE1 抑制劑的情況下產(chǎn)生的主要氨基末端Aβ變體。Pannee等［88］開(kāi)發(fā)了一種基于免疫沉淀的方法，用于從人血漿中富集Aβ 肽。使用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間/飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析肽段以進(jìn)行Aβ 分析和選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)，進(jìn)行Aβ1?38、Aβ1?40 和Aβ1?42 的MS 定量。在Sargaeva［89］的研究中，電子捕獲解離（ECD）傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FTICR MS）被應(yīng)用于檢測(cè)Aβ 肽中的天冬氨酸的異構(gòu)化.

3.2 免疫學(xué)方法

基于抗原抗體特異性反應(yīng)的免疫檢測(cè)方法是定性、定量分析Aβ 肽的最常用、可靠和靈敏的方法之一。酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）、蛋白質(zhì)印跡法、免疫組織化學(xué)法、免疫熒光標(biāo)記、免疫染色法也常用來(lái)鑒別和檢測(cè)Aβ變體。

針對(duì)不同的Aβ 變體，人們獲得了不同的抗體（表3）。Caillava 等［90］獲得了針對(duì)人Aβ34 C 端最后14 個(gè)氨基酸的兔多克隆抗體（稱為α34）。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)表明，α34 血清的整個(gè)純化IgG 片段僅識(shí)別Aβ34，而不識(shí)別其全長(zhǎng)對(duì)應(yīng)物Aβ40。ELISA證實(shí)了α34 對(duì)Aβ34 的特異性，并且具有高靈敏度（檢測(cè)下限約為1μg/L）。Sullivan等［91］生成了兩種針對(duì)Aβ pE物種的多克隆抗體，并使用它們來(lái)觀察人淀粉樣斑塊的Aβ pE譜。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析和免疫組織化學(xué)對(duì)這些抗體的評(píng)估表明，它們?cè)诘蜐舛认拢?μg/L）與靶標(biāo)特異性結(jié)合。Albertini等［92］設(shè)計(jì)了一種免疫蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)方法，該檢測(cè)在預(yù)活化表面的芯片陣列上使用單克隆抗體混合物（6E10+4G8），然后使用表面增強(qiáng)激光解吸電離?飛行時(shí)間質(zhì)譜（SELDI?TOF MS）分析檢測(cè)到15 個(gè)Aβ亞型。Acero等［93］生成并表征了一種抗Aβ pE3小鼠單克隆抗體（3B8），可識(shí)別AD患者腦組織和3xTg?AD 轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中的淀粉樣蛋白聚集體。針對(duì)不同Aβ 片段的ELISA分析結(jié)果表明，無(wú)論焦谷氨酸修飾如何，都可以識(shí)別AβpE3 和Aβ3?42中存在的兩個(gè)構(gòu)象表位。在AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，Aβ4?x 先于Aβ pE（3?x）在神經(jīng)元內(nèi)積累。新型Aβ4?x免疫反應(yīng)性抗體NT4X?167［94］可以檢測(cè)到來(lái)自截短Aβ 物種的高分子質(zhì)量聚集體，并且與其他常見(jiàn)神經(jīng)退行性疾病典型的聚集體沒(méi)有交叉反應(yīng)。Liu 等［95］使用與辣根過(guò)氧化物酶連接的抗體（P82，M11），利用ELISA在血管淀粉樣沉積物中檢測(cè)到未修飾的游離Aβ11?40和焦谷氨酸修飾的Aβ11?40。Mehta 等［96］生成和部分表征了針對(duì)AβpE3 的兔單克隆抗體（Rab mAb），發(fā)現(xiàn)生成的Rab mAb 對(duì)AβpE3 具有特異性，因?yàn)樗cAβ16、Aβ40、Aβ42、Aβ3?11 和Aβ pE（11?17）在ELISA中沒(méi)有反應(yīng)性。在蛋白質(zhì)印跡中，AβpE3的最佳檢測(cè)條件是抗體濃度為0.5 mg/L，該抗體的靈敏度足以在夾心ELISA 中檢測(cè)10 ng/L 的AβpE3。Mohamadi 等［97］提出了一種用于檢測(cè)Aβ 肽的集成微流控芯片，該設(shè)備利用免疫捕獲和微芯片電泳分析不同截短的Aβ 肽（1?37、1?39、1?40 和1?42），并且能夠檢測(cè)低至25 ng的加在未稀釋的腦脊液中的合成Aβ 肽。Klafki 等［98］對(duì)針對(duì)Aβ（?3?x）N 端的兩種抗體進(jìn)行了表征，開(kāi)發(fā)了用于測(cè)量Aβ（?3?40）的夾心免疫測(cè)定方法，并通過(guò)毛細(xì)管等電聚焦免疫測(cè)定、蛋白質(zhì)印跡分析和免疫組織化學(xué)評(píng)估了抗體選擇性。兩種單克隆抗體都檢測(cè)到Aβ（?3?40），與Aβ1?40或N端截短的Aβ變體沒(méi)有明顯的交叉反應(yīng)。免疫測(cè)定對(duì)Aβ（?3?40）顯示出高選擇性，定量測(cè)定范圍為22 ng/L～7.5μg/L。除了針對(duì)Aβ截短肽的抗體外，研究者還開(kāi)發(fā)了針對(duì)Aβ 修飾肽的抗體，如針對(duì)磷酸化的S8（pS8 Aβ）的特異性抗體1E4E11［99］，針對(duì)磷酸化的S26（pS26 Aβ）的單克隆抗體5H11C10［100］，針對(duì)硝化的Y10（3NTyr10Aβ）的3NTyr10Aβ 抗血清［101］，針對(duì)焦谷氨酸化的E3（pE3Aβ）的抗體337.48及針對(duì)異天冬氨酸化的IsoD?Aβ的抗體22C8［102］。

3.3 電化學(xué)法

電化學(xué)方法通常采用生物傳感器將生化反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榭啥康奈锢?化學(xué)信號(hào)，由于其高效性、成本低、高特異性和快速性，成為目前最廣泛使用的技術(shù)之一。基于酪氨酸或絲氨酸的磷酸化和酪氨酸的硝化對(duì)肽分子電化學(xué)活性的影響，Suprun等［103］在碳絲網(wǎng)印刷電極上記錄了帶有未修飾殘基、O?磷酸化Y10 或S8、3?硝化Y10 的Aβ16 的氧化和還原的方波伏安圖，結(jié)果表明這些氨基酸殘基的磷酸化和硝化都顯著改變了Aβ16 肽的電化學(xué)行為，利用電化學(xué)方法可以直接檢測(cè)Aβ 中的翻譯后修飾。Lu 等［104］通過(guò)TiO2納米刷（TiO2NB）基于溶液的水熱生長(zhǎng)來(lái)構(gòu)建光電化學(xué)（PEC）傳感器用于檢測(cè)Aβ1?28，表現(xiàn)出極大靈敏度，檢測(cè)限為26.3μg/L，促進(jìn)了一種簡(jiǎn)單、無(wú)標(biāo)記、快速、靈敏和無(wú)創(chuàng)的方法，以克服用于AD 診斷的常規(guī)技術(shù)的局限性。表面修飾、蛋白質(zhì)納米結(jié)構(gòu)作為新興的生物納米技術(shù)平臺(tái)，為構(gòu)建生物傳感器提供了強(qiáng)大的工具［105］，基于該平臺(tái)的電化學(xué)檢測(cè)方法將為Aβ 變體的檢測(cè)提供更多的可能。

4 結(jié)論與展望

位于Aβ序列內(nèi)的FAD突變似乎具有不同的生化特性和病理效應(yīng)，并導(dǎo)致不同臨床表現(xiàn)和發(fā)展。除了A2T 是一種保護(hù)性突變外，其他大多數(shù)突變會(huì)增加向寡聚體或原纖維的聚集率，更具神經(jīng)毒性和病理性。FAD點(diǎn)突變會(huì)改變Aβ肽的聚集動(dòng)力學(xué)，形成形態(tài)、構(gòu)象上不同的淀粉樣蛋白結(jié)構(gòu)，這可能解釋了與Aβ突變相關(guān)的疾病表型的異質(zhì)性。

除了FAD 中存在的Aβ 突變體外，散發(fā)性AD中還有大量的其他Aβ 種類，有些是在APP 加工過(guò)程中產(chǎn)生的，有些是經(jīng)過(guò)翻譯后修飾產(chǎn)生的，或者是在某些細(xì)胞或細(xì)胞外區(qū)室中發(fā)現(xiàn)或產(chǎn)生的。Aβ的特定區(qū)域顯然對(duì)其生理特性有不同的貢獻(xiàn)，如Aβ的N端區(qū)域及某些氨基酸是翻譯后修飾的熱點(diǎn)。Aβ 后修飾是一個(gè)廣闊的但并未深入研究的領(lǐng)域，有可能對(duì)理解AD的發(fā)病機(jī)制做出重大貢獻(xiàn)。酶切和修飾過(guò)程導(dǎo)致致病性Aβ 種類的形成，其水平可能隨著年齡增加而增加，并和遺傳因素相關(guān)。這些Aβ 的酶切和修飾可能是散發(fā)性AD的主要貢獻(xiàn)者，靶向這些肽或相關(guān)的酶可以作為一種新的治療機(jī)制或提供一種新的診斷方法。目前已經(jīng)成功開(kāi)發(fā)了多種檢測(cè)Aβ 變體的方法，但沒(méi)有一個(gè)黃金標(biāo)準(zhǔn)，為了實(shí)現(xiàn)對(duì)Aβ及Aβ變體的臨床檢測(cè)，還需要做大量的工作來(lái)開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、可靠、準(zhǔn)確和便宜的技術(shù)。這些方法與用于生物傳感的新納米材料或探針的進(jìn)一步整合將有助于獲得高靈敏度和高選擇性的Aβ 檢測(cè)。對(duì)全長(zhǎng)Aβ 的檢測(cè)不足以獲得關(guān)于AD 進(jìn)展的明確診斷結(jié)論，通過(guò)高通量分析可以方便地對(duì)不同標(biāo)志物進(jìn)行多重檢測(cè)。隨著對(duì)AD發(fā)病機(jī)理的深入認(rèn)識(shí)和納米技術(shù)、設(shè)備制造方法的進(jìn)步，應(yīng)該會(huì)找到一種早期診斷AD的方法。