金抗體替代ELISA中的天然抗體用于溶菌酶檢測*

許艷嬌 李文浩 高天歌 曹傲能*

（上海大學(xué)納米化學(xué)與生物學(xué)研究所，上海 200444）

酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）最早由Engvall和Perlmann 于1971 年開發(fā)出來［1］。ELISA 可用于抗體、抗原（包括蛋白質(zhì)、多肽和其他分子）的檢測和定量。經(jīng)歷一系列優(yōu)化開發(fā)、自動(dòng)化和商業(yè)化［2?5］，ELISA 已成為世界各國研究和診斷實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法［4，6?7］，廣泛應(yīng)用于疾病診斷［8］、食品安全檢測［9］、環(huán)境檢測［10］等領(lǐng)域［11?12］。

隨著ELISA 在臨床、食品安全和環(huán)境等領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用，現(xiàn)在幾乎所有的實(shí)驗(yàn)室在分析時(shí)都直接或間接地使用ELISA［9］。在正確嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牟僮飨拢珽LISA可以為科學(xué)研究和臨床診斷提供高度可重復(fù)的定量數(shù)據(jù)。然而，ELISA的檢測完全依賴于抗體的活性，而天然抗體固有的不穩(wěn)定缺點(diǎn)也給ELISA 檢測帶來一系列問題。首先，特異性單克隆抗體的生產(chǎn)仍極具挑戰(zhàn)性［13］，抗體生產(chǎn)的批次不同就可能造成抗體的活性區(qū)別和檢測結(jié)果的差異。此外，作為天然蛋白質(zhì)的抗體可能會(huì)由于溫度、pH 或化學(xué)誘導(dǎo)的變化而失去其活性［14?15］。這些缺點(diǎn)都在一定程度上限制了ELISA 的應(yīng)用范圍和環(huán)境。

本課題組前期發(fā)展了一種構(gòu)象工程方法［16］，通過將天然抗體蛋白中的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）片段嫁接到金納米粒子（AuNPs）上，并成功在金納米粒子上重建了CDR片段在原天然抗體中的構(gòu)象，制備了一種全新的、可像原天然抗體一樣特異性識(shí)別原抗原的納米人工抗體，簡稱為金抗體（goldbody）［16］。其中，抗溶菌酶金抗體就是將天然抗體cAb?lys3的CDR3區(qū)域經(jīng)適當(dāng)改造后得到多肽P1，P1肽通過其兩端的半胱氨酸以兩個(gè)Au?S鍵連接到金納米粒子上而制得。盡管自由的P1 肽不具備和溶菌酶結(jié)合的能力，經(jīng)構(gòu)象重構(gòu)后得到的抗溶菌酶金抗體可以像天然抗體cAb?lys3一樣與溶菌酶特異性結(jié)合，并抑制溶菌酶的活性［16?17］。根據(jù)基于此工作提出的“限域下最低能量結(jié)構(gòu)片段”（CLEF）假說［18?19］，該技術(shù)可以作為一種普適的方法開發(fā)更多的識(shí)別不同抗原的金抗體。金抗體可以像天然抗體一樣特異性地與抗原相互作用，并且具備遠(yuǎn)優(yōu)于天然抗體的穩(wěn)定性［16］。金抗體經(jīng)煮沸1 h、冷卻后仍然保持極大部分活性。Willson 教授在F1000Prime 推薦此工作的文章中［20］，還專門為該技術(shù)造了一個(gè)新詞“goldization”，將其與治療抗體中的人源化（humanization）相比擬，暗示該技術(shù)的廣泛應(yīng)用前景。作為金抗體應(yīng)用的探索，在此首次研究了以金抗體代替天然抗體用于ELISA 檢測，可以克服天然抗體的不穩(wěn)定性缺點(diǎn)。

ELISA有多種檢測類型，其中最簡單的就是直接法［21?23］。直接法直接將抗原固定（包被，coating）在孔板上，而把辣根過氧化物酶（HRP）連接到特異性識(shí)別抗原的抗體（一抗）（圖1a）。直接法的缺點(diǎn)之一是要把HRP 連接到一抗，檢測不同的抗原就需要把HRP 連接不同的一抗，因而生產(chǎn)和使用成本較高。針對這一缺點(diǎn)，間接法（圖1b）把HRP 連接到識(shí)別一抗的二抗上，由于HRP?二抗的通用性而降低使用成本。本工作中，金抗體用于ELISA 的方案設(shè)計(jì)（圖1c）參考直接法和間接法原理，針對蛋清溶菌酶（HEWL）抗原，以抗溶菌酶金抗體作為一抗，通過帶巰基的PEG 先與HRP 共價(jià)連接制得HRP?PEG?SH，然后利用HRP?PEG?SH上巰基高效與金納米粒子反應(yīng)的特性，將HRP?PEG?SH 連接到金抗體上。因此，HRP?PEG?SH可作為一個(gè)相當(dāng)于HRP?二抗的產(chǎn)品，具有通用性，可以用于未來不同抗原的檢測。因而這一金抗體ELISA 兼具直接法和間接法ELISA 的部分特點(diǎn)和優(yōu)勢。

Fig.1 Schematic diagram of the application of goldbody in ELISA

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

氯金酸、檸檬酸三鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、硫酸、過氧化氫和氫氧化鈉購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（中國）。1?乙基?（3?二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N?羥基琥珀酰亞胺（NHS）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。巰基聚乙二醇羧基（HS?PEG（5K）?COOH）購于上海芃碩生物科技有限公司。溶壁微球菌購于生工生物工程上海股份有限公司。雞蛋清溶菌酶（HEWL）、核糖核酸酶A（RNase A）、牛血清白蛋白（BSA）和辣根過氧化物酶（HRP）購自Sigma?Aldrich（美國）。檢測溶菌酶ELISA 試劑盒（F81004?A）購自凡科維公司（上海）。多肽P1（其氨基酸序列為CGSTIYASYYESGHGC）由上海科肽生物技術(shù)有限公司合成。紫外可見光譜于U?3010 型光譜儀（日本HITACHI公司）上測定，電鏡照片于HT7700（透射電子顯微鏡日本Hitachi 公司）上拍攝，ELISA 檢測于Varioskan Flash 多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）上進(jìn)行。

1.2 聚乙二醇耦聯(lián)辣根過氧化物酶

使用經(jīng)典的EDC?NHS 反應(yīng)將HS?PEG（5K）?COOH 與HRP 耦聯(lián)。具體步驟如下：分別稱取1.2 mg HS?PEG?COOH 溶于6 ml 磷酸鹽緩沖液（40 mmol/L，pH 7.4），稱取10 mg NHS 溶于50μl超純水，稱取10 mg EDC 溶于50μl 超純水，稱取8 mg HRP 溶于2 ml 超純水。在4℃攪拌下，將30μl EDC溶液滴加至5 ml HS?PEG?COOH溶液中，避光反應(yīng)10 min后，加入30μl NHS溶液避光反應(yīng)30 min，將2 ml HRP 溶液滴加至混合溶液，避光反應(yīng)過夜。反應(yīng)完畢后使用截留分子質(zhì)量為10 ku的超濾管，在10oC 300 r/min 的條件下離心超濾除去未反應(yīng)物，并用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，將所得上清液進(jìn)行冷凍干燥，得到最終產(chǎn)物即為HRP?PEG?SH。

1.3 酶標(biāo)金抗體的合成與優(yōu)化

金納米粒子的合成：課題組前期抗溶菌酶金抗體的工作主要利用3.6 nm 的金納米粒子合成，因?yàn)槌叽缧〉慕鸺{米粒子可以有更高的摩爾濃度［16］。本工作中，首先測試了3.6 nm 金抗體的適用性（附件圖S1～S4），最終選擇了13 nm金納米粒子。13 nm金納米粒子按如下方法合成：在500 ml圓底燒瓶中加入240 ml超純水及25 ml 39.47 mmol/L檸檬酸三鈉溶液后置于120oC 恒溫油浴中。冷凝回流，反應(yīng)20 min 后，迅速加入10 ml 25 mmol/L 氯金酸溶液。均勻攪拌約5 min 后取出，自然冷卻至室溫，即得13 nm金納米粒子（附件圖S5～S8）。

金抗體的合成與優(yōu)化：根據(jù)課題組前期工作，多肽可通過Au?S 鍵高效固定在金納米粒子表面［16］。為確定13 nm AuNPs 表面可耦聯(lián)P1 多肽的最大數(shù)量，將過量P1與AuNPs反應(yīng)，利用P1的固有熒光，檢測超濾后未反應(yīng)的游離肽（附件圖S9），平均每個(gè)AuNP上耦聯(lián)P1的最大數(shù)量為679，即多肽密度優(yōu)化時(shí)上限是679。首先將制得的13 nm 金納米粒子使用0.22μm 過濾膜除去可能的大顆粒雜質(zhì)。然后將10μl 0.2 mol/L檸檬酸三鈉溶液加入到6 ml 過濾后的AuNPs 中，室溫下攪拌均勻。接著將2 ml 不同濃度的P1 多肽溶液（根據(jù)吸光度定濃度，多肽P1 消光系數(shù)為2.706 L/g）逐滴加入至上述溶液，避光攪拌反應(yīng)過夜，即可得到不同多肽密度的抗溶菌酶金抗體。最后通過金抗體抑制溶菌酶活性實(shí)驗(yàn)確定最佳多肽密度。

酶標(biāo)金抗體的合成與優(yōu)化：酶標(biāo)金抗體采取與制備金抗體相近方法，從金納米粒子直接合成。先將1 ml 多肽溶液（按照優(yōu)化濃度后的濃度）逐滴滴加到AuNPs 與檸檬酸三鈉溶液混合溶液中，室溫下避光反應(yīng)1 h 后，將不同濃度的1 ml HRP?PEG?SH 溶液逐滴滴加至上述溶液中，同樣通過Au?S 鍵將HRP?PEG?SH 固定在金納米粒子表面，避光攪拌反應(yīng)過夜，即可得到酶標(biāo)金抗體（HRP?（Au?400P1））。同樣通過金抗體抑制溶菌酶活性實(shí)驗(yàn)確定每個(gè)金抗體上的最佳HRP個(gè)數(shù)。

1.4 溶菌酶活性檢測

HEWL 的酶活性是以溶壁微球菌為底物的比濁法來確定，通過使用紫外?可見分光光度計(jì)檢測在450 nm 處的動(dòng)態(tài)吸光度來測定［16］。底物儲(chǔ)備溶液是將溶壁微球菌分散到磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.2）中。HEWL 儲(chǔ)備溶液同樣在磷酸鹽緩沖液中制備。測定方法是將0.5 ml的HEWL溶液添加到1 ml 的Au?P1 或HRP?（Au?400P1）溶液中并充分混合1 min。然后將1 ml 底物溶液加入到混合物中。劇烈振蕩以混勻后，將混合物迅速轉(zhuǎn)移到比色皿中進(jìn)行吸光度測量。所有樣品和測定均在25oC 下進(jìn)行。180 s 內(nèi)吸光度變化與時(shí)間的斜率代表HEWL的活性。在抑制劑的作用下，測量斜率與游離HEWL 斜率之間的比值表示HEWL 的相對活性，相對活性的丟失即為抑制劑對HEWL 的相對抑制率。

1.5 酶標(biāo)金抗體在ELISA中的應(yīng)用

按照圖1c 的設(shè)計(jì)方案，以酶標(biāo)金抗體進(jìn)行了溶菌酶的定量檢測。參照了標(biāo)準(zhǔn)的ELISA 直接法檢測步驟，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)用96 孔板，在Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀上進(jìn)行。同時(shí)用酶標(biāo)天然抗體按標(biāo)準(zhǔn)的ELISA 直接法檢測進(jìn)行對照。

為檢驗(yàn)酶標(biāo)金抗體ELISA 法在復(fù)雜溶液條件中檢測溶菌酶的效果，本實(shí)驗(yàn)采取加標(biāo)回收的方法，以已知濃度HEWL 混合高濃度的雜蛋白作為測試樣品。我們選擇與HEWL 性質(zhì)相似的帶正電的RNase A 和血液中大量存在的帶負(fù)電白蛋白（BSA）作為代表性雜蛋白。先分別配置HEWL、RNase A和BSA純?nèi)芤?，并通過測定吸收度確定三者各自的濃度。然后按一定比例混合得到加標(biāo)樣品。最終樣品中HEWL 的濃度分別為1.5、4.6、10 mg/L，對應(yīng)的RNase A 濃度為HEWL 濃度的10倍即15、46、100 mg/L，對應(yīng)的BSA 設(shè)置為HEWL 濃度的100 倍即150、460、1 000 mg/L。將三個(gè)樣品分別以傳統(tǒng)直接法和酶標(biāo)金抗體直接法來進(jìn)行加標(biāo)回收測定，分析測定值及加標(biāo)回收率。

1.6 檢測蛋清中的溶菌酶

為檢驗(yàn)酶標(biāo)金抗體ELISA 法對于真實(shí)樣品中檢測溶菌酶的效果，我們對雞蛋蛋清中溶菌酶進(jìn)行了檢測。將雞蛋打碎并將蛋液混合物置于燒杯中，使用注射器人工將蛋清分離出來，使用20 mmol/L pH 9.2 碳酸鹽緩沖溶液稀釋，最后使用20 mmol/L pH 10.7 碳酸鹽緩沖溶液將稀釋液配制為最終的待測樣品，測定蛋清稀釋液中的溶菌酶含量，同時(shí)使用傳統(tǒng)ELISA 法直接法對蛋清稀釋液進(jìn)行測定，分析兩種方法的測定值以及蛋清中溶菌酶的總含量。

2 結(jié)果與討論

以粒徑約3.6 nm AuNPs 為骨架的抗溶菌酶金抗體（附件圖S1～S3）雖然具有很好的特異性結(jié)合溶菌酶的能力，并得到較為詳盡的研究［16?17］。但可能由于HRP 標(biāo)記后，對3.6 nm 金抗體有遮蔽金作用，大大降低金抗體活性（附件圖S4），因此本文重點(diǎn)選擇粒徑較大的AuNPs（～13 nm，圖2a，b）作為骨架。首先通過金抗體抑制溶菌酶活性實(shí)驗(yàn)確定13 nm AuNPs上最佳P1多肽的密度。結(jié)果顯示，當(dāng)平均每個(gè)金納米粒子上連接450 條P1 多肽時(shí)，金抗體對HEWL酶活性抑制率最高（圖2c）?？紤]到在金抗體表面耦聯(lián)HRP時(shí)需要擠占一部分位點(diǎn)，因此選擇平均每個(gè)金納米粒子上連接400 條P1 多肽作為最佳耦聯(lián)密度。

然后在平均每個(gè)金納米粒子上耦聯(lián)400 條P1多肽基礎(chǔ)上，耦聯(lián)不同數(shù)量的HRP，得到HRP?金抗體耦聯(lián)物（圖3a）。同樣通過金抗體抑制溶菌酶活性實(shí)驗(yàn)來檢測耦聯(lián)HRP 對金抗體識(shí)別溶菌酶的影響。結(jié)果顯示，在平均每個(gè)金抗體表面耦聯(lián)10個(gè)以內(nèi)的HRP 后，金抗體仍然可以較好地抑制溶菌酶的活性（圖3b）。

下一步，用制得的不同HRP 耦聯(lián)量的酶標(biāo)金抗體代替天然抗體，初步探索用ELISA 法定量測定溶菌酶含量實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖4），和預(yù)期一樣，金抗體表面耦聯(lián)HRP 越多，檢測到的信號(hào)越強(qiáng)；而作為陰性對照的金納米粒子和沒有耦聯(lián)HRP 的金抗體則沒有檢出信號(hào)。綜上結(jié)果，最終選定10HRP?（Au?400P1）為ELISA用酶標(biāo)金抗體。

由于抗原包被的質(zhì)量對后續(xù)ELISA 檢測有重要影響。因此，對包被HEWL的包被緩沖液pH進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)對酶底物反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化（附件圖S10）。優(yōu)化反應(yīng)條件后，將酶標(biāo)金抗體代替檢測抗體進(jìn)行探索，確定檢測步驟如下：

Fig.2 Characterization of AuNPs and goldbody

a.包被。在96 孔板中，每孔加入對應(yīng)100 μl不同濃度HEWL（20 mmol/L pH 10.7 碳酸鹽緩沖溶液），4oC靜置過夜；洗板并拍干。

b.封閉。在包被后的孔板中，每孔加入200μl 5%BSA（20 mmol/L pH 7.4 磷酸鹽緩沖溶液），室溫下振蕩1 h；洗板并拍干。

c.結(jié)合酶標(biāo)金抗體。在對應(yīng)板孔中加入100μl酶標(biāo)金抗體，室溫下振蕩反應(yīng)2 h；洗板并拍干。

d.酶底物反應(yīng)：加入100μl 現(xiàn)配酶底物（o?phenylenediamine，OPD，pH 5.5 緩沖鹽溶液），避光反應(yīng)15 min 后，加入100μl 2 mol/L 硫酸終止反應(yīng)。

e.檢測分析：使用多功能酶標(biāo)儀測定最終反應(yīng)結(jié)果，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

Fig.3 Characterization of enzyme-labeled goldbody

實(shí)現(xiàn)以上條件和步驟優(yōu)化后，對一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)HEWL 溶液用ELISA 法進(jìn)行定量檢測，得到了標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5a），通過對檢測曲線進(jìn)行擬合，最終得到的濃度曲線方程為：A495nm=3.81-3.75/（1+（c/3.72）2.6（R2=0.99）。A495nm為在495 nm處檢測的酶解產(chǎn)物吸光度，c為溶菌酶濃度。從圖5a 可以看出，抗溶菌酶金抗體ELISA 的定量檢測范圍為1～16 mg/L，這與傳統(tǒng)ELISA 方法的檢測范圍相當(dāng)［24］。

Fig.4 Signal of enzyme-labeled goldbodies with different HRP density

為了和傳統(tǒng)的直接法ELISA 比較，以商業(yè)試劑盒中的酶標(biāo)抗溶菌酶天然抗體及配套底物（底物略有不同，對應(yīng)檢測波長有一定變化）繪制傳統(tǒng)的直接法ELISA檢測溶菌酶曲線（圖5a），擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A450nm=0.87-0.82/（1+（c/18.28）1.38（R2=0.99）。通過對比可以看出，金抗體和天然抗體檢測范圍大致相當(dāng)，但在檢測低濃度溶菌酶時(shí)，金抗體ELISA法比傳統(tǒng)的直接法ELISA更靈敏。

為進(jìn)一步確定抗溶菌酶金抗體ELISA 檢測HEWL 的特異性，以和溶菌酶大小帶電等性質(zhì)都十分相似的RNase A 來測試該方法的實(shí)用性。從圖5b 可以看出，和溶菌酶同濃度的純RNase A 幾乎不產(chǎn)生檢測信號(hào)，而即使用HEWL 5 倍濃度的RNase A和HEWL相混合作為待測樣品，檢測信號(hào)也和同溶菌酶濃度的純HEWL 檢測信號(hào)幾乎完全一致，從而驗(yàn)證了酶標(biāo)金抗體對較為復(fù)雜環(huán)境中抗原的檢測能力。

然后，采取加標(biāo)回收的方法檢驗(yàn)酶標(biāo)金抗體ELISA 法在復(fù)雜溶液條件中檢測溶菌酶的效果。表1 列出了分別用金抗體ELISA 法和天然抗體ELISA 直接法檢測參雜高濃度RNase A 和BSA 的HEWL 樣品的檢測結(jié)果。從結(jié)果可以看出，酶標(biāo)金抗體檢測的3 個(gè)樣品，其回收率均在90%～110%以內(nèi)，符合檢測標(biāo)準(zhǔn)。而且無論是檢測值的平均偏差還是樣品加標(biāo)回收率，金抗體ELISA 法（檢測值的平均偏差±0.04，回收率平均偏差為+2.3%）都優(yōu)于天然抗體ELISA直接法（檢測值的平均偏差±0.17，回收率平均偏差為?9.4%），因而金抗體ELISA法檢測準(zhǔn)確度比傳統(tǒng)的ELISA直接法更高。

Fig.5 Detection of HEWL by ELISA with goldbody（10HRP-（Au-400P1））or natural antibody

Table 1 Recovery of spiked HEWL samples by goldbody-ELISA and traditional direct ELISA

最后，對真實(shí)樣品即雞蛋蛋清中的溶菌酶含量進(jìn)行檢測，以檢驗(yàn)酶標(biāo)金抗體ELISA 法對于實(shí)際樣品的檢測效果。先用兩個(gè)不同的稀釋倍數(shù)將蛋清稀釋至ELISA 法的檢測范圍，以驗(yàn)證檢測方法的可靠性和實(shí)用性（表2）。從表2中可以看出，酶標(biāo)金抗體ELISA 法對不同稀釋倍數(shù)的樣品檢測結(jié)果一致性要優(yōu)于傳統(tǒng)ELISA直接法檢測結(jié)果。同時(shí)，檢測所得的蛋清中溶菌酶含量與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相近［25］。

Table 2 Detection of lysozyme in egg white by goldbody-ELISA and traditional direct ELISA

3 結(jié)論

在前期工作基礎(chǔ)上，本文首先以13 nm AuNPs為骨架合成和優(yōu)化了抗溶菌酶金抗體，并制備了可以用于ELISA 檢測的酶標(biāo)抗溶菌酶金抗體10HRP?（Au?400P1），可用于定量檢測1～16 mg/L范圍內(nèi)的HEWL，檢測范圍和傳統(tǒng)的ELISA方法相當(dāng)。金抗體ELISA 展示了良好的特異性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，即使和高濃度的、與HEWL 性質(zhì)極為相似的RNase A混合，也不影響對HEWL的檢測結(jié)果。加標(biāo)回收法對比測試結(jié)果顯示，無論是測量值的平行性還是加標(biāo)樣品的回收率，酶標(biāo)金抗體ELISA 法都明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的天然抗體ELISA直接法。當(dāng)然，金抗體ELISA 還有很大的優(yōu)化提升空間，比如選擇更合適的金納米粒子尺寸，以及增加HRP 的耦聯(lián)量。相信經(jīng)過進(jìn)一步優(yōu)化后，可以用于檢測更低的抗原濃度。以金抗體代替天然抗體用于ELISA直接法檢測，不僅避免了天然抗體穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)，而且10HRP?（Au?400P1）作為檢測抗體，還具備了部分間接法的優(yōu)勢，即HRP?PEG 大致相當(dāng)于間接法中的酶標(biāo)二抗，且價(jià)格低于酶標(biāo)二抗，既降低了生產(chǎn)成本，也避免了交叉反應(yīng)。隨著未來更多識(shí)別不同抗原金抗體的開發(fā)，相信可以廣泛地使用金抗體代替天然抗體用于ELISA法檢測和診斷。

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