鰻弧菌（Vibrio anguillarum）核酸適配體的篩選及其結(jié)合蛋白的分離鑒定*

鄭 江 劉慧敏 黃力行 林筱鈞 彭雪云 江興龍 周建傳 湯學(xué)敏

（1）集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建省水產(chǎn)生物育種與健康養(yǎng)殖工程研究中心，廈門 361021；2）福建省特種水產(chǎn)配合飼料重點實驗室，福清350308）

核酸適配體是采用SELEX 篩選技術(shù)獲得的對靶目標(biāo)有較高親和特異性的寡核苷酸序列［1］。該技術(shù)以人工合成的隨機(jī)寡核苷酸文庫為初始文庫，利用寡核苷酸可在空間形成多種多樣的三維結(jié)構(gòu)，將寡核苷酸文庫與靶目標(biāo)經(jīng)過多輪的結(jié)合、分離、擴(kuò)增等篩選進(jìn)化過程，最終篩選出能與靶目標(biāo)特異性結(jié)合的寡核苷酸分子，即核酸適配體［1］。與抗體蛋白相比，核酸適配體具有親和特異性好、穩(wěn)定性高、靶分子范圍廣等多種優(yōu)點，在細(xì)菌、病毒、蛋白質(zhì)等的識別鑒定和藥物開發(fā)方面都展現(xiàn)出較好的應(yīng)用潛力［2?7］。

鰻弧菌（Vibrio anguillarum，V.anguillarum）屬于弧菌科、弧菌屬，是致病性較高的一種條件致病菌，可以感染多種海洋或淡水環(huán)境中的魚類、貝類等，給水產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［8?9］。對鰻弧菌進(jìn)行快速的識別鑒定是其病害防治的前提和基礎(chǔ)。但由于弧菌種類多、遺傳變異快、基因特征又相似，早期的感染癥狀也非常相似，因此傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法和16S rDNA 等方法對其進(jìn)行檢測鑒定的效果并不理想［10?12］。核酸適配體作為一種分子識別工具，早期主要用于腫瘤標(biāo)志物的識別鑒定和腫瘤細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，近年來發(fā)現(xiàn)其在微生物的檢測方面也有較好的應(yīng)用效果［12?14］，并可作為一種分子標(biāo)記工具應(yīng)用于微生物相關(guān)靶標(biāo)位點的分析及其侵染機(jī)制的研究［15?17］。例如，Yu等［17］利用核酸適配體標(biāo)記石斑魚虹彩病毒的衣殼蛋白，研究了該病毒的侵染致病機(jī)制。因此，篩選鰻弧菌的核酸適配體，利用核酸適配體對鰻弧菌相關(guān)位點進(jìn)行分析鑒定，不僅能為鰻弧菌的檢測鑒定提供一個新的手段，對于了解鰻弧菌的這些位點和研究這些位點在鰻弧菌病害防治中的作用也具有重要意義。

本研究對鰻弧菌核酸適配體的1～5輪篩選產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，從其中的高頻序列中挖掘出候選的核酸適配體序列，然后通過親和特異性研究、親和常數(shù)、飽和親和力等指標(biāo)對相應(yīng)的核酸適配體進(jìn)行驗證和表征，最后通過磁分離、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）和質(zhì)譜對核酸適配體的結(jié)合蛋白進(jìn)行分離和鑒定，相關(guān)研究對于鰻弧菌的檢測鑒定及其病害防治都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鰻弧菌（V.anguillarum）、遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、大腸桿菌（Escherichia coli）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila），均由集美大學(xué)病原生物實驗室提供。隨機(jī)ssDNA 文庫為：5′?TCAGTC?GCTTCGCCGTCTCCTTC（N35）GCACAAGAG?GGAGACCCCAGAGGG?3′，長度為82 nt，N35為含35個隨機(jī)堿基的核苷酸序列。PCR用的引物P1：5′?TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC?3′；P2：5′?CCCTCTGGGGTCTCCCTCTTGTGC?3′。文中實驗用到的核酸適配體序列為：5′?TCAGTCGCTT?CGCCGTCTCCTTC（N）GCACAAGAGGGAGAC?CCCAGAGGG?3′，兩端是固定序列，不同核酸適配體的中間序列N 不同（表1）。隨機(jī)文庫、引物和核酸適配體序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司（簡稱上海生工）合成和標(biāo)記。含有DNA聚合酶、dNTP、Mg2+以及PCR穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑組成的PCR 緩沖預(yù)混體系2×Super Pfx MasterMix，購于福建泉州華諾生物科技有限公司。鏈霉親和素磁珠購于中科雷鳴（北京）科技有限公司。20×結(jié)合緩沖液（pH 7.4，100 ml）的配制：NaCl 5.844 g、KCl 3.725 g、Tris?HCl 6.06 g、MgCl2·6H2O 2.033 g，以上物質(zhì)全部溶于超純水中，調(diào)節(jié)pH至7.4，并用超純水定容至100 ml，使用時用超純水稀釋為2×和1×結(jié)合緩沖液。

Table 1 Middle sequences of aptamers

1.2 核酸適配體的SELEX篩選

SELEX 篩選流程和方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行［18］。初始隨機(jī)文庫及每輪的篩選文庫在篩選前都先在95℃熱變性5 min，然后冰浴復(fù)性10 min，以消除原有結(jié)構(gòu)的影響，保證篩選效果。篩選共進(jìn)行5輪，前3輪以鰻弧菌為靶目標(biāo)，每輪篩選中篩選文庫與鰻弧菌的結(jié)合時間為2 h，洗滌1 次，每輪篩選獲得的菌沉淀經(jīng)重懸、加熱、離心后，取上清，上清即為該輪的篩選產(chǎn)物和下一輪的篩選文庫；第4 輪是以哈維氏弧菌和溶藻弧菌為靶目標(biāo)的反篩，篩選文庫分別與哈維氏弧菌結(jié)合1 h，洗滌2 次，棄菌沉淀，上清再與溶藻弧菌結(jié)合1 h，洗滌2次，棄菌沉淀，該上清即為第4輪的篩選產(chǎn)物，并作為篩選文庫再進(jìn)行第5輪篩選；第5輪篩選是以鰻弧菌為靶目標(biāo)，篩選文庫與鰻弧菌的結(jié)合時間為1 h，洗滌2 次，菌沉淀經(jīng)重懸、加熱、離心后，取上清，即為該輪的篩選產(chǎn)物。最后將這5輪的篩選產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行高通量測序，選擇測序結(jié)果中的高頻序列進(jìn)行分析研究。

篩選過程中采用不對稱PCR 進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系 為：模板4 μl，10 μmol/L 的P1 引物4 μl，0.4 μmol/L 的P2 引物4 μl，含 有DNA 聚合酶、dNTP 的PCR 緩沖預(yù)混體系2×Super Pfx MasterMix 25 μl，加雙蒸水至50 μl。不對稱PCR 的熱力學(xué)循環(huán)參數(shù)為：98℃預(yù)變性3 min，98℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，30 個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。

1.3 核酸適配體的親和力測定

核酸適配體在使用前先在95℃熱變性5 min，再冰浴復(fù)性10 min，然后按照文獻(xiàn)的方法［19］，通過測定目標(biāo)菌上結(jié)合的ssDNA 濃度來反映其親和力。

1.4 核酸適配體的親和常數(shù)和飽和（最大）親和力的測定

取10 μmol/L的核酸適配體，用2×結(jié)合緩沖液將其稀釋成不同的濃度梯度，然后按照1.3的親和力測定方法，測定每個濃度梯度下核酸適配體的親和力，再以核酸適配體的濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的親和力為縱坐標(biāo)，采用Origin 8.0 軟件、選擇反比例函數(shù)（Hyperbola 函數(shù)）進(jìn)行非線性擬合，從而獲得相應(yīng)核酸適配體的飽和結(jié)合曲線及其擬合方程，從擬合方程中可以得到相應(yīng)核酸適配體的親和常數(shù)（Kd）值和飽和親和力（Am）值。

1.5 核酸適配體結(jié)合蛋白的分離和鑒定

根據(jù)1.3的測定結(jié)果，選取親和力較高的核酸適配體H5，通過構(gòu)建核酸適配體?磁珠復(fù)合物，采用磁分離法對其結(jié)合蛋白進(jìn)行分離，再用質(zhì)譜對分離純化出的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，具體如下：

鰻弧菌全菌蛋白液的制備：取5ml、濃度為5×1011個/L 的鰻弧菌，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（JY92?IIDN，寧波新藝）進(jìn)行細(xì)胞破碎，相應(yīng)的工作參數(shù)為：功率40%，工作時間2 s，間隙時間3 s，持續(xù)時間40 min，從而制備出鰻弧菌的細(xì)胞破碎液或全菌蛋白液。

磁珠?適配體復(fù)合液的制備：取5μmol/L、5′端標(biāo)記生物素的核酸適配體40μl，95℃加熱5 min后再冰浴10 min，然后與200μl、2 g/L 的磁珠混合，于28℃、200 r/min 的搖床中孵育結(jié)合2 h，得到240μl的磁珠?適配體復(fù)合液。

核酸適配體結(jié)合蛋白的分離、洗滌及電泳：取鰻弧菌全菌蛋白液100μl，與240μl的磁珠?適配體復(fù)合液混合后，于28℃搖床200 r/min 孵育結(jié)合2 h，磁分離后棄上清，沉淀部分即為磁珠?適配體?結(jié)合蛋白復(fù)合物，然后向該沉淀中加入50μl 2×結(jié)合緩沖液重懸沉淀，即得到未洗滌的結(jié)合蛋白樣品。未洗滌的結(jié)合蛋白樣品經(jīng)磁分離后，棄上清，沉淀再加入50～100μl 2×結(jié)合緩沖液洗滌重懸，即得到洗滌1次的樣品，同樣方法可以得到洗滌2次以上的結(jié)合蛋白樣品。取上述樣品液40μl，加入5×加樣緩沖液8 μl，在100 V 電壓下進(jìn)行PAGE 1 h，電泳結(jié)束進(jìn)行染色、脫色、割膠，割下來的含有蛋白質(zhì)樣品的膠條送上海生工生物工程公司進(jìn)行質(zhì)譜分析和鑒定，可得到相應(yīng)的候選蛋白及其氨基酸的排列順序。

1.6 核酸適配體及其結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)分析和亞細(xì)胞定位

登錄 Structurewang 網(wǎng)站（http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/），輸入核酸適配體H5的核苷酸序列，選擇類型為DNA，即可獲得該核酸適配體最可能出現(xiàn)的二級結(jié)構(gòu)。

將質(zhì)譜分析得到的具有最大可能性的結(jié)合蛋白序列命名后輸入Prabi 網(wǎng)站（https://npsa?prabi.ibcp.fr/cgi?bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html），選擇參數(shù)如output、width 等為默認(rèn)值，可對其二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析。

在Phyre2 網(wǎng)站（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）中輸入結(jié)合蛋白的完整氨基酸序列，選擇建模模式為normal，可得到結(jié)合蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖。再通過PyMOL 軟件打開該三級結(jié)構(gòu)圖的PDB 文件，對其中的二級結(jié)構(gòu)分布位置進(jìn)行顏色標(biāo)記，從而可得到更為細(xì)化、精確的三級結(jié)構(gòu)圖。

參考丁秀敏等［20］的方法，使用Psortb 3.0線上網(wǎng)站（http：//www.psort.org/psortb/）對核酸適配體結(jié)合蛋白在鰻弧菌中的定位進(jìn)行預(yù)測。具體方法如下：進(jìn)入網(wǎng)站后，選擇細(xì)菌里的革蘭氏陰性菌，按照fasta 格式插入結(jié)合蛋白的氨基酸序列即可進(jìn)行預(yù)測。

1.7 統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用t檢驗來進(jìn)行組間的差異分析，P<0.05為顯著差異，P<0.01為極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 核酸適配體富集庫的親和力變化

核酸適配體富集庫是篩選產(chǎn)物經(jīng)不對稱PCR擴(kuò)增得到的PCR 產(chǎn)物。隨著篩選輪數(shù)的增加，富集庫對鰻弧菌的親和力呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，從第1 輪的1.60 mg/L 上升至第5 輪的12.03 mg/L，上升了6.52倍（圖1），說明篩選取得了較好效果。

Fig.1 Affinity changes of aptamer enrich library in the selection

2.2 候選核酸適配體序列的選擇

高通量測序后會得到數(shù)萬條序列，其中有些序列是出現(xiàn)兩次以上的，稱之為高頻序列。表2統(tǒng)計了前5 輪出現(xiàn)的高頻序列，從中可看出，前5 輪中，H5 在每一輪都有出現(xiàn)，H1 則出現(xiàn)了4 輪，只在第3 輪沒有出現(xiàn)，H21 出現(xiàn)了3 輪（第1、4、5輪），而H6、H12、H25、H26、H28、H33、H38、H42則都出現(xiàn)了兩輪（第4、5輪），說明這些高頻序列對鰻弧菌有較高的親和特異性或較好的擴(kuò)增性，從而能在各輪的篩選中保留下來成為優(yōu)勢序列，因此這些高頻序列大概率是具有較高親和特異性的核酸適配體序列，后續(xù)則選擇H1、H5、H6、H12、H25、H26、H28、H33、H38 和H42 等10 個序列進(jìn)行親和特異性研究。

Table 2 High frequency sequences in the first 5 rounds of selections

2.3 核酸適配體的親和特異性研究

圖2 顯示了10 個高頻序列（H1、H5、H6、H12、H25、H26、H28、H33、H38、H42）的親和特異性，從中可看出，10 個高頻序列對目標(biāo)菌鰻弧菌的親和力均顯著高于其他5 種非目標(biāo)菌（P<0.01），表明這10個高頻序列對鰻弧菌都具有較好的親和特異性，都是鰻弧菌的核酸適配體。10個核酸適配體對鰻弧菌的親和力從高到低依次為H5、H25、H26、H33、H38、H42、H6、H12、H28、H1，相應(yīng)的親和力大小依次為13.75、11.38、10.10、9.72、9.30、8.61、6.50、5.73、5.31、3.83 mg/L。比較而言，前5 個核酸適配體（H5、H25、H26、H33、H38）對鰻弧菌的親和力是對其他菌的5倍以上，親和特異性更好。而核酸適配體H1 的親和力雖然是最低的，但它在前5 輪中出現(xiàn)了4 輪，僅次于H5，排第二位，說明它在篩選進(jìn)化的競爭中也具有一定的優(yōu)勢，因此后續(xù)研究親和常數(shù)時，我們選擇H1、H5、H25、H26、H33、H38這6個核酸適配體進(jìn)行研究。

Fig.2 Affinities of 10 aptamers（H1，H5，H6，H12，H25，H26，H28，H33，H38 and H42）towards the bacteria V.anguillarum（Van），E.tarda（Et），V.alginolyticus（Val），A.hydrophila（Ah），V.harveyi（Vh）and E.coli（Ec）

2.4 核酸適配體的親和常數(shù)（Kd）和飽和親和力（Am）

對出現(xiàn)頻率較高的核酸適配體H1 以及親和特異性較高的5個核酸適配體H5、H25、H26、H33、H38進(jìn)行了親和常數(shù)（Kd）和飽和親和力（Am）的測定，相應(yīng)的飽和曲線如圖3，親和常數(shù)和最大親和力則匯總在表3 中。從圖3 可以看出，飽和曲線的擬合系數(shù)都在0.95 以上，顯示出較好的擬合效果。6 個核酸適配體的親和常數(shù)Kd在50～350 nmol/L 之間，飽和親和力Am在200～1 000 nmol/L 之間。其中Kd值最大的是H26，最小的是H1，Am值最大的是H5，最小的是H1。

通常，Kd值越低，對靶目標(biāo)的結(jié)合能力就越強(qiáng)；Am越高，說明靶目標(biāo)上的結(jié)合位點就越多，能結(jié)合的核酸適配體數(shù)量就越多。因此，Kd越小，Am越大，核酸適配體最終表現(xiàn)出的親和力就越大。不過，對于同一個核酸適配體，這兩個參數(shù)表現(xiàn)的并不完全一致。如核酸適配體H1，其Kd值較低，說明對鰻弧菌的結(jié)合能力較強(qiáng)，但其Am卻較低，說明鰻弧菌上H1的結(jié)合位點較少，能結(jié)合H1的數(shù)量并不多，因此最終H1 對鰻弧菌的表觀親和力并不高（圖2，H1）；核酸適配體H5，其Kd值較高，說明對鰻弧菌的結(jié)合能力并不強(qiáng)，但其Am較高，說明鰻弧菌上H5 的結(jié)合位點較多，菌上能結(jié)合的H5較多，因此最終體現(xiàn)出H5對靶目標(biāo)鰻弧菌的表觀親和力卻是最高的（圖2，H5）。因此，核酸適配體最終的表觀親和力應(yīng)該是Kd和Am共同作用的結(jié)果，而不能僅僅只看其中一個參數(shù)。

Fig.3 Saturation curves of the affinity constant of aptamers against V.anguillarum

Table 3 Affinity constant（Kd）and maximum affinity（Am）of aptamers against V.anguillarum

2.5 核酸適配體H5結(jié)合蛋白的分離與鑒定

對磁分離后的結(jié)合蛋白樣品進(jìn)行電泳，未洗滌的結(jié)合蛋白樣品有多個蛋白質(zhì)條帶（圖4a 的N 泳道），說明雜蛋白較多；洗滌后的結(jié)合蛋白樣品只在100 ku 和15 ku 附近各有一個較淺的條帶，其他分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)條帶則幾乎都已消失（圖4a 的Y泳道），說明這兩個蛋白質(zhì)可能與核酸適配體H5或者磁珠的結(jié)合較為緊密，并沒有因為洗滌而消失；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，磁珠對照的電泳中也出現(xiàn)了15 ku的條帶，但沒有出現(xiàn)100 ku的條帶（圖4a的MB 泳道），說明100 ku 的蛋白質(zhì)不是磁珠自帶的蛋白質(zhì)，而15 ku的蛋白質(zhì)應(yīng)該是鏈霉親和素磁珠自帶的親和素蛋白，后續(xù)質(zhì)譜鑒定也證實了該15 ku 的蛋白質(zhì)是磁珠的親和素蛋白。由此基本可以確定100 ku 的蛋白質(zhì)很可能是核酸適配體H5 的結(jié)合蛋白。為進(jìn)一步確認(rèn)，我們降低了對結(jié)合蛋白樣品的洗滌力度，得到圖4b 的電泳圖，從中可看出，結(jié)合蛋白樣品經(jīng)過1 次和2 次洗滌后，在100 ku附近仍然有一條較為明顯條帶，而其他分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)條帶幾乎完全消失（圖4b中的1和2泳道），說明該100 ku的蛋白質(zhì)與核酸適配體H5的親和力較高、結(jié)合較為緊密，并沒有因為洗滌而消失，應(yīng)該是核酸適配體H5的結(jié)合蛋白。

對100 ku 的核酸適配體H5 的結(jié)合蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，其可能的候選蛋白如表4所示。由表中可看出，得分最高、匹配度最高的是丙酮酸脫氫酶E1組分，其分?jǐn)?shù)為810分，遠(yuǎn)高于其他蛋白質(zhì)的得分，說明H5 的結(jié)合蛋白最有可能就是鰻弧菌中的丙酮酸脫氫酶E1組分。

Fig.4 PAGE of bacterial protein binding with aptamer H5

Table 4 Possible binding proteins of aptamer H5 analyzed by mass spectrum

2.6 核酸適配體H5與其結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)分析和亞細(xì)胞定位

核酸適配體H5 的主要功能區(qū)是3 個環(huán)，在5′端的環(huán)由9 個核苷酸構(gòu)成，在3′端的環(huán)由6 個核苷酸構(gòu)成，中間的環(huán)較大，由17 個核苷酸組成。如果按照兩個核苷酸的間距為0.34 nm 進(jìn)行粗略估算，則5′端環(huán)的直徑約0.97 nm，中間環(huán)的直徑約1.73 nm，3′端環(huán)的直徑約0.65 nm。由于3′端環(huán)較小，而5′端是與磁珠連接的，因此與結(jié)合蛋白作用的部位很可能是H5 上較大的中間環(huán)（許凈等.海洋與湖沼,2021,52(5):1315?1322）。

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是其氨基酸的組成和排列順序。質(zhì)譜分析表明，核酸適配體H5 的結(jié)合蛋白應(yīng)該是丙酮酸脫氫酶E1 組分。該蛋白的編號為F7YPI5，通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）查詢其一級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白是由891 個氨基酸組成的。

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要有α 螺旋、β 折疊、β 轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲等4種形式。分析表明，該結(jié)合蛋白的891個氨基酸中，有403個氨基酸形成α螺旋，124個氨基酸形成β折疊，97個氨基酸形成β轉(zhuǎn)角，其余267 個氨基酸形成無規(guī)卷曲，4 種二級結(jié)構(gòu)在總氨基酸序列中的占比分別為45.2%、13.9%、10.9%和30.0%。

圖5是該結(jié)合蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖。圖5a的三級結(jié)構(gòu)是按照數(shù)據(jù)庫中評分最高的模板以100%的可信度建立的，用于建模的氨基酸數(shù)目為860個，占總氨基酸數(shù)目的96.5%，圖中顏色由紅→藍(lán)表示的是結(jié)合蛋白的N 端→C 端。圖5b 是在圖5a基礎(chǔ)上采用PyMOL 軟件對其中的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行更為清晰的標(biāo)記和展示，從中可看出紅色的α螺旋占比較高，黃色的β折疊主要處于蛋白質(zhì)的內(nèi)部，綠色的以環(huán)狀形式出現(xiàn)的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)則大多分布在該結(jié)合蛋白的外部。

由于蛋白質(zhì)中α螺旋的結(jié)構(gòu)較為剛性，核酸適配體的結(jié)構(gòu)主要是莖環(huán)等結(jié)構(gòu)，因此核酸適配體與蛋白間的結(jié)合很可能是通過核酸適配體上環(huán)結(jié)構(gòu)套在蛋白質(zhì)中的α螺旋上來實現(xiàn)的。已知一個α螺旋的直徑是1.2 nm，核酸適配體H5 的三個環(huán)中只有中間的大環(huán)可以套在α螺旋上，從蛋白的三維結(jié)構(gòu)上看，圖5 箭頭所指的3 處α 螺旋的結(jié)構(gòu)很可能是與H5 中間環(huán)嵌套結(jié)合或互相作用的區(qū)域。其中，中間和右側(cè)箭頭所指的α?螺旋，由于外圍還有較靈活的無規(guī)卷曲等的二級結(jié)構(gòu)包裹，其與核酸適配體H5中間環(huán)的結(jié)合可能要更緊密些。

Fig.5 Tertiary structure of the protein binding with aptamer H5 and the binding regions（pointed by arrow）

通過在線網(wǎng)站對該核酸適配體結(jié)合蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示該結(jié)合蛋白，即丙酮酸脫氫酶E1 組分有99.7%的可能性是位于鰻弧菌的細(xì)胞質(zhì)中，有0.1%的概率是位于鰻弧菌的質(zhì)膜上。這表明核酸適配體H5能以某種方式進(jìn)入鰻弧菌的內(nèi)部，并與菌內(nèi)的丙酮酸脫氫酶E1組分結(jié)合。

3 討論

SELEX 篩選通常都要經(jīng)過少則5 輪、多則10多輪的篩選，使富集文庫中的核酸適配體得到足夠多的富集后再進(jìn)行測序［21?26］。多輪篩選不僅增加了工作量，而且由于篩選過程中涉及結(jié)合、分離、PCR 等多個步驟，只要有一個步驟出現(xiàn)問題都會導(dǎo)致后續(xù)的篩選失敗，因此大大增加了篩選的難度和風(fēng)險。本文采用“每輪測序”的方法，從第1輪開始就對每輪的篩選產(chǎn)物都進(jìn)行高通量測序，并選擇測序結(jié)果中的高頻序列進(jìn)行研究，結(jié)果表明，有較高親和力的核酸適配體H1和H5在第一輪的高頻序列中就已呈現(xiàn)出來，因此理論上只需一輪的篩選和測序就可獲得相應(yīng)的核酸適配體序列，這極大地提高了篩選的效率；而且該方法對篩選富集的要求大大降低了，只要有少許富集，就能在測序結(jié)果中的高頻序列上體現(xiàn)出來，即使富集文庫整體的親和力并沒有上升，也能獲得預(yù)期的核酸適配體序列。比如本文的第1輪篩選，篩選產(chǎn)物的親和力是非常低的，但高通量測序卻發(fā)現(xiàn)其中已經(jīng)有了5個高頻序列，而親和力較高的核酸適配體H1和H5在第一輪測序中就已經(jīng)被挖掘出來了。因此，通過這種“每輪測序”并聚焦高頻序列的方法，可以快速發(fā)現(xiàn)核酸適配體的候選序列，大大提高了篩選效率。當(dāng)然，雖然理論上只要進(jìn)行一輪的篩選和測序就有可能獲得期望的核酸適配體序列，但為保險起見，進(jìn)行3～5輪的篩選和高通量測序，選擇多輪次出現(xiàn)的高頻序列作為核酸適配體的候選序列進(jìn)行驗證分析，應(yīng)該是一種較為穩(wěn)妥可靠的策略。

有關(guān)高頻序列的親和力問題，不同學(xué)者的研究結(jié)果似乎并不一致。Jing 等［25］篩選硼酸鈉的核酸適配體時發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)頻率最高的兩個核酸適配體，它們的親和力也是最高的；Lu 等［13］的SELEX 篩選也是優(yōu)先選擇測序中出現(xiàn)頻率較高的序列進(jìn)行研究的；不過，Zhang 等［14］分析腸炎沙門氏菌的核酸適配體時發(fā)現(xiàn)，頻率最高的序列，其親和力卻比較低；Stuart 等［27］篩選一種蛋白質(zhì)的核酸適配體時也發(fā)現(xiàn)，頻率最高的S1 序列，其親和力卻是最差的；還有學(xué)者認(rèn)為，一些親和力相對較低、但容易擴(kuò)增的序列，經(jīng)過多次PCR后會成為高頻序列，而一些親和力高但不易擴(kuò)增的序列則可能隨著篩選的進(jìn)行而不斷丟失，最后可能被淘汰或成為低頻序列［28］。我們認(rèn)為，少數(shù)高頻序列的親和力不高是正常的現(xiàn)象，因為核酸適配體篩選進(jìn)化中存在兩種策略，一種是以高親和力為主的策略，一種是以高擴(kuò)增性為主的策略。如果某些高頻序列是通過后一種進(jìn)化策略得到的，則其親和力不高是完全可能的，但還有相當(dāng)多的高頻序列是通過高親和力為主的策略得到的，有些可能是兩種策略兼有的，這些高頻序列則大概率都是有較高親和力的核酸適配體。我們的前期研究也表明，高頻序列大多都是親和特異性較好的序列［18］。本文的研究也表明10個高頻序列中有9個對目標(biāo)菌的親和力是較高的。因此，從高頻序列中找到高親和力核酸適配體的概率是相當(dāng)高的。更關(guān)鍵的是，高頻序列在總序列中的占比通常都是很低的，因此，從高頻序列中挑選候選序列進(jìn)行驗證能極大提高篩選驗證的效率，大大節(jié)約篩選驗證的成本。當(dāng)然，選擇高頻序列，不可避免的會失去那些只出現(xiàn)一次、但卻有較高親和力的序列。不過這種舍棄應(yīng)該是值得的，因為舍棄的只是出現(xiàn)頻率較低、擴(kuò)增性較差的高親和力序列，大量高頻、擴(kuò)增性較好的高親和力序列仍然在候選序列庫中，而且這個舍棄能換來篩選驗證效率的大幅提升和成本的大幅下降，完全是值得的。

在核酸適配體的研究方面，通常對其親和力的主要評價參數(shù)是親和常數(shù)Kd，而對飽和親和力參數(shù)Am則較少涉及和關(guān)注［29?31］。本文則發(fā)現(xiàn)最終的表觀親和力A不僅與Kd有關(guān)，還與Am密切相關(guān)。根據(jù)公式，表觀親和力，其中［Apt］是適配體的濃度，核酸適配體最終的表觀親和力應(yīng)該是Kd和Am這兩個參數(shù)共同作用的結(jié)果。因此，單純根據(jù)Kd值來判斷適配體的表觀親和力是不全面的。從前面親和特異性的研究中也可以看出，Kd值較低、單位結(jié)合能力較高的核酸適配體H1，由于Am較低的原因，其最終的表觀親和力并不高；而Kd值較高、單位結(jié)合力較低的核酸適配體H5，因為其Am較高，最終的表觀親和力卻是最大的，說明Am在核酸適配體表觀親和力中的影響不僅不能忽略，有時Am影響甚至超過了Kd，起到了主要作用。

有關(guān)核酸適配體的結(jié)合蛋白，從已有的報道來看，以細(xì)胞表面的膜蛋白居多［15，32?34］。不過，Zhang 等［35］研究發(fā)現(xiàn)，核酸適配體是能夠進(jìn)入小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，并與解旋酶、GTP 酶、被膜蛋白復(fù)合物等蛋白質(zhì)結(jié)合的，并推測核酸適配體有可能是先結(jié)合到細(xì)胞表面的膜蛋白，再通過胞吞作用進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部，與上述胞內(nèi)蛋白結(jié)合的；Yu等［15?17］的研究也認(rèn)為，核酸適配體應(yīng)該是先與膜蛋白結(jié)合，再通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的。因此，本研究中的核酸適配體H5 很可能也是先與鰻弧菌表面的某種蛋白質(zhì)結(jié)合，再通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，與細(xì)胞質(zhì)中的丙酮酸脫氫酶E1 組分結(jié)合。另外，亞細(xì)胞定位顯示，鰻弧菌的質(zhì)膜上也有可能分布有少量的丙酮酸脫氫酶E1 組分，因此鰻弧菌表面首先與核酸適配體H5 結(jié)合的蛋白質(zhì)也有可能就是丙酮酸脫氫酶E1 組分及其類似物。當(dāng)然，這些推理猜測還需要進(jìn)一步的實驗驗證。但可以明確的是，核酸適配體能夠以胞吞等形式進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部與其靶標(biāo)分子結(jié)合，這個結(jié)合有可能會對細(xì)菌的生長、代謝產(chǎn)生影響。這也為新型核酸適配體藥物的開發(fā)提供了一個新的思路。

4 結(jié)論

本文采用每輪測序的篩選策略，選擇其中出現(xiàn)輪數(shù)較多、頻率較高的高頻序列作為核酸適配體的候選序列，建立了一種快速篩選核酸適配體的方法，獲得了一系列對靶目標(biāo)鰻弧菌有較好親和特異性的核酸適配體（H1、H5、H6、H12、H25、H26、H28、H33、H38 和H42），并重點研究和測定了其中6 個核酸適配體（H1、H5、H25、H26、H33、H38）的親和常數(shù)Kd和最大親和力Am，結(jié)果發(fā)現(xiàn)核酸適配體最終的表觀親和力是Kd和Am共同作用的結(jié)果。通過磁分離技術(shù)和PAGE分離得到了核酸適配體H5 的結(jié)合蛋白，質(zhì)譜鑒定表明該結(jié)合蛋白為鰻弧菌細(xì)胞質(zhì)中的丙酮酸脫氫酶E1 組分，該蛋白質(zhì)中的α螺旋在總氨基酸序列中的占比高達(dá)45.2%，β 折疊主要位于該蛋白質(zhì)內(nèi)部，二者共同構(gòu)成了該結(jié)合蛋白的主要骨架，而環(huán)狀的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)則主要分布在該蛋白質(zhì)外部。核酸適配體能夠以胞吞等形式進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部與其靶標(biāo)分子結(jié)合，這也為鰻弧菌病害防治及新型核酸適配體藥物的開發(fā)提供了一個新的思路。