甘露糖蛋白對(duì)‘赤霞珠’葡萄酒中糖酸和香氣的影響

荊思思，倪小凡，王 庶，樂(lè)小鳳，房玉林，2，鞠延侖，2*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.合陽(yáng)葡萄試驗(yàn)示范站，陜西 合陽(yáng) 715300）

擁有良好感官品質(zhì)，是一款葡萄酒被消費(fèi)者接受的必要條件。而葡萄酒的感官品質(zhì)中較為重要的是糖酸平衡和香氣呈現(xiàn)[1]。糖在葡萄果實(shí)發(fā)育階段積累，其作為葡萄酒中重要的呈味物質(zhì)，對(duì)葡萄酒感官質(zhì)量有重要影響[2]。葡萄酒中過(guò)多的糖殘留，可能會(huì)導(dǎo)致葡萄酒口感失衡或引發(fā)微生物污染[3-4]。葡萄酒中的有機(jī)酸分別來(lái)源于葡萄果實(shí)和釀造過(guò)程，是葡萄酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，低含量的有機(jī)酸有利于豐富葡萄酒口感[5]，含量過(guò)高易使葡萄酒表現(xiàn)酸澀和粗硬等不良特征。葡萄酒中的香氣來(lái)源于葡萄果實(shí)中的風(fēng)味前體物質(zhì)和發(fā)酵過(guò)程[6]。以上物質(zhì)在葡萄酒釀造過(guò)程中容易受到外來(lái)微生物污染、環(huán)境溫度變化等影響，導(dǎo)致葡萄酒感官品質(zhì)下降。甘露糖蛋白用于葡萄酒釀造過(guò)程，可抵御外界環(huán)境的不良影響，改善葡萄酒口感，增加香氣復(fù)雜度和濃郁度等[7-8]，從而改良葡萄酒感官品質(zhì)。

甘露糖蛋白作為酵母自溶產(chǎn)物，可顯著改善葡萄酒品質(zhì)，同時(shí)不會(huì)對(duì)葡萄酒產(chǎn)生不良影響?，F(xiàn)有國(guó)內(nèi)外的研究主要著眼于向葡萄酒發(fā)酵過(guò)程以及陳釀階段添加甘露糖蛋白研究其對(duì)葡萄酒花青素、單寧、多酚類物質(zhì)以及顏色穩(wěn)定性等的影響[9-12]，忽略了發(fā)酵前向葡萄汁中添加甘露糖蛋白對(duì)葡萄酒感官品質(zhì)影響，而對(duì)感官品質(zhì)影響巨大的單糖、有機(jī)酸以及香氣物質(zhì)來(lái)源于葡萄果實(shí)和釀造過(guò)程。鑒于此，該研究推測(cè)分別向酒精發(fā)酵前的葡萄汁和酒精發(fā)酵完成后的葡萄酒中添加甘露糖蛋白可能對(duì)葡萄酒的感官品質(zhì)會(huì)產(chǎn)生不同的影響。因此該試驗(yàn)設(shè)計(jì)探究在酒精發(fā)酵前后分別添加不同濃度甘露糖蛋白對(duì)葡萄酒中單體糖、有機(jī)酸以及香氣等物質(zhì)含量的影響，以期為葡萄酒廠在為改善‘赤霞珠’葡萄酒感官品質(zhì)方面選擇甘露糖蛋白的添加時(shí)期和添加量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘赤霞珠’葡萄：寧夏立蘭酒莊；甘露糖蛋白、酵母：法國(guó)LALLEMANT公司；硫酸銅（CuSO4·5H2O）、酒石酸鉀鈉（C4HKNaO6·4H2O）、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、葡萄糖等（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；果糖、葡萄糖、2-辛醇、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸：美國(guó)Sigma公司；乙腈（色譜純）：美國(guó)ACS試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本島津公司；TRACE DSQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：美國(guó)THERMO Fisher公司；萃取纖維CAR/DVB/PDMS（50 μm/30 μm萃取頭）：美國(guó)Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒制作工藝與操作要點(diǎn)

以歐亞種釀酒葡萄‘赤霞珠’為試材，當(dāng)總糖含量達(dá)到230～240 g/L時(shí)采收，‘赤霞珠’酒樣均采用傳統(tǒng)工藝釀造。具體工藝流程如下：

酒精發(fā)酵前添加甘露糖蛋白處理：葡萄分選，除梗破碎→入100 L發(fā)酵罐，分組編號(hào)→添加50 mg/L二氧化硫，30 mg/L果膠酶，200 mg/L酵母以及分別添加0、0.1 g/L、0.3 g/L甘露糖蛋白，啟動(dòng)酒精發(fā)酵（溫度控制在（25±1）℃）→發(fā)酵結(jié)束，比重在0.992～0.996間且殘?zhí)橇俊? g/L時(shí)，皮渣分離→自然啟動(dòng)蘋果酸-乳酸發(fā)酵（利用紙層析法監(jiān)控發(fā)酵進(jìn)程）→發(fā)酵完全→轉(zhuǎn)罐分酒→添加30～40 mg/L二氧化硫→20 ℃條件下瓶?jī)?chǔ)12個(gè)月。

酒精發(fā)酵后添加甘露糖蛋白處理：收集酒精發(fā)酵完全的未經(jīng)甘露糖蛋白處理的‘赤霞珠’干紅葡萄酒，分組編號(hào)→分別添加0.1 g/L、0.3 g/L甘露糖蛋白→倒罐→自然啟動(dòng)蘋果酸-乳酸發(fā)酵（利用紙層析法監(jiān)控發(fā)酵進(jìn)程）→發(fā)酵完全→轉(zhuǎn)罐分酒→添加30～40 mg/L二氧化硫→20 ℃條件下瓶?jī)?chǔ)12個(gè)月。

1.3.2 酒樣處理方式

根據(jù)已有的研究，在探究甘露糖蛋白對(duì)葡萄酒質(zhì)量的影響時(shí)，其常用的質(zhì)量濃度通常為0.1 g/L、0.2 g/L、0.25 g/L和0.3 g/L，同時(shí)在濃度介于0.1 g/L和0.3 g/L之間的處理中可以看到最積極的效果[13-14]。因此，試驗(yàn)選擇甘露糖蛋白的濃度為0.1 g/L和0.3 g/L。為使葡萄酒充分展現(xiàn)果香和醇香，獲得飽滿優(yōu)雅的口感，試驗(yàn)選擇瓶?jī)?chǔ)12個(gè)月后進(jìn)行指標(biāo)分析和感官品鑒，酒樣處理方式詳見(jiàn)表1。

表1 酒樣處理方式Table 1 Treatment mode of wine samples

1.3.3 葡萄酒常規(guī)理化指標(biāo)測(cè)定

理化指標(biāo)測(cè)定參照王華[15]的方法，用斐林試劑熱滴定法測(cè)定還原糖質(zhì)量濃度；用酸堿滴定法測(cè)定總酸質(zhì)量濃度；使用pH計(jì)測(cè)定pH值。

1.3.4 葡萄酒中單體糖的測(cè)定[16]

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取果糖和葡萄糖（分析純）0.500 g，加入5 mL容量瓶中，純水溶解并定容，得100 g/L可溶性糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次用2.0、2.5、5.0、10.0倍純水稀釋配成50 g/L、40 g/L、20 g/L、10 g/L可溶性糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后放入樣品瓶中，備用。

樣品處理：各葡萄酒樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后用無(wú)菌注射器打入1.5 mL進(jìn)樣瓶中，采用HPLC進(jìn)行測(cè)定。

色譜條件：以ZORBAXSB-C18（4.6mm×250mm，5μm）為色譜柱參數(shù)；流動(dòng)相為乙腈-水（75∶25，V/V）；流速1.0mL/min；柱溫40 ℃；以示差檢測(cè)器為測(cè)器；進(jìn)樣量10 μL；分析時(shí)間為20 min。

1.3.5 葡萄酒中有機(jī)酸的測(cè)定[16]

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：分別準(zhǔn)確稱取酒石酸、L-蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸0.100 g于5 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容，得到20 g/L有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液依次用流動(dòng)相稀釋配成1.000 g/L、0.500 g/L、0.250 g/L、0.125 g/L的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后放入樣品瓶中，備用。

樣品處理：各葡萄酒樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后用無(wú)菌注射器打入1.5 mL進(jìn)樣瓶中，采用HPLC進(jìn)行測(cè)定。

色譜條件：以HypersilGOLDaQ（250mm×4.6mm，5μm）為色譜柱；流動(dòng)相為0.01 mol/L磷酸氫二鉀溶液（pH 2.2）；流速0.5 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；波長(zhǎng)210 nm；分析時(shí)間30 min。

1.3.6 葡萄酒中香氣成分的測(cè)定[17]

用頂空固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）提取葡萄酒樣品中的香氣物質(zhì)，采用GC-MS分析香氣組分的質(zhì)量濃度。

SPME方法：吸取8 mL酒樣（含10 μL 2-辛醇）加入15 mL裝有磁力攪拌子的頂空瓶中，加入2.0 g NaCl；將頂空瓶放入電磁攪拌器中，40 ℃條件下水浴平衡15 min；在頂空瓶中插入萃取纖維CAR/DVB/PDMS，于40 ℃條件下吸附30min，立即將萃取頭插入GC進(jìn)樣口解吸8 min，進(jìn)行GC-MS分析。

GC-MS條件：無(wú)分流進(jìn)樣；DB-WAX色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；以高純氦氣（He）為載氣；流速1 mL/min；柱溫從40 ℃以4 ℃/min升至160 ℃，隨后從160 ℃以7 ℃/min升至230℃，保持8min；連接桿溫度230℃；離子源溫度230℃；電子能量70 eV；燈絲電流0.2 mA；檢測(cè)器電壓350 V。質(zhì)譜掃描為全掃描，范圍為33～450 amu，掃描速率1次/s。

1.3.7 葡萄酒的感官品評(píng)

葡萄酒的感官品評(píng)參照美國(guó)葡萄酒協(xié)會(huì)（American Wine Society，AWS）的葡萄酒品嘗表，組織10人的感官品嘗小組。特別地，使用葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)味感物質(zhì)和香氣物質(zhì)對(duì)品嘗小組成員的味覺(jué)和嗅覺(jué)進(jìn)行強(qiáng)化訓(xùn)練。品嘗小組對(duì)5種酒樣酒樣分別從外觀、香氣、口感和結(jié)構(gòu)、余味以及整體印象五個(gè)方面進(jìn)行打分評(píng)定，統(tǒng)計(jì)品評(píng)小組成員給出的各指標(biāo)的分?jǐn)?shù)，計(jì)算每個(gè)指標(biāo)的平均值后統(tǒng)計(jì)總分（滿分20分）。

表2 葡萄酒的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of wine

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次，數(shù)據(jù)用Microsoft Office 2010和SPSS Statistics 26.0軟件（鄧肯檢驗(yàn)方法）進(jìn)行分析，所有測(cè)定結(jié)果分析中應(yīng)用的顯著性水平為P＜0.05。單體糖、有機(jī)酸和香氣數(shù)據(jù)處理：采用對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間的方法定性，曲線法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)葡萄酒常規(guī)理化指標(biāo)的影響

甘露糖蛋白作用于蘋果酸-乳酸發(fā)酵過(guò)程，影響葡萄酒中蘋果酸和乳酸的含量[18]，從而改變可滴定酸的含量。由于甘露糖蛋白本身是多糖物質(zhì)，可能會(huì)增加酒精產(chǎn)品的糖含量[14]。甘露糖蛋白對(duì)葡萄酒總酸、還原糖、pH的影響見(jiàn)表3。

表3 甘露糖蛋白不同添加方式對(duì)葡萄酒理化指標(biāo)的影響Table 3 Effect of mannoprotein addition way on the physicochemical characteristics of wine

由表3可知，添加甘露糖蛋白，使‘赤霞珠’葡萄酒中總酸含量與對(duì)照組酒樣相比均降低，其中，AF0.3組降低最多，顯著降低3.2%（P＜0.05）；pH值提高，除BF0.1組樣品還原糖含量降低2.8%外，其余組還原糖含量均增加。而本研究中BF0.1組還原糖含量降低的機(jī)理尚不明確，需要進(jìn)一步的研究。因此，除BF0.1組外，添加甘露糖蛋白可以增加還原糖的含量，降低總酸含量，增加pH值。

2.2 對(duì)葡萄酒單體糖和有機(jī)酸的影響

過(guò)多果糖（＞2 g/L）殘留在葡萄酒中，可能會(huì)存在葡萄酒口感失衡和引發(fā)微生物污染的危險(xiǎn)[3，4]。低含量的有機(jī)酸有利于豐富葡萄酒口感[5]，其中，蘋果酸含量較高則會(huì)有稍帶苦的特殊香味[19]，對(duì)葡萄酒口感的影響較大，葡萄酒中蘋果酸的含量一般在0.766～2.083 g/L[20]；酒石酸不僅對(duì)葡萄酒pH值的高低有影響[21]，對(duì)葡萄酒的口感和穩(wěn)定性也均有一定影響，葡萄酒中酒石酸的含量一般為1.615～3.215 g/L[22]；琥珀酸的味既酸又苦，是葡萄酒中味覺(jué)反映最明顯的一種酸[22]，葡萄酒中琥珀酸的含量一般在0.033～0.833 g/L[21]，琥珀酸含量少，苦味越少。當(dāng)葡萄酒中蘋果酸、酒石酸和琥珀酸的含量過(guò)大時(shí)，葡萄酒的口感將變得粗糙且伴有澀感[23]，使葡萄酒感官品質(zhì)下降。甘露糖蛋白可降低葡萄酒中蘋果酸和乳酸的含量[18]。甘露糖蛋白對(duì)葡萄酒單體糖和有機(jī)酸的影響見(jiàn)表4。

由表4可知，發(fā)酵前添加甘露糖蛋白果糖含量顯著增加（P＜0.05），其中BF0.3組中果糖含量對(duì)照組酒樣相比增加49.5%。李影[24]的研究中得出，甘露糖蛋白中的D-甘露糖可與D-果糖發(fā)生可逆異構(gòu)化反應(yīng)，由此發(fā)酵前向酒樣中添加甘露糖蛋白可增加果糖含量，從陳瑩等[25]的研究中發(fā)現(xiàn)低葡萄糖-果糖比可使發(fā)酵進(jìn)行緩慢，甚至出現(xiàn)發(fā)酵停止，使得發(fā)酵前添加甘露糖蛋白的酒樣發(fā)酵緩慢，從而積累比對(duì)照組更多的果糖。而發(fā)酵后添加甘露糖蛋白果糖含量顯著減少（P＜0.05），AF0.1和AF0.3組中果糖含量分別減少17.5%和20.7%。此外，添加甘露糖蛋白的酒樣中葡萄糖含量均增加，可能是由于甘露糖蛋白具有增加葡萄酒糖含量的效用[14]。

表4 甘露糖蛋白的添加對(duì)單體糖和有機(jī)酸含量的影響Table 4 Effect of mannoprotein addition on the contents of monomer sugars and organic acids

各‘赤霞珠’酒樣中，存在酒石酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸五種有機(jī)酸單體，含量最多的是蘋果酸，其次是酒石酸和琥珀酸。發(fā)酵前添加甘露糖蛋白主要增加了蘋果酸和酒石酸的含量，其中BF0.1 組中蘋果酸和酒石酸分別增加3.2%和6.2%；BF0.3組中蘋果酸含量增加17.5%。酒石酸含量增加，可能是由于甘露糖蛋白可以阻止酒石酸晶核的結(jié)合，從而減少了酒石酸的析出，使其含量增加[26-27]；而蘋果酸含量增加與已有研究結(jié)論不符[14，20]，說(shuō)明發(fā)酵前添加甘露糖蛋白可能對(duì)葡萄酒發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生了不利影響。發(fā)酵后添加甘露糖蛋白除乳酸含量增加外，其余各類有機(jī)酸含量均有所降低，其中AF0.1組中蘋果酸和酒石酸顯著降低6.8%和11.7%（P＜0.05）；AF0.3組蘋果酸和酒石酸分別降低4.4%和8.4%，乳酸含量增加10.6%。

因此發(fā)酵后添加甘露糖蛋白（特別是添加0.1 g/L），果糖、蘋果酸、酒石酸以及琥珀酸含量均顯著減少，使酒體更加穩(wěn)定，減少了葡萄酒的酸澀感，使口感更加協(xié)調(diào)。

2.3 對(duì)葡萄酒香氣物質(zhì)的影響

甘露糖蛋白對(duì)葡萄酒主要香氣物質(zhì)的影響見(jiàn)表5。

表5 甘露糖蛋白對(duì)葡萄酒香氣成分質(zhì)量濃度的影響Table 5 Effect of mannoprotein on mass concentration of wine aroma components

續(xù)表

由表5可知，5種酒樣中檢測(cè)出多種香氣類物質(zhì)，其中包括酯類、酸類、醇類及其他。發(fā)酵前添加甘露糖蛋白的酒樣中，BF0.1組中OAV＞1的香氣組分一共有8組，OAV在0.1～1范圍的香氣組分有8組，且各香氣組分均減少，而B(niǎo)F0.3組中OAV＞1的香氣組分有6組，OAV在0.1～1范圍的香氣組分有11組，且除醇類香氣組分增加外，其他香氣組分均減少。說(shuō)明發(fā)酵前向‘赤霞珠’酒樣中添加甘露糖蛋白對(duì)于酒樣的香氣濃郁度無(wú)明顯貢獻(xiàn)。發(fā)酵后添加甘露糖蛋白的酒樣中，OAV＞1的香氣組分一共有4組，OAV在0.1～1范圍的香氣組分有13組，且乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二乙酯、3-甲基-1-丁醇增加得較為顯著。其中AF0.1組中乙酸乙酯質(zhì)量濃度與對(duì)照組相比增加了7.4倍、己酸乙酯增加約1.8倍、辛酸乙酯增加約1.8倍、3-甲基-1-丁醇增加約1.8倍；AF0.3組中上述四種物質(zhì)分別增加了6.0、2.2、2.2和1.9倍。此外，丁二酸二乙酯為對(duì)照組沒(méi)有的香氣物質(zhì)。

因此，發(fā)酵后添加甘露糖蛋白（特別是添加0.3 g/L），有助于提高酒樣中酯類、醇類等香氣組分的質(zhì)量濃度，增加‘赤霞珠’葡萄酒香氣的濃郁度；而增加了丁二酸二乙酯這種具有蘋果香等愉快水果類香氣的物質(zhì)則有助于增加葡萄酒香氣的復(fù)雜度。

2.4 對(duì)葡萄酒感官品質(zhì)的影響

五種酒樣的感官品評(píng)得分和雷達(dá)圖結(jié)果分別見(jiàn)表6和圖1。結(jié)果表明，發(fā)酵前添加甘露糖蛋白的酒樣中，BF0.1組和BF0.3組外觀、香氣、口感和結(jié)構(gòu)、余味以及整體印象的得分均下降，說(shuō)明向酒精發(fā)酵前的葡萄汁中添加甘露糖蛋白對(duì)于葡萄酒的感官質(zhì)量具有負(fù)面的影響。發(fā)酵后添加甘露糖蛋白的酒樣中，各感官指標(biāo)的得分均有不同程度的提高，其中，AF0.3組酒樣的總分最高，其外觀、香氣、口感和結(jié)構(gòu)以及整體印象的感官評(píng)分也較高，而AF0.1組的香氣評(píng)分也較其他組略髙。由此可見(jiàn)，添加甘露糖蛋白可以改變葡萄酒的感官質(zhì)量，其中酒精發(fā)酵后以0.3 g/L的劑量添加時(shí)改善葡萄酒感官質(zhì)量的效果最為顯著。

表6 五種酒樣的感官品評(píng)得分Table 6 Sensory evaluation scores of five wine samples

圖1 五種酒樣感官品評(píng)結(jié)果雷達(dá)圖Fig.1 Radar chart of sensory evaluation results of five kinds of wine samples

3 結(jié)論

總體來(lái)說(shuō)，酒精發(fā)酵后添加甘露糖蛋白有利于改善‘赤霞珠’葡萄酒的感官質(zhì)量，而酒精發(fā)酵前向酒樣中添加甘露糖蛋白則會(huì)起到相反效果。酒精發(fā)酵后添加甘露糖蛋白的酒樣中，果糖含量以及蘋果酸、酒石酸等風(fēng)味表現(xiàn)不佳的有機(jī)酸含量顯著降低，酯類、醇類等香氣組分的質(zhì)量濃度有所提高，并增加了丁二酸二乙酯這種對(duì)照組所沒(méi)有的令人愉快的香氣物質(zhì)，有利于維持葡萄酒糖酸平衡，穩(wěn)定酒體，使葡萄酒口感更佳，同時(shí)賦予了葡萄酒更多愉悅的香氣，增加了葡萄酒香氣濃郁度和復(fù)雜度。