高溫大曲中高產(chǎn)吡嗪類物質(zhì)芽孢桿菌的篩選與應(yīng)用

梁慧珍，盧延想，劉 正，陳 鵬，2，張長(zhǎng)霞，李細(xì)芬，秦培軍

（1.貴州國(guó)臺(tái)酒業(yè)集團(tuán)股份有限公司，貴州 仁懷 564501；2.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457）

醬香型白酒是中國(guó)傳統(tǒng)蒸餾酒[1]，因醬香突出、幽雅細(xì)膩廣受市場(chǎng)歡迎[2]。醬香型白酒風(fēng)格離不開(kāi)其獨(dú)特的高溫制曲工藝[3]，大曲為白酒釀造提供了功能微生物菌群以及白酒風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)[4]。此外大曲中富含的酶系也促進(jìn)了白酒的釀造及風(fēng)味物質(zhì)的積累，因此大曲的質(zhì)量直接決定了白酒的產(chǎn)量與質(zhì)量[5-7]。大曲微生物主要包括細(xì)菌[8]、酵母菌[9]和霉菌[10]，其中細(xì)菌是高溫大曲的生香動(dòng)力，能夠利用小麥、高粱等原料代謝生成吡嗪類、酸類、芳香族類物質(zhì)，同時(shí)也是醬香風(fēng)味的來(lái)源[11]。芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）是高溫大曲中的主要優(yōu)勢(shì)菌[12-14]。吡嗪類物質(zhì)作為白酒中的健康因子，是醬香型白酒中的關(guān)鍵香氣物質(zhì)，其含量要遠(yuǎn)高于其他香型白酒，具有烘焙香、堅(jiān)果香氣[15-16]。

芽孢桿菌是代謝吡嗪的主要微生物，同時(shí)也能夠生成多種促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)代謝的酶。GHA B等[17]將貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）應(yīng)用于強(qiáng)化大曲，分別對(duì)大曲微生物群落、酶活性和揮發(fā)性化合物進(jìn)行了檢測(cè)分析。結(jié)果表明強(qiáng)化大曲相比傳統(tǒng)大曲，芽孢桿菌（Bacillus）、乳酸菌、假絲酵母（Candida oleophila）的豐度升高，吡嗪類、醇類和酯類物質(zhì)顯著增加，其中四甲基吡嗪和苯乙醇含量分別提高了91%和70%。ZHANG R等[18]篩選出兩株高產(chǎn)吡嗪類、酸類、芳香族化合物的地衣芽孢桿菌，并且固態(tài)發(fā)酵的風(fēng)味物質(zhì)含量要高于液態(tài)發(fā)酵，將兩株芽孢桿菌應(yīng)用于白酒釀造中。結(jié)果表明，接種量為1%的酒樣感官評(píng)價(jià)要明顯高于對(duì)照組，并且揮發(fā)性化合物的含量也要高于對(duì)照組。因此，芽孢桿菌菌劑能夠應(yīng)用于大曲生產(chǎn)和白酒釀造，從而改善醬香型大曲和白酒的風(fēng)味。

本研究從大曲中篩選高產(chǎn)吡嗪類物質(zhì)的菌株，采用高溫培養(yǎng)初篩和固態(tài)發(fā)酵復(fù)篩，結(jié)合頂空固相微萃取及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌代謝產(chǎn)物，從高溫大曲中篩選出高產(chǎn)吡嗪細(xì)菌并應(yīng)于大曲生產(chǎn)。使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測(cè)強(qiáng)化大曲中吡嗪類物質(zhì)含量，探究在大曲生產(chǎn)上的應(yīng)用效果，對(duì)于解析菌株代謝、提升大曲吡嗪含量具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

9種吡嗪類物質(zhì)（2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、5-乙基-2,3-二甲基吡嗪）標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

高溫大曲：貴州國(guó)臺(tái)酒業(yè)公司。采用九點(diǎn)取樣法收集出倉(cāng)大曲的一次翻倉(cāng)曲、二次翻倉(cāng)曲、出倉(cāng)曲樣品，粉粹后過(guò)40目篩，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：稱取5 g牛肉膏、蛋白胨5 g、NaCl 2.5 g，加入500 mL蒸餾水。121 ℃滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入10 g瓊脂粉。

細(xì)菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：粉碎后小麥和水按照料液比1∶1（g∶mL）混勻后浸潤(rùn)8 h，在電鍋甑上敞口蒸40 min，冷卻后打散，按100 g/瓶分裝至250 mL三角瓶，滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-S26電熱恒溫水浴鍋：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；BX53生物顯微鏡：日本OLYMPUS公司；Allegra 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Beckman Coulter公司；SHP-250B生化培養(yǎng)箱：天津市實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；T100聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)BIO-RAD公司；TRACE1310-ISQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；AB5000三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀：美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 高產(chǎn)吡嗪菌株的初篩

準(zhǔn)確稱取25g不同發(fā)酵階段的醬香大曲分別置于225mL生理鹽水（0.9%NaCl）中，150 r/min室溫?fù)u床30 min，使樣品與水充分混合，靜置后取上清液1 mL置于9 mL無(wú)菌水試管中，得到10-1的稀釋液，以此類推制成梯度稀釋液。吸取0.1 mL梯度稀釋液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板進(jìn)行初步分離，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。根據(jù)稀釋涂布平板上的單菌菌落特征，挑取形態(tài)不同的菌株在平板上劃線純化3～4次，得到單菌落后接于斜面?zhèn)溆谩?/p>

將分離純化后的菌株接于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，50 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～3 d，觀察菌落生長(zhǎng)狀況，挑選生長(zhǎng)良好的菌株進(jìn)行下一步復(fù)篩。

1.3.2 高產(chǎn)吡嗪菌株的固態(tài)發(fā)酵復(fù)篩

將初篩株細(xì)菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床150 r/min培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)好的菌液以10%接種量（10 mL）接入裝有100 g細(xì)菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，用8層紗布封口。將三角瓶置于高溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行梯度升溫培養(yǎng)，35～40～45～50～55～60 ℃每個(gè)梯度培養(yǎng)1 d[19]。每個(gè)樣做3個(gè)平行，空白對(duì)照是加入10 mL空白菌液。發(fā)酵結(jié)束后，5名專業(yè)品評(píng)人員分別從外觀色澤、香氣進(jìn)行感官聞香評(píng)價(jià)，從醬香、酸味、雜味等指標(biāo)給出綜合評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)，滿分為10分。

采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)菌株代謝產(chǎn)物和出倉(cāng)大曲的揮發(fā)性香氣化合物進(jìn)行檢測(cè)。取2 g菌株發(fā)酵產(chǎn)物或大曲于頂空瓶中，加入10 mL飽和氯化鈉溶液，再加入100 mg/L乙酸薄荷酯內(nèi)標(biāo)20 μL。HS-SPME條件：頂空瓶置于50 ℃水浴中萃取30 min后插入進(jìn)樣口熱解吸3 min。GC條件：采用HP-FFAP石英毛細(xì)管柱（50 m×0.20 mm×0.33 μm）；升溫條件：柱溫箱溫度50 ℃保持3 min，以3 ℃/min升溫至170 ℃，再以6 ℃/min 升溫至230 ℃保持5 min，總檢測(cè)時(shí)間50 min；載氣為氦氣（He）（純度＞99.99%），流速1.5 mL/min；分流比設(shè)為不分流；溶劑延遲4 min。MS條件：采用電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度250 ℃，傳輸線溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍30～550 amu。未知化合物經(jīng)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）11.0譜庫(kù)檢索，選取匹配度＞800的物質(zhì)，采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算化合物的含量。

1.3.3 高產(chǎn)吡嗪菌株的鑒定

對(duì)復(fù)篩得到的菌株接種于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，革蘭氏染色后進(jìn)行顯微鏡鏡檢。

按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取菌株基因組DNA，采用細(xì)菌通用引物27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對(duì)16S rRNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物送至華大基因股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中與已知序列進(jìn)行比對(duì)，選取基因序列同源性較高的相關(guān)細(xì)菌菌株的16S rRNA區(qū)域序列作為參比對(duì)象，用MEGA7.0進(jìn)行相似性分析并用鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.4 高產(chǎn)吡嗪菌株在大曲中的應(yīng)用

將篩得的高產(chǎn)吡嗪細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基活化并培養(yǎng)1 d至108CFU/mL，固態(tài)菌劑組是將種子液接入滅菌小麥培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫靜置發(fā)酵7 d，發(fā)酵結(jié)束后接入生曲中，再加入7%母曲；液態(tài)菌劑組是將種子液擴(kuò)培后直接將菌液接入生曲中，再加入7%母曲；以曲房中不接菌劑的普通大曲作為對(duì)照組。每種菌劑做5個(gè)平行，待發(fā)酵結(jié)束后取樣。設(shè)置兩種菌劑方式目的是考察固態(tài)菌劑強(qiáng)化大曲和液態(tài)菌劑強(qiáng)化大曲差異，固態(tài)菌劑和液態(tài)菌劑強(qiáng)化大曲流程如下：

1.3.5 強(qiáng)化大曲吡嗪類物質(zhì)的測(cè)定

采用UPLC-MS/MS對(duì)強(qiáng)化大曲的吡嗪類化合物進(jìn)行定性和定量分析。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：用萬(wàn)分之一天平精確稱取9種吡嗪標(biāo)準(zhǔn)品各100 mg，用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液定容至50 mL。此時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL。精確吸取9種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液稀釋并定容。其中2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、四甲基吡嗪質(zhì)量濃度均為5 μg/mL，2-甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、5-乙基-2,3-二甲基吡嗪質(zhì)量濃度均為0.5 μg/mL。取9個(gè)10 mL容量瓶，分別取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL、8.0 mL，用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液定容至10 mL。分裝至液相小瓶上機(jī)檢測(cè)。以質(zhì)量濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)，特征離子峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

強(qiáng)化大曲樣品前處理：準(zhǔn)確稱取5 g大曲于50 mL離心管中，加入20 mL 體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液，混勻后26 ℃超聲（超聲頻率50 kHz）提取30 min，室溫條件8 000 r/min離心10 min，吸取上清過(guò)0.22 μm濾膜進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

超高效液相色譜（UPLC）條件：采用Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm×1.7 μm）；柱溫箱：40 ℃；恒流：柱流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇。梯度洗脫條件為0～1.0 min，93%A；1.0～12.0 min，93%～87%A；12.0～12.5 min，87%～0%A；12.5～15.0 min，0%A；15.0～15.5 min，0～93%A；15.5～19.0 min，93%A[20]。

質(zhì)譜（MS）條件：離子源為常壓化學(xué)電離源（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）；毛細(xì)管電壓3.0 kV；脫溶劑氣溫度500 ℃；脫溶劑氣流量800 L/h；錐孔氣流量50 L/h；監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reactionmonitoring，MRM）。錐形電壓設(shè)定范圍為5～50V，碰撞能量設(shè)定范圍為5～35eV。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)吡嗪菌株的初篩

從大曲中共分離純化到58株細(xì)菌，接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基50 ℃培養(yǎng)1～3 d，生長(zhǎng)良好的菌株有18株，編號(hào)為X1～X18，初篩菌株菌落形態(tài)見(jiàn)表1。由表1可知，18株菌株均為革蘭氏陽(yáng)性菌，形狀大多為圓形，質(zhì)地較為濕潤(rùn)。

表1 初篩菌株菌落形態(tài)描述Table 1 Description of colony morphology of preliminary screening strains

2.2 高產(chǎn)吡嗪菌株的固態(tài)發(fā)酵復(fù)篩

2.2.1 菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)香實(shí)驗(yàn)

將經(jīng)過(guò)初篩所得的18株細(xì)菌在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基梯度升溫發(fā)酵6 d，發(fā)酵產(chǎn)物感官評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，菌株X1、X2、X4、X6、X8、X9發(fā)酵產(chǎn)物感官聞香效果較好，醬味相比其他菌株更加濃郁，此外還有酸味、焦糖味以及輕微花果香氣。

表2 高產(chǎn)吡嗪菌株復(fù)篩結(jié)果Table 2 Rescreening results of high yield pyrazine strains

2.2.2 菌株代謝產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

對(duì)初篩18株菌株的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行HS-SPME-GC-MS檢測(cè)，初篩菌株發(fā)酵產(chǎn)物檢出的香氣成分主要有吡嗪類、酸類、酯類、醇類、酮類和芳香類物質(zhì)。菌株X1、X2、X4、X6、X8、X9發(fā)酵代謝產(chǎn)物的吡嗪類物質(zhì)含量要遠(yuǎn)高于其他菌株，其揮發(fā)性香氣化合物測(cè)定結(jié)果結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，菌株X1檢出的吡嗪類和酸類物質(zhì)含量最高，分別為9 276.55 μg/kg和1 054.16 μg/kg。選擇高產(chǎn)吡嗪的菌株X1、X2、X4、X6、X8、X9進(jìn)行大曲生產(chǎn)應(yīng)用。

表3 6株高產(chǎn)吡嗪菌株代謝產(chǎn)物揮發(fā)性香氣化合物測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of volatile aroma compounds in metabolites of 6 high-yield pyrazines strains

2.2.3 菌株代謝產(chǎn)物與大曲香氣的比較

對(duì)出倉(cāng)大曲的香氣進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。與高產(chǎn)吡嗪菌株代謝產(chǎn)物進(jìn)行比較分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。由表4和圖1可知，高產(chǎn)吡嗪菌株代謝產(chǎn)物和高溫大曲分別檢出33種和67種揮發(fā)性成分，高產(chǎn)吡嗪菌株代謝產(chǎn)物中60.60%的成分在大曲中也能檢出，主要有呈醬香和烘焙香的吡嗪類物質(zhì)[21]（2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪）和對(duì)大曲和白酒風(fēng)味較為重要的酸味物質(zhì)[22]（乙酸、異丁酸、異戊酸）。代謝產(chǎn)物還檢出苯甲醇、苯乙醇、苯乙酸乙酯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚等具有花香和芳香味的物質(zhì)[23-24]。此外，2-甲基-2-戊烯酸、丙位壬內(nèi)酯具有特殊果香氣味也能在代謝產(chǎn)物中檢出。通過(guò)感官聞香和GC-MS檢測(cè)分析以及與大曲香氣的比較分析，發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)吡嗪菌株發(fā)酵主要對(duì)大曲貢獻(xiàn)醬香、烘焙香、烘焙香以及花果香氣。

表4 高溫大曲中揮發(fā)性香氣化合物檢測(cè)結(jié)果Table 4 Determination results of volatile aroma compounds in high-temperature Daqu

圖1 大曲與細(xì)菌代謝產(chǎn)物揮發(fā)性香氣物質(zhì)維恩圖Fig.1 Venn diagram of volatile aroma components of Daqu and bacterial metabolites

2.3 高產(chǎn)吡嗪菌株的鑒定

2.3.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察

由圖2可知，通過(guò)對(duì)高產(chǎn)吡嗪菌株形態(tài)學(xué)觀察和顯微鏡鏡檢，發(fā)現(xiàn)6株菌均為革蘭氏陽(yáng)性菌、短桿狀。

圖2 6株高產(chǎn)吡嗪菌株菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of 6 high-yield pyrazines strains

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

對(duì)6株高產(chǎn)吡嗪菌株進(jìn)行16S rDNA測(cè)序鑒定，選擇同源性高的序列，通過(guò)MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定菌株X1為索諾拉沙漠芽孢桿菌（Bacillus sonorensis）、菌株X2為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、菌株X4和X8為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、菌株X6為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、菌株X9為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

圖3 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的6株高產(chǎn)吡嗪菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of 6 high-yield pyrazines strains based on 16S rDNA gene sequence

2.4 強(qiáng)化大曲吡嗪類物質(zhì)的測(cè)定

2.4.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別將9種吡嗪類標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋至0.1 mg/L，上機(jī)進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描以確定目標(biāo)吡嗪物質(zhì)的準(zhǔn)分子離子峰。再分別對(duì)準(zhǔn)分子離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能量、母離子、子離子等質(zhì)譜條件見(jiàn)表5。在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，2,3-二甲基吡嗪，2,5-二甲基吡嗪及2,6-二甲基吡嗪三種同分異構(gòu)體其特征離子相同，不能進(jìn)行分離。因此，選取2,6-二甲基吡嗪為代表檢測(cè)二甲基吡嗪含量。

表5 吡嗪類物質(zhì)參數(shù)優(yōu)化Table 5 Parameters optimization of pyrazines

2.4.2 線性范圍、檢出限和定量限結(jié)果

強(qiáng)化大曲吡嗪類物質(zhì)經(jīng)UPLC-MS/MS檢測(cè)，采用外標(biāo)法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以質(zhì)量濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)，特征離子峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍信噪比和10倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）。經(jīng)檢測(cè)各吡嗪類物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)R2均＞0.99，線性關(guān)系較好，且檢出限較低，能夠滿足大曲中吡嗪類物質(zhì)的測(cè)定。

表6 吡嗪類物質(zhì)分析的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 6 Linear equation,correlation coefficient,detection limit and quantification limit of pyrazines

2.4.3 強(qiáng)化大曲吡嗪類物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

由表7可知，從對(duì)照大曲（未添加高產(chǎn)吡嗪菌株）和強(qiáng)化大曲（添加高產(chǎn)吡嗪菌株）中共檢出6種吡嗪類物質(zhì)，包括四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、5-乙基-2,3-二甲基吡嗪。

表7 6株高產(chǎn)吡嗪菌株強(qiáng)化大曲吡嗪類物質(zhì)的含量檢測(cè)結(jié)果Table 7 Determination results of pyrazines contents in Daqu fortified by 6 high-yield pyrazines strains

相比于對(duì)照大曲，不同菌劑對(duì)于吡嗪類物質(zhì)含量的影響較大，菌株X1、X2、X8、X9強(qiáng)化大曲吡嗪類物質(zhì)含量要遠(yuǎn)高于對(duì)照大曲。其中，菌株X1強(qiáng)化大曲吡嗪類物質(zhì)含量最多，其中四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪含量分別高達(dá)23 280.0 μg/kg、4 880.0 μg/kg、8 880.0 μg/kg，分別是對(duì)照大曲的3.36倍、3.56倍、3.33倍，這與文獻(xiàn)報(bào)道的芽孢桿菌能夠提高大曲四甲基吡嗪含量的結(jié)果一致[25-26]。2-乙基-6-甲基吡嗪、5-乙基-2,3-二甲基吡嗪的含量分別為60.0 μg/kg、284.8 μg/kg，為對(duì)照大曲的5.08倍、4.22倍；此外，菌株X2、X8和X9強(qiáng)化大曲的吡嗪物質(zhì)含量也明顯高于對(duì)照大曲；而菌株X4和X6強(qiáng)化大曲吡嗪類物質(zhì)含量較少，要低于對(duì)照大曲，在大曲生產(chǎn)上的應(yīng)用效果較差。此外，菌劑方式對(duì)于強(qiáng)化大曲的吡嗪類含量影響也較大，液態(tài)菌劑強(qiáng)化大曲產(chǎn)吡嗪效果要普遍優(yōu)于固態(tài)菌劑強(qiáng)化大曲。

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)高溫培養(yǎng)初篩和固態(tài)發(fā)酵復(fù)篩從高溫大曲中得到6株高產(chǎn)吡嗪類物質(zhì)的菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定均為芽孢桿菌（Bacillus）。將6株芽孢桿菌制備成液態(tài)和固態(tài)菌劑應(yīng)用于大曲生產(chǎn)發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后對(duì)強(qiáng)化大曲的吡嗪進(jìn)行UPLC-MS/MS定量檢測(cè)。結(jié)果表明相比于對(duì)照大曲，強(qiáng)化大曲的吡嗪類物質(zhì)含量提升明顯，并且液態(tài)菌劑的效果要普遍優(yōu)于固態(tài)菌劑。菌株X1強(qiáng)化大曲吡嗪類物質(zhì)含量最高，四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪含量相比對(duì)照大曲分別提升了2.36倍、2.56倍、2.33倍，該菌株在大曲生產(chǎn)上有較高的應(yīng)用價(jià)值，能夠顯著提高大曲吡嗪類物質(zhì)含量。