植物乳桿菌HCS03-001對(duì)小鼠功能性便秘及腸道菌群的影響

陳 雪，矯艷平*，余 萍，湯 純，閔祥博，趙 迪

（江西仁仁健康產(chǎn)業(yè)有限公司，江西 樟樹 331200）

功能性便秘是一種臨床上常見的胃腸道疾病，根據(jù)2011年美國(guó)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，全世界便秘的發(fā)病率高達(dá)16%左右，在中國(guó)有20%～30%的人口被便秘困擾[1-2]。功能性便秘的發(fā)病率正在逐年呈上升趨勢(shì)，由于易受飲食、環(huán)境、情緒等多種因素影響，主要發(fā)病人群集中在老年人和女性患者[3-5]，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為排便困難、每周排便次數(shù)少于3次，糞便干硬，而且常伴有腹痛、腹脹等癥狀[6]。此外，還會(huì)導(dǎo)致人體腸道動(dòng)力及菌群失調(diào)，腸道敏感性降低[7]；腫瘤等疾病壓迫腸道，腸蠕動(dòng)受機(jī)械性阻礙；腸平滑肌張力降低，排便肌群活動(dòng)障礙，蠕動(dòng)減弱[8]；腸道菌群紊亂[9]。長(zhǎng)期便秘將會(huì)導(dǎo)致腸壁損傷，腸道中毒素聚集堆積，從而引起一系列全身性并發(fā)癥[10]。目前對(duì)于便秘的治療主要是藥物治療，西藥包括溶劑型瀉劑、刺激性瀉劑、鹽類瀉劑、滲透性瀉劑、促動(dòng)力藥等，長(zhǎng)期服用均會(huì)產(chǎn)生一定的副作用；中藥有單味的番瀉葉、白芍及復(fù)方中藥麻仁丸、牛黃上清丸等，雖沒(méi)有明顯副作用，但起效作用較慢[11]。

益生菌是活的微生物，主要定植于身體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，當(dāng)攝入足夠量時(shí)對(duì)宿主健康起有益作用，可維持宿主腸道菌群穩(wěn)態(tài)、保護(hù)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)、參與機(jī)體免疫和代謝調(diào)節(jié)[12-14]。乳桿菌屬中的大多數(shù)菌株都具有益生作用，其中最具有代表性的菌株是植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）[15]。植物乳桿菌是一種革蘭氏陽(yáng)性發(fā)酵乳桿菌，是一種兼性厭氧、不運(yùn)動(dòng)、無(wú)芽孢的桿菌或長(zhǎng)桿菌[16]。有研究表明，植物乳桿菌具有免疫調(diào)節(jié)、抑制致病菌、降低血清膽固醇含量、改善功能性便秘、調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群平衡等作用[17-18]。

本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）HCS03-001改善功能性便秘、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的生理活性，并初步探討其機(jī)制，為治療便秘產(chǎn)品的開發(fā)提供更多選擇及植物乳桿菌HCS03-001的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

90只昆明（KM）小鼠（雄性，18～22 g）：遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)條件：保持安靜、清潔、通風(fēng)和適宜光照，溫度保持在（23±2）℃，濕度為40%～70%，明暗交替周期為12 h，保證動(dòng)物自由飲水和充分進(jìn)食，飲水和飼料均經(jīng)無(wú)菌處理。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）HCS03-001凍干粉（1×1011CFU/g）：漢臣氏（沈陽(yáng)）兒童制品有限公司研發(fā)部。

1.1.2 培養(yǎng)基

腸桿菌培養(yǎng)基（伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基）、乳酸菌選擇培養(yǎng)基、腸球菌培養(yǎng)基（疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂培養(yǎng)基）、產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 試劑

鹽酸洛哌丁胺膠囊（鹽酸洛哌丁胺含量為2 mg/粒）：西安楊森制藥有限公司；阿拉伯樹膠粉（分析純）：上海源葉生物有限公司；活性炭粉：浙江興達(dá)活性炭有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHP-500BS恒溫培養(yǎng)箱：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；LDZX-50KBS壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；PHS-25酸堿指示劑：上海雷磁儀器有限公司；XSP-10CH顯微鏡、JA2003N電子天平：上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌HCS03-001對(duì)小鼠功能性便秘的影響

（1）動(dòng)物分組

將經(jīng)過(guò)適應(yīng)環(huán)境3～5 d的雄性KM小鼠按體質(zhì)量（bw）隨機(jī)分成5組，每組10只，分別為對(duì)照組、便秘模型組（即鹽酸洛哌丁胺組）和植物乳桿菌低（1g/（kgbw·d））、中（2g/（kgbw·d））、高（4 g/（kg bw·d））劑量組。采用等體積（20 mL/（kg bw·d））灌胃法，溶劑對(duì)照組和便秘模型組用蒸餾水代替。各實(shí)驗(yàn)組連續(xù)灌胃14 d，期間自由飲水、自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料。

（2）小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)

墨汁配制方法：將阿拉伯膠5 g與40 mL蒸餾水混合煮沸至澄清透明，再與2.50 g活性炭粉混合均勻煮沸3次，冷卻，蒸餾水定容至50 mL，置于4 ℃冰箱保存，備用。

連續(xù)灌胃14 d后，所有小鼠均禁食不禁水飼養(yǎng)16 h。結(jié)束后，除溶劑對(duì)照組外，其余各組均經(jīng)口灌胃5 mg/kg bw鹽酸洛哌丁胺，造便秘模型，若便秘模型組的小腸墨汁推進(jìn)率顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明小鼠便秘模型成立。建模0.5 h后，5個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠分別灌胃10 mL/kg bw墨汁，計(jì)時(shí)20 min后處死小鼠，解剖，測(cè)量小腸全長(zhǎng)及自胃部下端幽門處到墨水運(yùn)動(dòng)前沿的距離，并計(jì)算墨汁推進(jìn)率，其計(jì)算公式如下：

1.3.2 植物乳桿菌HCS03-001對(duì)小鼠腸道菌群的影響

（1）動(dòng)物分組

動(dòng)物平衡飼養(yǎng)3 d后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為溶劑對(duì)照組和植物乳桿菌低（1 g/（kg bw·d））、中（2 g/（kg bw·d））、高（4 g/（kg bw·d））3個(gè)劑量組。3個(gè)劑量組每天按照10 mL/kg bw灌胃，連續(xù)灌胃14 d，溶劑對(duì)照組等體積灌胃滅菌后的純水。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌胃期間自由進(jìn)食、飲水。

（2）糞便樣品的采集與處理

灌胃第0天及第14天，無(wú)菌收集各組小鼠新鮮糞便。分別稱取小鼠糞便0.1 g混勻于10 mL無(wú)菌生理鹽水中，制成糞便混懸液。

（3）腸道菌群的檢測(cè)

取上述混懸液1 mL，無(wú)菌加入至9 mL無(wú)菌生理鹽水中，反復(fù)吹打混合均勻，制成均勻液體，按10倍梯度進(jìn)行稀釋，選取合適稀釋度的混懸液1 mL接種于無(wú)菌平皿，每個(gè)稀釋度做2個(gè)平皿。然后分別倒入腸桿菌培養(yǎng)基、乳酸菌選擇培養(yǎng)基、腸球菌培養(yǎng)基、產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)基20 mL，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿混勻后，放入相應(yīng)溫度培養(yǎng)箱內(nèi)按指定時(shí)間培養(yǎng)。

培養(yǎng)結(jié)束后，選取菌落數(shù)合適，無(wú)蔓延生長(zhǎng)的平皿菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)灌胃前后活菌數(shù)的變化情況，來(lái)反映植物乳桿菌HCS03-001對(duì)小鼠腸道菌群的影響。試驗(yàn)結(jié)果以菌落對(duì)數(shù)值表示（lg CFU/g）。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用軟件SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌HCS03-001對(duì)小鼠小腸墨汁推進(jìn)率的影響

植物乳桿菌HCS03-001對(duì)小鼠小腸墨汁推進(jìn)率的影響見表1。

由表1可知，與溶劑對(duì)照組（73.92%）相比，便秘模型組小鼠的小腸墨汁推進(jìn)率（40.06%）顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明小鼠便秘模型構(gòu)建成功。與便秘模型組相比，植物乳桿菌HCS03-001各劑量組小鼠的小腸墨汁推進(jìn)率均提高，分別為42.21%、53.40%、55.12%，其中中、高劑量組小鼠的小腸墨汁推進(jìn)率顯著提高（P＜0.05），說(shuō)明植物乳桿菌HCS03-001對(duì)鹽酸洛哌丁胺造模的小鼠便秘模型有一定的促進(jìn)腸蠕動(dòng)的作用。

表1 植物乳桿菌HCS03-001對(duì)小鼠小腸墨汁推進(jìn)率的影響Table 1 Effect of Lactobacillus plantarum HCS03-001 on intestinal ink progradation rate of mouse

2.2 植物乳桿菌HCS03-001對(duì)小鼠腸道菌群的影響

2.2.1 植物乳桿菌HCS03-001對(duì)小鼠腸道腸桿菌的影響

植物乳桿菌HCS03-001對(duì)小鼠腸道腸桿菌數(shù)的影響見表2。

表2 植物乳桿菌HCS03-001對(duì)小鼠腸道腸桿菌數(shù)的影響Table 2 Effect of Lactobacillus plantarum HCS03-001 on the number of Enterobacter in mouse gut

由表2可知，第0天，各組小鼠腸道中腸桿菌活菌數(shù)無(wú)明顯差異（P＞0.05）；灌胃14 d后，溶劑對(duì)照組小鼠腸道中腸桿菌活菌數(shù)基本保持不變，而植物乳桿菌HCS03-001各劑量組與溶劑對(duì)照組相比，腸桿菌數(shù)量均有所降低，但無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

2.2.2 植物乳桿菌HCS03-001對(duì)小鼠腸道乳桿菌的影響

植物乳桿菌HCS03-001對(duì)小鼠腸道乳桿菌的影響見表3。由表3可知，第0天，各組小鼠腸道中乳桿菌活菌數(shù)無(wú)明顯差異（P＞0.05）；灌胃14 d后，溶劑對(duì)照組小鼠腸道中乳桿菌活菌數(shù)基本保持不變，而植物乳桿菌HCS03-001各劑量組與溶劑對(duì)照組相比乳桿菌活菌數(shù)均有所增加，且除低劑量組外，中、高劑量組增加明顯（P＜0.05）。

表3 植物乳桿菌HCS03-001對(duì)小鼠腸道乳桿菌數(shù)的影響Table 3 Effect of Lactobacillus plantarum HCS03-001 on the number of Lactobacillus in mouse gut

2.2.3 植物乳桿菌HCS03-001對(duì)小鼠腸道腸球菌數(shù)的影響植物乳桿菌HCS03-001對(duì)小鼠腸道腸球菌數(shù)的影響見表4。

表4 植物乳桿菌HCS03-001對(duì)小鼠腸道腸球菌數(shù)的影響Table 4 Effect of Lactobacillus plantarum HCS03-001 on the number of Enterococcus in mouse gut

由表4可知，第0天，各組小鼠腸道中腸球菌活菌數(shù)無(wú)明顯差異（P＞0.05）；灌胃14 d后，溶劑對(duì)照組小鼠腸道中腸球菌活菌數(shù)基本保持不變，而植物乳桿菌HCS03-001各劑量組與溶劑對(duì)照組相比腸球菌活菌數(shù)有所下降，且除低劑量組外，中、高劑量組下降明顯（P＜0.05）。

2.2.4 植物乳桿菌HCS03-001對(duì)小鼠腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)的影響

植物乳桿菌HCS03-001對(duì)小鼠腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)的影響見表5。

表5 植物乳桿菌HCS03-001對(duì)小鼠腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)的影響Table 5 Effect of Lactobacillus plantarum HCS03-001 on the number of Clostridium perfringens in mouse gut

由表5可知，第0天，各組小鼠腸道中產(chǎn)氣莢膜梭菌活菌數(shù)無(wú)明顯差異（P＞0.05）；灌胃14 d后，溶劑對(duì)照組小鼠腸道中產(chǎn)氣莢膜梭菌活菌數(shù)基本保持不變，而植物乳桿菌HCS03-001各劑量組與溶劑對(duì)照組相比產(chǎn)氣莢膜梭菌活菌數(shù)均下降，且高劑量組下降明顯（P＜0.05）。

綜上所述，植物乳桿菌HCS03-001可提高小鼠腸道內(nèi)乳桿菌活菌數(shù)，降低小鼠腸道內(nèi)腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的活菌數(shù)。

3 討論

3.1 植物乳桿菌對(duì)小鼠功能性便秘的影響

便秘作為一種常見的功能性胃腸道疾病，是許多疾病的誘導(dǎo)因素之一，它的存在已嚴(yán)重的影響了人們的身體健康與生活質(zhì)量[19]。由于便秘困擾，大便滯留在機(jī)體腸道內(nèi)，導(dǎo)致腸道中有害菌產(chǎn)生的有害物質(zhì)難以排出體外，隨著血液循環(huán)到達(dá)全身各器官而造成機(jī)體損害，導(dǎo)致嚴(yán)重的健康問(wèn)題[20]。根據(jù)鹽酸洛哌丁胺的藥理，其可通過(guò)抑制腸道蠕動(dòng)導(dǎo)致小鼠便秘，因此不會(huì)造成小鼠器質(zhì)性病變，故本實(shí)驗(yàn)采用鹽酸洛哌丁胺建立功能性便秘模型。便秘的形成主要與腸道蠕動(dòng)不足、腸道益生菌數(shù)量下降等有關(guān)，植物乳桿菌可以定植在腸道內(nèi)，并且能夠抑制有害菌的生長(zhǎng)，提高有益菌含量，潤(rùn)腸通便及改善腸道菌群。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定小鼠小腸墨汁推進(jìn)率，探究植物乳桿菌對(duì)小鼠功能性便秘的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 g/（kg bw·d）、4 g/（kg bw·d）劑量下的植物乳桿菌HCS03-001可表現(xiàn)出促進(jìn)腸蠕動(dòng)的功能，因此后續(xù)還可以考察小鼠排便數(shù)量及時(shí)間進(jìn)一步確認(rèn)該株菌的益生功能。

3.2 植物乳桿菌對(duì)小鼠腸道菌群的影響

人體健康的重要指標(biāo)之一就是腸道菌群平衡，它不僅僅是可以和機(jī)體來(lái)進(jìn)行信息與物質(zhì)的交換，還會(huì)影響機(jī)體營(yíng)養(yǎng)吸收和正常代謝[21-22]。如絕大多數(shù)的乳桿菌都具有多種糖基水解酶，能夠分解和發(fā)酵多糖，將其變成易于機(jī)體吸收的簡(jiǎn)單小分子糖類[23]，并產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，這些小分子糖類和短鏈脂肪酸在結(jié)腸部位被吸收利用可以作為機(jī)體日常所需的能源。本研究采用平板計(jì)數(shù)法研究了植物乳桿菌對(duì)小鼠腸道菌群的影響，結(jié)果顯示，連續(xù)灌胃不同劑量的植物乳桿菌HCS03-001 14 d后，3個(gè)劑量組小鼠腸道內(nèi)益生菌乳桿菌數(shù)量增長(zhǎng)，同時(shí)腸桿菌、腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)受到抑制。結(jié)果表明，植物乳桿菌HCS03-001有改善腸道菌群的作用。推測(cè)植物乳桿菌改善腸道菌群的作用機(jī)理可能包括以下兩點(diǎn)[24-25]：一是植物乳桿菌能產(chǎn)生大量的短鏈脂肪酸降低腸道pH值環(huán)境、促進(jìn)乳桿菌增殖，同時(shí)還可以抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌、腸桿菌和腸球菌的生長(zhǎng)；二是添加植物乳桿菌可以加速小鼠腸道蠕動(dòng)，縮短腸道內(nèi)容物在腸道內(nèi)停留的時(shí)間，使其可以迅速排出體外，并在此過(guò)程中排出腸道內(nèi)的有害菌及其發(fā)酵產(chǎn)生的胺、吲哚、酚類等不良產(chǎn)物，從而起到改善小鼠腸道菌群的作用。

4 結(jié)論

本研究利用鹽酸洛哌丁胺建立功能性便秘模型，通過(guò)測(cè)定小鼠小腸墨汁推進(jìn)率發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌HCS03-001在中、高劑量下，可以顯著提高小鼠小腸墨汁推進(jìn)率（P＜0.05）。通過(guò)選擇性培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)法研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌HCS03-001高劑量可顯著降低產(chǎn)氣莢膜梭菌、腸球菌的活菌數(shù)（P＜0.05）、降低腸道內(nèi)腸桿菌（P＞0.05），同時(shí)顯著促進(jìn)乳桿菌的增殖（P＜0.05）。說(shuō)明植物乳桿菌HCS03-001具有改善小鼠便秘、調(diào)節(jié)腸道菌群的功能。