瑞安市腹瀉患者沙門菌耐藥性和分子分型研究

李娜 周邦瑤 蘇海珍 胡玉琴 葉環(huán)環(huán) 劉敏芝 李毅

沙門菌可引起人類腸道傳染病和傷寒、副傷寒病癥，亦可使家禽、畜類致病，是一種人畜共患病的病原體。在中國乃至世界各地，非傷寒沙門菌是引起人類食源性疾病、造成重大經(jīng)濟損失的重要元兇[1-2]。Majowicz等[3]估計，全球每年約有9 380萬例沙門菌感染患者，病死15.5萬例，其中8 030萬病例來源于食源性感染。沙門菌血清型眾多，全球范圍內(nèi)已經(jīng)鑒定出的沙門菌血清型多達(dá)2 500個[4]。不同血清型沙門菌遺傳表型不同，這為確定感染源及臨床控制感染造成一定難度。本研究收集瑞安市人民醫(yī)院2016—2019年從腹瀉患者中分離到的沙門菌，通過血清型鑒定和藥物敏感性分析，了解瑞安市沙門菌的血清型分布和耐藥性的總體概況，為臨床科學(xué)用藥提供實驗室參考數(shù)據(jù)；并利用脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis,PFGE）技術(shù)分析沙門菌分子分型，為細(xì)菌溯源提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 2016—2019年從瑞安市人民醫(yī)院腹瀉患者中分離到沙門菌共134株，其中2株分離自血液，其余132株分離自糞便。

1.2 主要試劑 沙門菌血清誘導(dǎo)瓊脂（批號：295652149）和沙門菌血清套裝（規(guī)格：1 ml，60支/盒，批號：K60V-50）購自丹麥SSI公司。藥敏紙片及MH瓊脂（批號：2487022）購自英國OXOID公司。14種藥敏紙片分別為氨芐西林（批號：2858417），阿莫西林/克拉維酸2∶1（批號：2491412），頭孢他啶（批號：2912216），頭孢噻肟（批號：2518697），頭孢吡肟（批號：2836423），亞胺培南（批號：2897217），氨曲南（批號：2518702），萘啶酸（批號：2492578），環(huán)丙沙星（批號：2539801），磺胺異惡唑（批號：2984526），甲氧芐啶（批號：2538102），復(fù)方新諾明（批號：2518734），四環(huán)素（批號：2525329），氯霉素（批號：2506047）。Xba I核酸內(nèi)切酶（批號：AGZ0057A）購自寶生物工程（大連）有限公司，蛋白酶K（批號：812KA0961）購自上海生工生物工程有限公司。使用法國梅里埃VITEK-2全自動生化鑒定系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司CHEF-Mapper?XA脈沖場凝膠電泳儀及Gel XR凝膠成像儀。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定及血清學(xué)分型 按照國家標(biāo)準(zhǔn)《食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4-2016）對菌株進行鑒定與血清凝集試驗。依據(jù)《White-Kauffmann-Leminor抗原表（第9版）》和《沙門菌屬血清型診斷》確定血清型[4]。

1.3.2 藥物敏感性檢測 采用K-B紙片法，根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（clinical and laboratory standards institute,CLSI）藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn) M-100（2019）[5]判定藥敏結(jié)果。以氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸2:1、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、亞胺培南、氨曲南、萘啶酸、環(huán)丙沙星、磺胺異惡唑、甲氧芐啶、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、氯霉素等14種藥物作為實驗抗菌藥物。以大腸埃希菌ATCC25922為質(zhì)控菌株。

1.3.3 PFGE分子分型 隨機選取部分菌株，參照國家食源性致病菌病原細(xì)菌分子分型監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)（PulseNet）中沙門菌PFGE分型的標(biāo)準(zhǔn)操作方法進行。將新鮮菌株懸浮于盛有1 ml細(xì)胞懸液的Falcon 2054管，調(diào)整細(xì)菌密度，使吸光度值為4.0～4.2。取400 μl上述細(xì)菌菌懸液于1.5 ml離心管中，加入20 μl蛋白酶K（20 g/L），混勻，加入400 μl SeaKem Gold瓊脂糖混勻，將上述混合物加入加樣孔內(nèi)，待膠塊凝固后，加入25 μl蛋白酶K（20 g/L）的裂解液裂解細(xì)菌2 h。加入45 U XbaⅠ酶，37℃酶切3 h，以布倫登盧普沙門菌菌株H9812作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。脈沖場凝膠電泳條件：6.0 V/cm，2.16～63.8 S，19 h，電泳結(jié)束后，用Gel Red染色并用純水脫色。采用凝膠成像儀獲取圖像，并轉(zhuǎn)換成TIFF圖像格式。用BioNumerics 7.5軟件對PFGE結(jié)果進行分析，用非加權(quán)配對算術(shù)平均法（unweighted pair group average method,UPGMA）進行聚類，構(gòu)建聚類樹。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 沙門菌菌株來源的人群分布 134株菌株來源人群中，最小年齡＜1歲，最大年齡為87歲。5歲以下嬰幼兒25人，占18.7%，5～12歲6人，13～20歲7人，21～40歲36人，41～60歲43人，＞60歲17人。男性83人，占61.9%，女性51人。其中0～2歲的嬰幼兒達(dá)21人。

2.2 沙門菌血清型分布 134株沙門菌分別分布在B群、C1群、C2群、C3群、D1群、E1群和E4群，共24個血清型，占比最大的是鼠傷寒沙門菌，有52株，占38.8%，腸炎沙門菌31株，占23.1%，倫敦沙門菌13株，占9.7%，見表1。來自0～12歲兒童的菌株有31株，其中鼠傷寒沙門菌21株，占67.7%，腸炎沙門菌2株，占6.5%；來自21～60歲組的菌株有79株，其中鼠傷寒沙門菌19株，占24.1%，腸炎沙門菌25株，占31.6%。隨著年齡增高，鼠傷寒沙門菌的占比呈降低趨勢，＞60歲組中，鼠傷寒沙門菌占比再次升高，見圖1?！?2歲組和＞60歲組中，鼠傷寒沙門菌占比遠(yuǎn)高于腸炎沙門菌；在21～60歲中青年組，腸炎沙門菌占比稍高于鼠傷寒沙門菌。≤12歲組和21～60歲組的血清型分布比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表1 134株沙門菌血清型分布情況

圖1 各年齡組血清型占比

表2 134株沙門菌血清型分布情況

2.3 沙門菌藥敏試驗 134株沙門菌對氨芐西林的耐藥率最高，達(dá)73.1%；其次為磺胺異惡唑、四環(huán)素和萘啶酸，耐藥率分別為62.7%、56.0%和53.0%。復(fù)方新諾明的耐藥率為32.8%。對環(huán)丙沙星耐藥的菌株有13株，占9.7%，中介菌株有84株，占62.7%，敏感菌株37株，僅占27.6%。沙門菌對阿莫西林/克拉維酸2∶1、頭孢他啶、亞胺培南、氨曲南具有較高的敏感性，耐藥率均＜10.0%。值得注意的是，2016—2019年，沙門菌對環(huán)丙沙星的耐藥呈逐年遞增趨勢，如2016年耐藥率為0，2017年為5.6%，2018年為11.5%，至2019年上升為15.8%。多重耐藥菌93株，占69.4%，見表3。

表3 沙門菌對14種抗菌藥物的耐藥率（%）

比較鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌的耐藥性可知，腸炎沙門菌對萘啶酸耐藥率為100%，鼠傷寒沙門菌對萘啶酸耐藥率為48.1%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。復(fù)方新諾明、氯霉素、甲氧芐啶、四環(huán)素的耐藥率，鼠傷寒沙門菌高于腸炎沙門菌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；尤其是對四環(huán)素的耐藥率，鼠傷寒沙門菌高達(dá)80.8%，而腸炎沙門菌為9.7%。其他9種藥，兩種菌耐藥率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。52株鼠傷沙門菌中，多重耐藥菌株有44株，占84.6%，大多為四環(huán)素和氨芐西林耐藥。31株腸炎沙門菌中，多重耐藥菌株有23株，占74.2%，耐藥譜以萘啶酸、氨芐西林、磺胺異惡唑為主，見表4。

表4 鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌耐藥率比較（%）

2.4 PFGE分型結(jié)果 隨機選取的40株沙門菌中鼠傷寒沙門菌18株，腸炎沙門菌14株，倫敦沙門菌3株，阿西納沙門菌、山夫登堡沙門菌、利物浦沙門菌、湯卜遜沙門菌、羅森沙門菌各1株。UPGMA聚類顯示大致分為鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、倫敦沙門菌為代表的3個支系，共29種帶型，相似度為63%～100%。其中鼠傷寒沙門菌共16種帶型，腸炎沙門菌共5種帶型，除1株編號為SM167的腸炎沙門菌的帶型與鼠傷寒沙門菌那支相近外，其余13株腸炎沙門菌帶型相似度≥92.7%。3株倫敦沙門菌有3種帶型，見圖2。就菌株耐藥性而言，編號為SM167的腸炎沙門菌對8種抗生素耐藥，其余13株腸炎沙門菌對1～4種抗生素耐藥。聚類在鼠傷寒支系中的阿西納沙門菌、山夫登堡沙門菌和聚類在腸炎支系的利物浦沙門菌，對所有藥物均敏感。編號SM43和SM93，SM44和SM47，具有相同的PFGE帶型，卻表現(xiàn)出不同的耐藥譜。

圖2 40株沙門菌PFGE聚類分析圖譜

3 討論

近幾年研究顯示，沙門菌是中國兒童細(xì)菌性腹瀉的主要病原菌[6-7]。2020年全國第七次人口普查結(jié)果顯示，瑞安市0～14歲人口占14.52%，15～59歲占69.23%，＞60歲占16.24%。本研究中23.1%的菌株來源人群年齡分布為0～12歲（31人），高于全部人群分布的構(gòu)成比；其中0～2歲嬰幼兒有21人，占15.7%?？梢妺胗變汉偷妄g兒童是沙門菌的易感人群。相比健康人群攝入大量的非傷寒沙門菌才能引起疾病，一般幼兒和老年人以及慢性疾病患者更易感染，且癥狀嚴(yán)重[8]。

本研究分離的沙門菌血清型以鼠傷寒和腸炎沙門菌為主，與上海市和寶雞市的一致[9-10]，而向蓉等[11]和譚南等[12]發(fā)現(xiàn)中山市以鼠傷寒沙門菌和斯坦利沙門菌為主，安徽省馬鞍山市以阿貢納沙門菌和腸炎沙門菌為主[13]，均與本研究不同。不同年齡組，沙門菌的血清型構(gòu)成不同。隨著年齡升高，鼠傷寒沙門菌的占比，呈現(xiàn)降低的趨勢；但在＞60歲組別中，占比又有所回升。本地區(qū)12歲以下兒童感染的優(yōu)勢血清型菌種為鼠傷寒沙門菌，占比高達(dá)67.7%，血清型比較單一；21～60歲成年人的感染菌株主要為腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌，其他各血清型共占44.3%，血清型豐富。沙門菌感染是食源性疾病，當(dāng)人群攝入被沙門菌污染的食品或接觸帶菌動物及其環(huán)境，就會引發(fā)疾病[14-15]。成年人飲食習(xí)慣多樣、飲食結(jié)構(gòu)豐富，與動物接觸機會更多，可能是21～60歲成人組沙門菌血清型豐富的一個重要原因。

本研究發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門菌對復(fù)方新諾明、氯霉素、甲氧芐啶、四環(huán)素的耐藥率顯著高于腸炎沙門菌。而對于萘啶酸，31株腸炎沙門菌表現(xiàn)為全部耐藥，顯著高于鼠傷寒沙門菌（48.1%）。提示在研究沙門菌耐藥性時，應(yīng)注意腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門的菌株數(shù)量占比，兩者構(gòu)成比不同會影響總體耐藥率。一項針對2005—2014年沙門菌耐藥性監(jiān)測的研究顯示，鼠傷寒沙門菌的耐藥率普遍高于其他血清型[16]；楊翊等[17]研究也顯示，鼠傷寒沙門菌多重耐藥率高于其他血清型，與本研究結(jié)果相似。高耐藥株容易在同屬同型菌株之間通過物流、旅游等人口流動發(fā)生傳播擴散[18]，提示需加強食品流通環(huán)節(jié)的監(jiān)測，控制潛在的食源性爆發(fā)。

美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）指出分離自糞便標(biāo)本的沙門菌，藥敏試驗只需常規(guī)試驗氨芐西林、一種氟喹諾酮類和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑并報告[5]。臨床上使用氨芐西林和喹諾酮類治療非傷寒沙門菌感染，可能導(dǎo)致治療失敗。本地區(qū)的沙門菌對阿莫西林/克拉維酸2∶1、亞胺培南、氨曲南、頭孢他啶仍具有較高敏感度。CLSI-2019公布的藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)（M-100）指出，除沙門菌屬以外的腸桿菌科細(xì)菌對于環(huán)丙沙星中介的抑菌圈直徑為22～25 mm，而沙門菌的抑菌圈直徑為21～30 mm[5]。根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)，本研究中多數(shù)沙門菌表現(xiàn)對環(huán)丙沙星中介。但值得關(guān)注的是，2016—2019年，沙門菌對環(huán)丙沙星的耐藥率表現(xiàn)逐年上升趨勢。

作為一種成熟且應(yīng)用極廣的分子分型技術(shù)，PFGE通過比較細(xì)菌分離株的指紋圖譜，判定菌種間的遺傳親緣關(guān)系，被應(yīng)用到流行病學(xué)的溯源研究中。PFGE結(jié)果顯示，本地區(qū)2016—2019年的鼠傷寒沙門菌在分子水平存在一定程度的分化，而腸炎沙門菌除了1株特殊的分離株之外，其余菌株大多成簇聚類，相似度超過92.7。鼠傷寒沙門菌PFGE條帶相似度很高的菌株，耐藥譜卻存在一定的差異。這可能是因為菌株耐藥基因發(fā)生突變的位點并不在Xba I酶切位點上，無法由分型中表現(xiàn)出耐藥性[19]。相比之下，腸炎沙門菌的耐藥譜與PFGE條帶重疊性較高，僅出現(xiàn)耐萘啶酸和氨芐西林的菌株聚類，耐萘啶酸、氨芐西林和磺胺異惡唑的菌株聚類。隨著時間的演變，本地區(qū)沙門菌的耐藥情況仍會繼續(xù)變化。將全基因組測序方法應(yīng)用于流行病學(xué)溯源調(diào)查以及臨床用藥指導(dǎo)。

志謝 感謝上海市疾病預(yù)防控制中心許學(xué)斌老師在血清凝集實驗和論文寫作等方面給予的指導(dǎo)