胃腸道間質(zhì)瘤患者Ki-67和鈣激活通道蛋白1表達與預(yù)后的關(guān)系

陳泓臻 邱惠芳

胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumor,GIST）是胃腸道常見間葉組織源性腫瘤，好發(fā)于胃及小腸，可累及整個消化道，占消化道腫瘤的5%[1]。GIST多伴有血小板源性生長因子α多肽（platelet-derived growth factor receptor alpha,PDGFRα）和 v-kitHardy-Zucker-man4貓科肉瘤病毒致癌基因同源物（v-kitHardy-Zuckerman4 of oncogene homolog,KIT）基因的獲得性功能突變，表現(xiàn)為KIT蛋白（CD117）特異性陽性表達[2-3]。GIST生物學行為極為復(fù)雜，危險度分級與患者預(yù)后情況受多種因素綜合影響[4-5]，危險度分級作為預(yù)后、靶向治療及治療年限選擇的評估依據(jù)不夠完備，除經(jīng)典的核分裂象計數(shù)、腫瘤最大直徑、轉(zhuǎn)移及破裂等預(yù)后指標外，分子生物學標志物在評估患者進展效能和生存風險等方面也廣受關(guān)注。Ki-67是一種反映細胞分裂與增殖活性的核抗原，其高表達與惡性腫瘤分化、浸潤、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)，作為一種可靠的預(yù)后標志物，已應(yīng)用于肺癌、神經(jīng)鞘瘤、口腔癌及胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的預(yù)后評估[6-7]。鈣激活通道蛋白1（calcium activated chloride channel1,ANO1）又稱DOG-1蛋白，與Ⅲ型酪氨酸激酶受體信號傳導(dǎo)通路有關(guān)，可選擇性高表達于GIST，尤其是KIT蛋白表達陰性GIST患者，能夠有效反映GIST病情進展，對預(yù)后評估有潛在應(yīng)用價值[8]。目前，Ki-67與DOG-1對GIST預(yù)后的預(yù)測評估作用尚存爭議，兩者與GIST預(yù)后的關(guān)系尚待進一步驗證。為此，本研究選取107例GIST患者作為回顧性隊列，探討了Ki-67抗原和DOG-1表達水平與預(yù)后的關(guān)系，以期為臨床評估GIST患者病情進展及預(yù)后情況提供依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 選取杭州師范大學附屬醫(yī)院2018年1月—2021年12月收治的107例GIST患者作為回顧性隊列研究對象。其中男65例，女42例；年齡25～73（57.53±9.87）歲；腫瘤部位：胃67例，腸道40例；腫瘤直徑 1～26（6.58±4.50）cm；腫瘤轉(zhuǎn)移部位：肝轉(zhuǎn)移 9例，脾轉(zhuǎn)移2例，腹盆腔多發(fā)轉(zhuǎn)移1例。納入標準：符合《中國胃腸間質(zhì)瘤診斷治療共識（2017年版）》[9]的GIST診斷標準，并經(jīng)病理學檢查確診；免疫組化、臨床診療及隨訪資料完整。排除標準：手術(shù)治療前接受化療、放療、靶向治療者；病理診斷不明確者；合并其他嚴重系統(tǒng)性疾病者。收集患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、腫瘤轉(zhuǎn)移與否、核分裂象計數(shù)、美國國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health,NIH）危險程度分級等資料數(shù)據(jù)。本研究符合世界醫(yī)學協(xié)會《赫爾辛基宣言》的要求。

1.2 方法

1.2.1 Ki-67和DOG-1表達水平的檢測 采用EnVison兩步染色法。獲取患者經(jīng)內(nèi)鏡下或外科手術(shù)切除后的標本，以含10%甲醛的飽和碳酸鈣溶液固定，脫水后用石蠟包埋，切片，經(jīng)過檸檬酸修復(fù)液處理，用蒸餾水與PBS緩沖液沖洗后滴加一抗，過夜后再次沖洗；加二抗，37℃孵育后沖洗，進行顯色、封片處理，顯微鏡下觀察。所用抗體Ki-67和DOG-1均購自中國北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)有限公司。以PBS代替一抗作為陰性對照，以試劑盒配套試劑為陽性對照。

1.2.2 結(jié)果判定 由2名主治病理醫(yī)師共同判讀。細胞核呈棕黃色判定為Ki-67陽性表達，選取10個高倍視野（high power field,HPF），統(tǒng)計陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例并取平均值，＞10%為高表達，≤10%或未染色為低表達。統(tǒng)計細胞質(zhì)或細胞膜染色的細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例并取平均值，＞10%為DOG-1陽性表達，≤10%或未染色為陰性表達。

1.2.3 危險程度分級 采用NIH專家組制定的原發(fā)GIST手術(shù)治療后危險度分級標準，選擇腫瘤細胞生長最活躍區(qū)域，連續(xù)觀察50個HPF進行核分裂象計數(shù)，結(jié)合腫瘤大小、腫瘤部位及腫瘤破裂進行綜合評估，分為極低危、低危、中危和高危4級[10]。

1.2.4 隨訪 術(shù)后隨訪時間4～50個月，中位隨訪時間31個月，統(tǒng)計隨訪時間內(nèi)累積生存率。

1.3 統(tǒng)計學處理 使用SPSS22.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料用頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制不同Ki-67和DOG-1表達水平GIST患者的生存曲線并計算累積生存率，采用ROC曲線分析Ki-67和DOG-1水平對GIST患者預(yù)后的預(yù)測效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Ki-67和DOG-1表達與GIST臨床病理特征的關(guān)系 Ki-67高表達和DOG-1陽性表達與腫瘤直徑、腫瘤轉(zhuǎn)移、核分裂象計數(shù)、NIH危險度分級密切相關(guān)（P＜0.01），見表1。

表1 Ki-67和DOG-1表達與GIST臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.2 Ki-67、DOG-1表達與GIST患者累積生存率的關(guān)系 Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，Ki-67低表達GIST患者累積生存率高于高表達患者，DOG-1陰性表達患者累積生存率高于陽性患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 Ki-67和DOG-1表達水平與GIST患者累積生存率的關(guān)系

2.3 Ki-67、DOG-1水平對GIST患者預(yù)后的預(yù)測效能 ROC曲線顯示，Ki-67最佳截斷值為15.87%，Ki-67表達對GIST預(yù)后預(yù)測的AUC為0.847（P＜0.01）；DOG-1最佳截斷值為12.58%，DOG-1表達對GIST預(yù)后預(yù)測的AUC為0.940（P＜0.01），見圖2。

圖2 Ki-67和DOG-1水平預(yù)測GIST患者預(yù)后的ROC曲線

3 討論

手術(shù)切除是原發(fā)性GIST的主要治療手段，但術(shù)后復(fù)發(fā)率依然較高，因此，準確、個性化的危險度分級是手術(shù)治療后治療年限選擇和靶向治療方案評估的關(guān)鍵，直接決定了患者預(yù)后程度?，F(xiàn)行廣泛使用的NIH危險度分級標準基于2002年NIH標準腫瘤最大直徑和核分裂象計數(shù)，同時吸收美軍病理學研究所標準中腫瘤部位、引入腫瘤破裂等評估參數(shù)改良而成，大大提高了GIST預(yù)后風險分級的準確性和實用性[11]。但是大量研究表明，NIH危險度分級標準并不適用于所有GIST的生物學行為及臨床轉(zhuǎn)歸評估，一小部分GIST可快速進展致肝轉(zhuǎn)移，亦不乏大量高危GIST患者即便術(shù)后不接受輔助治療卻依然長期保持無病生存[12-15]。這充分說明了GIST生物學行為的復(fù)雜性，患者個體巨大的異質(zhì)性與NIH危險度分層之間的匹配度不完備，導(dǎo)致NIH危險度分級在臨床實踐中既容易忽視高危GIST群體的內(nèi)部差異，又容易放大極低危與低危GIST群體間差異。因此，NIH危險度分級標準對GIST預(yù)后、靶向治療及治療年限選擇的評估依據(jù)依然完備性不足。改進路徑無非兩條，一是持續(xù)改進腫瘤最大徑、核分裂象計數(shù)、腫瘤部位和腫瘤破裂這4個現(xiàn)有參數(shù)的評估方法，二是引入分子生物學標志物等新參數(shù)。

GIST預(yù)后相關(guān)危險因素包括腫瘤大小、核分裂數(shù)、腫瘤原發(fā)部位和腫瘤是否破裂等，尚沒有特異性生物學標志物反映GIST的惡性潛能。研究發(fā)現(xiàn)，Ki-67與細胞增殖有關(guān)，在腫瘤組織中表達越高，腫瘤生長速度就越快，而生長速度快慢正是區(qū)分腫瘤良、惡性的一個主要特點，提示Ki-67可以作為判斷GIST惡性潛能和預(yù)后的一個潛在指標[15]。Ki-67分布于細胞核內(nèi)，主要表達于細胞分裂周期的M期，G1期、S期較少表達，直接與細胞有絲分裂相關(guān)，其表達水平與腫瘤細胞增殖活躍程度、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16]。DOG-1是11q13位點上由CCND1-EMS1基因編碼的跨膜蛋白，可參與調(diào)控Ⅲ型酪氨酸激酶受體信號傳遞通道，可能是GIST發(fā)病的重要機制之一，在GIST中的表達率可達90%～95%[17]。Ki-67和DOG-1作為潛在的危險度分級及預(yù)后評價指標，目前已廣受臨床關(guān)注。本研究結(jié)果顯示，Ki-67高表達和DOG-1陽性表達與GIST腫瘤直徑、腫瘤轉(zhuǎn)移、核分裂計數(shù)、NIH危險度分級密切相關(guān)（均P＜0.01），GIST患者累積生存率與Ki-67和DOG-1表達水平密切相關(guān)（均P＜0.05）。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，Ki-67和DOG-1表達水平對GIST預(yù)后預(yù)測的AUC為0.847和0.940（P＜0.01），與Ghadir等[18]的結(jié)論較為接近，后者認為Ki-67標記指數(shù)（Ki-67 labeling index,Ki-67LI）與核分裂象計數(shù)具有相似的應(yīng)用價值，可以作為高危GIST伊馬替尼延長治療的輔助指征。但目前相關(guān)研究分組切點值較多，尚無形成共識性的最佳分組界值。在Al-Zawi等[19]的研究中，Ki-67LI切點值為6%，其對GIST患者無復(fù)發(fā)生存率預(yù)測的AUC為0.814，僅具中等預(yù)測效能，AUC值低于本研究以10%為界值的0.847。Boilve等[20]的研究結(jié)論卻相反，當Ki-67LI＞8%時，高危GIST延長使用伊馬替尼的獲益會明顯降低。本研究Ki-67的最佳分界值為15.87%，與Soliman[21]認為Ki-67LI≥10%可以作為整體生存率及無病生存率較差的獨立預(yù)測因子的研究結(jié)果較為一致。本研究表明，DOG-1陽性表達的GIST患者預(yù)后更差，累積生存率更低。但是Li等[22]通過一個多中心研究證明，DOG-1和CD117陽性與不同危險度分級之間無明顯相關(guān)性，不能作為預(yù)測GIST危險度的指標。另外，Akbari等[23]的一個大規(guī)模研究顯示，血清DOG-1檢測可以有效反映GIST患者病情進展，手術(shù)治療后血清DOG-1水平顯著下降或呈陰性，疾病一旦進展或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，血清DOG-1便立即升高或轉(zhuǎn)陽，因此血清DOG-1檢測也被形象地稱為“液體活檢”?？傊?，DOG-1能否用于預(yù)后評估和納入危險度分級尚存爭議，Ki-67要想獲得與傳統(tǒng)核分裂象計數(shù)同等地位或取而代之，亦需進一步大樣本、前瞻性的研究作為循證依據(jù)。

綜上所述，Ki-67和DOG-1對GIST預(yù)后分別具有中等和較高預(yù)測效能，可作為重要預(yù)后影響因子，結(jié)合核分裂象計數(shù)和NIH危險度分級綜合評估患者預(yù)后，可增進患者獲益。但是，本研究樣本量小、隨訪時間短，加之目前有關(guān)Ki-67和DOG-1對GIST預(yù)后評估多為單中心研究，尚需更多大樣本、多中心、前瞻性、長時段的研究作為循證依據(jù)，才能判定是否將Ki67和DOG-1納入危險程度分層，進一步改進NIH危險度分級標準，增加其準確性和實用性。