秦艽對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠RAS/RAF通路及神經(jīng)功能障礙的影響

張華軍，刁正文，杜春富，李秋霖

缺血性腦卒中又稱為腦梗死，是臨床心腦血管科的一種常見疾病，是由于血管堵塞引起腦部供血不足，進(jìn)而腦組織局部出現(xiàn)壞死的疾病，該病發(fā)病急，病情進(jìn)展迅速，致死率、致殘率較高，若治療不及時(shí)，易造成偏癱等，甚至導(dǎo)致死亡[1-2]。炎癥反應(yīng)在腦梗死病情進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，抑制炎癥可減輕腦缺血再灌注后腦損傷[3]，是治療缺血性腦卒中的有效手段。秦艽是一種傳統(tǒng)中藥，具有清除自由基、抗炎、抗氧化的藥理作用，可提高肝臟抗氧化應(yīng)激水平，抑制肝臟炎癥，對(duì)脂肪肝及痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠均有較好的治療效果[4-5]。大鼠肉瘤(RAS)/加速纖維肉瘤(RAF)通路在體內(nèi)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、DNA損傷等病理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，激活RAS/RAF信號(hào)通路，可增強(qiáng)下游細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)磷酸化水平，引發(fā)炎癥，造成肝細(xì)胞損傷[6-7]，通過下調(diào)RAS表達(dá)，抑制炎癥緩解腦缺血再灌注損傷[8]，由此可知RAS/RAF信號(hào)通路可能是治療缺血性腦卒中的靶點(diǎn)。本研究觀察秦艽對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠RAS/RAF通路及神經(jīng)功能障礙的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SCXK(滬)2020-0002]，雄性，體質(zhì)量180～220 g，清潔級(jí)，在溫度23～25 ℃，濕度50%～60%的動(dòng)物房中飼養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 秦艽(貨號(hào)DYQ8080)由上海恒斐生物科技有限公司提供；尼莫地平(貨號(hào)D14202003034)由山東新華制藥股份有限公司提供；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)(貨號(hào)298964)由Amresco公司提供；大鼠白細(xì)胞介素(IL)-6酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(貨號(hào)EK0412)由上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司提供；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(ab245880)、大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒(貨號(hào)ab100785)、RIPA裂解液(貨號(hào)ab288006)、二喹啉甲酸法(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒Ⅱ(貨號(hào)ab287853)、兔源RAS一抗(貨號(hào)ab52939)、兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗(貨號(hào)ab181602)、兔源RAF一抗(貨號(hào)ab137435)、兔源p-RAF一抗(貨號(hào)ab173539)、兔源ERK1/2一抗(貨號(hào)ab32537)、兔源p-ERK1/2一抗(貨號(hào)ab192591)、羊抗兔二抗(貨號(hào)ab150077)，由美國Abcam公司提供；十二烷基酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒(貨號(hào)P1200)、TBST緩沖液(貨號(hào)T1081)，由北京索萊寶公司提供。酶標(biāo)儀(型號(hào)XElx800)購自美國Perkin Elmer公司；光學(xué)顯微鏡(型號(hào)SMZ745)購自日本尼康公司；切片機(jī)(型號(hào)CM3050S)購自德國Leica公司；小型蛋白電泳儀(型號(hào)1659001)、轉(zhuǎn)膜儀(型號(hào)Trans-Blot Turbo)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 腦缺血再灌注大鼠模型制備及分組 參照文獻(xiàn)[9]制備腦缺血再灌注大鼠模型：取65只SD大鼠，向腹腔內(nèi)注入45 mg/kg的2.5%戊巴比妥鈉溶液，待大鼠深度麻醉后脫去頸部毛發(fā)，75%乙醇消毒后逐層剪開頸部皮膚與肌肉，找到右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)及頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，游離后將CCA與ECA近心端結(jié)扎，同時(shí)夾閉ICA，于ECA近分叉處剪一個(gè)小切口后插入直徑0.24 mm的栓線，放開ICA，繼續(xù)插入拴線直到大腦中動(dòng)脈起始處，將拴線尾端暴露于外后，逐層縫合，缺血2 h后，抽出栓線，再灌注48 h，大鼠模型制備完成。待大鼠蘇醒后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，參照Longa分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[10]：0分為大鼠神經(jīng)功能無缺損；1分為大鼠對(duì)側(cè)前爪不能伸展完全；2分為大鼠行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分為大鼠行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4分為大鼠不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失；5分為大鼠死亡。神經(jīng)功能缺損評(píng)分1～3分為大鼠模型制備成功，共60只，隨機(jī)分為模型組、尼莫地平組、秦艽低劑量組、秦艽中劑量組、秦艽高劑量組，每組12只；取12只正常SD大鼠切開頸部游離CCA、ECA、ICA，但不插栓線，作為假手術(shù)組。

秦艽生藥材經(jīng)粉碎后以95%乙醇溶液(比例為1∶9)浸泡24 h，置于冷凝回流裝置中，加熱回流3 h，過濾后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液中的乙醇完全蒸發(fā)，即得到秦艽提取物浸膏，參照文獻(xiàn)[11]劑量作為人鼠劑量換算后給藥：秦艽提取物溶解于蒸餾水中分別制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 g/mL、0.4 g/mL、0.8 g/mL的藥液，秦艽各劑量組大鼠每日以10 mL/kg劑量灌胃，將尼莫地平[12]配制為濃度1 mg/mL溶液，尼莫地平組大鼠灌胃10 mL/kg尼莫地平溶液，假手術(shù)組與模型組大鼠灌胃10 mL/kg生理鹽水。每組每日治療1次，持續(xù)7 d。

1.2.2 大鼠神經(jīng)功能缺損、腦梗死面積測(cè)量及標(biāo)本收集 各組大鼠末次給藥后24 h，參照Longa分級(jí)法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。使用5 mL注射器刺入各組大鼠尾靜脈取血2 mL，靜置后，以3 000 r/min，4 ℃離心15 min，收集上清液，儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆?。各組分別取6只大鼠斷頭處死，取出大腦，沿冠狀切面切成5片，厚度大致相同，以2%的TTC染液浸沒切片染色(室溫，避光，30 min)，蒸餾水漂洗后固定(4%多聚甲醛，4 ℃，過夜)，采集切片圖像后采用Image pro軟件計(jì)算腦梗死面積，腦梗死面積(%)=全腦梗死面積/全腦片面積×100%。各組剩余的6只大鼠斷頭處死后分離腦組織，剪取約1.5 g置于RIPA裂解液(含有蛋白酶抑制劑)中，使用勻漿機(jī)制備勻漿液，以3 000 r/min，4 ℃，離心20 min，取上清液，采用BCA法測(cè)定各組樣品中總蛋白濃度，具體操作參照BCA試劑盒說明書進(jìn)行，儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 大鼠海馬組織蘇木精-伊紅(HE)染色 剩余腦組織，固定(4%多聚甲醛，4 ℃，過夜)、脫水(80%、90%、95%、100%乙醇依次孵育)，采用二甲苯孵育透明，以熱石蠟包埋成塊后固定在切片機(jī)中進(jìn)行病理切片，二甲苯孵育脫蠟、100%、95%、90%、80%梯度乙醇水化，參照HE試劑盒說明書進(jìn)行HE染色后漂洗、脫水、透明、封片，采用光學(xué)顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)。

1.2.4 大鼠腦組織IL-6、TNF-α水平檢測(cè) 取出1.2.2中的腦組織蛋白樣品液，冰水浴中緩慢解凍后采用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-6、TNF-α水平，參照說明書操作。

1.2.5 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)大鼠腦組織RAS/RAF通路相關(guān)蛋白表達(dá) 將1.2.4中剩余的各組蛋白樣品液根據(jù)1.2.2將濃度調(diào)至相同后，取20 μL，采用電泳分離蛋白，之后通過濕轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，室溫孵育5%脫脂奶粉溶液2 h，兔源GAPDH、RAS、RAF、p-RAF、ERK1/2、p-ERK1/2一抗4℃孵育過夜，稀釋比例分別為1∶2 000、1∶2 000、1∶5 000、1∶2 000、1∶5 000、1∶2 000，TBST漂洗3次后以羊抗兔二抗室溫孵育2 h，稀釋比例為1∶2 000，TBST漂洗3次后化學(xué)發(fā)光法顯色，以Quantity One軟件分析量化各組蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 秦艽提取物對(duì)大鼠神經(jīng)功能的影響 模型組與假手術(shù)組比較，大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。秦艽各劑量組、尼莫地平組較模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低，且秦艽各劑量組呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；秦艽高劑量組與尼莫地平組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較(±s) 單位：分

2.2 秦艽提取物對(duì)大鼠腦梗死的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死面積增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。秦艽各劑量組、尼莫地平組較模型組大鼠腦梗死面積減小，且秦艽各劑量組呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；秦艽高劑量組與尼莫地平組大鼠腦梗死面積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖1、表2。

圖1 各組大鼠腦組織TTC染色結(jié)果

表2 各組大鼠腦梗死面積比較(±s) 單位：%

2.3 秦艽提取物對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元的影響 假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元無病理損傷。模型組大鼠海馬神經(jīng)元皺縮壞死、分布散亂、數(shù)量減少，呈嚴(yán)重的病理損傷；秦艽各劑量組、尼莫地平組較模型組大鼠海馬神經(jīng)元病理損傷減輕，且病理損傷程度隨著秦艽劑量增加而減輕；秦艽高劑量組與尼莫地平組海馬神經(jīng)元病理損傷程度無明顯差異。詳見圖2。

圖2 各組大鼠腦組織海馬神經(jīng)元ca1區(qū)HE染色圖(×200)

2.4 秦艽提取物對(duì)大鼠腦組織TNF-α、IL-6含量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織TNF-α、IL-6含量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。秦艽各劑量組、尼莫地平組較模型組大鼠腦組織TNF-α、IL-6含量降低，且秦艽各劑量組呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；秦艽高劑量組與尼莫地平組腦組織TNF-α、IL-6含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠腦組織TNF-α、IL-6含量比較(±s，n=12) 單位：pg/g

2.5 秦艽提取物對(duì)大鼠腦組織RAS/RAF通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織RAS/RAF通路相關(guān)蛋白R(shí)AS表達(dá)水平、p-RAF/RAF、p-ERK1/2/ERK1/2升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。秦艽各劑量組、尼莫地平組較模型組大鼠腦組織RAS表達(dá)水平、p-RAF/RAF、p-ERK1/2/ERK1/2水平降低，且秦艽各劑量組呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；秦艽高劑量組與尼莫地平組大鼠腦組織RAS表達(dá)水平、p-RAF/RAF、p-ERK1/2/ERK1/2水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖3、表4。

圖3 各組大鼠腦組織RAS/RAF通路相關(guān)蛋白條帶圖(A為假手術(shù)組；B為模型組；C為秦艽低劑量組；D為秦艽中劑量組；E為秦艽高劑量組；F為尼莫地平組)

3 討 論

近年來，腦卒中發(fā)病率呈升高趨勢(shì)，治療窗口期短，預(yù)后差，多數(shù)病人喪失活動(dòng)及語言功能，引發(fā)偏癱等神經(jīng)功能障礙，極大影響病人的身心健康，造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[13]。腦卒中病人血栓形成后，腦組織缺血缺氧及血液再灌注促使TNF-α、IL-6等促炎因子大量合成，誘發(fā)炎癥，致使神經(jīng)細(xì)胞壞死、凋亡，是造成腦卒中病人腦損傷及神經(jīng)功能障礙的主要致病機(jī)制[14]。本研究以大腦中動(dòng)脈線栓法建立腦缺血再灌注模型，結(jié)果顯示，相較于假手術(shù)組，造模大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量減少，分布散亂且皺縮壞死，表現(xiàn)為嚴(yán)重的病理損傷，且神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死面積、腦組織IL-6、TNF-α水平均升高，表明造模大鼠腦內(nèi)促炎因子大量合成分泌，引發(fā)神經(jīng)炎癥，致使海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，損傷大鼠神經(jīng)功能，提示腦缺血再灌注模型建立成功。

中醫(yī)學(xué)稱腦卒中為中風(fēng)，機(jī)體正氣虧虛、外風(fēng)入侵、耗傷正氣、筋脈阻滯不通是發(fā)病機(jī)制。秦艽有祛風(fēng)除濕、舒筋活血的功效，可減少機(jī)體自由基，降低氧化應(yīng)激水平，抑制炎癥，改善風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀，并對(duì)腦卒中后上肢痙攣性癱瘓具有較好的療效[15-17]，但具體的作用機(jī)制尚未明確。RAS/RAF是機(jī)體調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要通路，RAS蛋白在細(xì)胞外信號(hào)刺激下，可磷酸化激活RAF，進(jìn)而促使ERK磷酸化，引起炎性因子合成分泌增加，誘發(fā)炎癥，降低RAS表達(dá)，減弱RAF、ERK磷酸化水平，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞激活和炎癥發(fā)生發(fā)展，進(jìn)而減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)功能缺損，緩解腦損傷[18-20]，因而推測(cè)秦艽改善腦卒中后腦損傷及神經(jīng)功能障礙的作用機(jī)制可能是下調(diào)RAS/RAF信號(hào)。

本研究采用秦艽提取物處理腦缺血再灌注模型大鼠，結(jié)果顯示，相較于模型組，秦艽各劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死面積、腦組織IL-6和TNF-α水平、RAS/RAF通路相關(guān)蛋白R(shí)AS表達(dá)水平、p-RAF/RAF、p-ERK1/2/ERK1/2均降低，海馬神經(jīng)元病理損傷均減輕，且秦艽各劑量組呈劑量依賴性，表明秦艽提取物可下調(diào)RAS/RAF信號(hào)表達(dá)，減少促炎因子合成，抑制炎性反應(yīng)，減小腦缺血再灌注大鼠腦梗死面積，減輕海馬神經(jīng)元損傷，修復(fù)神經(jīng)功能障礙。

綜上所述，秦艽提取物可抑制腦缺血再灌注后大腦炎癥反應(yīng)，減輕海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷，改善大鼠神經(jīng)功能障礙，抑制RAS/RAF信號(hào)通路傳導(dǎo)可能是其作用機(jī)制。本研究為秦艽應(yīng)用于腦卒中的臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但未深入探討藥理機(jī)制，未采用RAS/RAF通路抑制劑和激活劑進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證，今后需進(jìn)一步深入研究。