木棉花提取物調(diào)控lncRNA TALNEC2表達對缺氧/復氧心肌細胞氧化應激損傷的保護作用

陳 靜，李 芹

溶栓治療或經(jīng)皮冠狀動脈介入治療及時恢復冠狀動脈血流是減輕急性心肌缺血損傷，降低死亡率的有效策略，然而再灌注可誘發(fā)心肌缺血/再灌注(I/R)損傷。氧化應激、細胞凋亡、炎癥反應是I/R發(fā)生的關鍵因素[1]。因此，針對上述因素制定有效的干預措施或策略對防止心肌I/R損傷具有重要的臨床意義。相關研究顯示，藥物預處理是一種有效的心肌保護手段，可增強機體對I/R耐受能力，縮小心肌損傷面積，改善預后[2]。木棉花是木棉科木棉屬植物木棉Bombax malabaricum DC.的干燥花，富含總黃酮、多糖等化學成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血脂、降血糖、保肝等藥理活性，是中藥方劑、涼茶的重要原料[3]。相關研究顯示，木棉花提取物可清除內(nèi)皮細胞內(nèi)活性氧，抑制氧化應激，對過氧化氫誘導的內(nèi)皮細胞損傷具有保護作用[4]。木棉花提取物通過調(diào)控微小RNA(miR)-30b-3p表達可抑制骨關節(jié)炎軟骨細胞炎癥反應和細胞凋亡[5]。然而木棉花提取物對心肌細胞I/R損傷的影響尚未明確。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是人類基因組中新發(fā)現(xiàn)的一類包含大于200個核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄本，其在細胞分化、增殖、凋亡和炎癥等生理過程中發(fā)揮著重要作用，lncRNA表達改變與心肌I/R損傷相關[6]。有研究顯示，心肌缺血病人血清2號染色體表達的腫瘤相關lncRNA(TALNEC2)表達上調(diào)，過表達lncRNA TALNEC2可激活Wnt/β-catenin通路，加重心肌細胞缺氧損傷，是心肌缺血的潛在治療靶點[7]。但lncRNA TALNEC2在心肌I/R損傷中的作用尚未明確。本研究通過建立H9c2心肌細胞缺氧/復氧模型模擬心肌I/R損傷過程[8]，探討木棉花提取物對心肌I/R損傷的保護作用，并通過lncRNA TALNEC2探討其保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 大鼠心肌細胞H9c2購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心；木棉由醫(yī)院中藥房提供；Lipofectamine 2000、Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；細胞計數(shù)試劑盒(CCK)-8購自上海貝博生物公司；lncRNA TALNEC2的小干擾RNA(si-lncRNA TALNEC2)及其陰性對照(si-NC)、lncRNA TALNEC2的過表達載體(pcDNA-lncRNA TALNEC2)、空載體質(zhì)粒(pcDNA)購自上海生工生物公司；丙二醛(MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測試劑盒購自北京索萊寶生物公司；膜聯(lián)蛋白-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技公司；β-actin兔多克隆抗體、Bax兔單克隆抗體(ab32503)、Cleaved-Caspase-3兔單克隆抗體(ab32042)、山羊抗兔IgG二抗(ab205781)購自美國Abcam公司；PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq購自大連Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 木棉花提取物的制備 參照文獻[5]方法制備木棉花提取物：取干燥木棉花，按照料液比1∶40加入60%乙醇，微波(240 W)處理2 min，減壓濃縮，40%NaOH調(diào)節(jié)pH值至9～10，靜置1 h，3 500 r/min離心15 min。收集上清液，石油醚萃取2次，取水相用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至5～6，靜置1 h，3 500 r/min離心15 min，取上清液用乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯相進行濃縮干燥即為木棉花提取物浸膏。采用NaNO2-Al(NO3)3顯色法在500 nm下測定木棉花提取物含量，以蘆丁為對照品制作標準曲線，經(jīng)測定浸膏中木棉花總黃酮含量占45.68%。使用無血清DMEM培養(yǎng)基配制木棉花提取物為不同實驗濃度，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細胞培養(yǎng) H9c2細胞采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置入含5%CO2、95%空氣、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞80%匯合時，按照1∶4比例傳代，取第3代對數(shù)期細胞進行實驗。

1.2.3 CCK-8法檢測木棉花提取物對H9c2細胞的毒性作用 將H9c2細胞以每孔5×103個密度接種到96孔板，細胞貼壁后，更換為木棉花提取物終濃度為10 mg/L(低劑量組)、40 mg/L(中劑量組)、60 mg/L(高劑量組)的培養(yǎng)液[4]孵育細胞24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱孵育2.5 h，酶標儀檢測450 nm處吸光度(A)值。

1.2.4 模型構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、實驗分組 參照文獻[8]方法建立心肌細胞缺氧/復氧損傷模型，將H9c2細胞接種于無血清培養(yǎng)基并置于缺氧密閉裝置中培養(yǎng)6 h，缺氧培養(yǎng)后更換為含10%胎牛血清常規(guī)培養(yǎng)基于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。

細胞轉(zhuǎn)染：將H9c2細胞按照每孔2×105個的密度接種于6孔板，利用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染si-lncRNA TALNEC2、si-NC、pcDNA-lncRNA TALNEC2、pcDNA至50%匯合細胞，轉(zhuǎn)染48 h時收集細胞進行后續(xù)實驗。

實驗分組：對照組為正常培養(yǎng)的H9c2細胞；模型組缺氧/復氧處理的H9c2細胞；低劑量+模型組、中劑量+模型組、高劑量+模型組在缺氧/復氧處理前，分別給予H9c2細胞木棉花提取物終濃度為10 mg/L、40 mg/L、60 mg/L的培養(yǎng)液處理24 h[4]，其余操作同模型組；si-NC+模型組、si-lncRNA TALNEC2+模型組將轉(zhuǎn)染si-NC、轉(zhuǎn)染si-lncRNA TALNEC2的H9c2細胞進行缺氧/復氧處理。pcDNA+高劑量+模型組、pcDNA-lncRNA TALNEC2+高劑量+模型組于缺氧/復氧處理前，給予轉(zhuǎn)染pcDNA、轉(zhuǎn)染pcDNA-lncRNA TALNEC2的H9c2細胞木棉花提取物終濃度為60 mg/L的培養(yǎng)液處理24 h，其余操作同模型組。

1.2.5 酶標法檢測SOD和LDH活力、MDA含量 H9c2細胞處理后，分別收集細胞和培養(yǎng)液上清液至干凈的離心管中。采用LDH活性檢測試劑盒分析培養(yǎng)液上清液LDH活力，向細胞沉淀中加入提取液，超聲破碎細胞，收集細胞上清液，采用MDA檢測試劑盒、SOD活性檢測試劑盒測定細胞內(nèi)MDA含量和SOD活性。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 將各組H9c2細胞收集在5 mL離心管中，使用預冷磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌1次，并用1×結(jié)合緩沖液調(diào)整細胞終濃度為1×106個/mL。取100 μL細胞懸液至流式管，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI室溫避光孵育15 min，再加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液輕輕混勻。1 h內(nèi)采用流式細胞儀分析各組細胞樣品凋亡情況。

1.2.7 蛋白免疫印記法檢測Cleaved-Caspase-3和Bax蛋白表達 RIPA緩沖液提取各組H9c2細胞總蛋白，細胞蛋白經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。在5%脫脂牛奶中封閉2 h后，將膜與Bax、Cleaved-Caspase-3、β-actin特異性一抗孵育，稀釋比例為1∶1 000。4 ℃過夜孵育后，使用對應的抗兔IgG二抗室溫孵育膜2 h。將PVDF膜置于保鮮膜上，加入滴加化學發(fā)光試劑，并轉(zhuǎn)移膜至凝膠成像儀中曝光顯影，采用Image Lab軟件分析目的條帶的相對灰度值。

1.2.8 實時定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測lncRNA TALNEC2表達 Trizol試劑提取各組培養(yǎng)細胞總RNA，用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq進行RT-qPCR分析lncRNA TALNEC2表達。以β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算lncRNA TALNEC2相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度木棉花提取物對心肌細胞H9c2毒性的影響 與對照組比較，不同濃度木棉花提取物處理后H9c2細胞活力無變化，提示10 ～160 mg/L木棉花提取物對H9c2無毒性作用。詳見表1。

表1 不同濃度木棉花提取物對心肌細胞H9c2毒性的影響(±s，n=9)

2.2 木棉花提取物對缺氧/復氧心肌細胞H9c2凋亡、氧化應激損傷的影響 與對照組比較，模型組H9c2細胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3和Bax蛋白表達量、培養(yǎng)液LDH活性增加(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)，MDA水平增加(P<0.05)；與模型組比較，低劑量+模型組、中劑量+模型組、高劑量+模型組H9c2細胞凋亡率、Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白表達量、培養(yǎng)液LDH活性降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)。詳見圖1和表2。

圖1 木棉花提取物對缺氧/復氧心肌細胞H9c2氧化應激損傷的影響(A為流式細胞儀檢測細胞凋亡；B為Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達條帶圖)

2.3 木棉花提取物對lncRNA TALNEC2表達的影響 與對照組比較，模型組H9c2細胞lncRNA TALNEC2相對水平升高(P<0.05)；與模型組比較，低劑量+模型組、中劑量+模型組、高劑量+模型組H9c2細胞lncRNA TALNEC2相對水平降低(P<0.05)。詳見表3。

表3 木棉花提取物對lncRNA TALNEC2表達的影響(±s)

2.4 下調(diào)lncRNA TALNEC2表達對缺氧/復氧心肌細胞H9c2氧化應激損傷的影響 與si-NC+模型組比較，si-lncRNA TALNEC2+模型組H9c2細胞lncRNA TALNEC2相對水平降低(P<0.05)，細胞凋亡率、Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白表達量、培養(yǎng)液中LDH活性降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)。詳見圖2和表4。

圖2 Western Blot檢測Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白的表達

2.5 lncRNA TALNEC2逆轉(zhuǎn)木棉花提取物對缺氧/復氧心肌細胞H9c2氧化應激損傷的影響 與pcDNA+高劑量+模型組比較，pcDNA-lncRNA TALNEC2+高劑量+模型組H9c2細胞lncRNA TALNEC2水平升高(P<0.05)，細胞凋亡率、Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白表達量、培養(yǎng)液LDH活性升高(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.05)。詳見圖3和表5。

圖3 兩組Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達條帶圖

3 討 論

H9c2細胞是來源于胚胎大鼠心臟組織的亞克隆細胞株，已廣泛用于建立缺氧/復氧損傷細胞模型[9-10]。本研究中低劑量、中劑量、高劑量的木棉花提取物預處理對H9c2細胞活力影響不大，表明木棉花提取物對H9c2細胞無毒性作用。心肌在I/R過程中產(chǎn)生大量活性氧，并攻擊生物膜，導致脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA產(chǎn)生，促進LDH釋放，SOD等抗氧化酶可清除活性氧，在預防脂質(zhì)過氧化和心肌細胞損傷過程中發(fā)揮著重要的作用[11-12]。本研究中，缺氧/復氧處理可增加H9c2細胞MDA含量，降低SOD活性，增加細胞培養(yǎng)液LDH活性。本研究中木棉花提取物預處理可有效緩解缺氧/復氧誘導的氧化應激損傷，與盧秋玉等[4]報道的抗氧化損傷作用一致。心肌I/R后心肌細胞凋亡增加。本研究中木棉花提取物預處理可抑制缺氧/復氧誘導的細胞凋亡。Bax是Bcl-2家族的重要成員，受到凋亡刺激時Bax移位至線粒體導致細胞色素C釋放，引發(fā)Caspase-9活化，并激活凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3，發(fā)揮促凋亡功能[13]。本研究中木棉花提取物預處理可降低缺氧/復氧誘導的促凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3和Bax表達上調(diào)，與木棉花提取物的抗凋亡作用一致。上述研究結(jié)果表明，木棉花提取物通過抑制細胞凋亡和氧化應激，對缺氧/復氧心肌細胞損傷發(fā)揮保護作用。

lncRNA參與調(diào)控心肌細胞凋亡、自噬、壞死、氧化應激、炎癥和線粒體功能障礙，在心肌I/R發(fā)生、進展中發(fā)揮著重要作用，具有治療心肌I/R損傷的潛力[14]。lncRNA TALNEC2最初被證實參與膠質(zhì)瘤、乳腺癌進展，下調(diào)lncRNA TALNEC2，阻滯癌細胞周期至G0/G1期，抑制癌細胞增殖能力[15-16]。有研究顯示，腦I/R術后小鼠大腦中糖氧剝奪誘導的神經(jīng)母細胞瘤細胞N2a中l(wèi)ncRNA TALNEC2表達上調(diào)，敲減lncRNA TALNEC2可抑制糖氧剝奪誘導的N2a細胞凋亡，并逆轉(zhuǎn)I/R誘導的腦損傷和神經(jīng)功能障礙[17]。淫羊藿苷通過下調(diào)lncRNA TALNEC2表達減輕缺氧誘導的成骨細胞損傷[18]。本研究中缺氧/復氧處理可增加H9c2中l(wèi)ncRNA TALNEC2表達水平，木棉花提取物預處理可抑制缺氧/復氧誘導的lncRNA TALNEC2表達上調(diào)，提示lncRNA TALNEC2表達可能介導木棉花提取物對H9c2細胞缺氧/復氧損傷的保護作用。驗證lncRNA TALNEC2功能顯示，下調(diào)lncRNA TALNEC2表達可抑制缺氧/復氧誘導的細胞凋亡，增加SOD活性，降低MDA含量，并抑制LDH釋放，保護H9c2細胞免受缺氧/復氧誘導的氧化應激損傷，與木棉花提取物預處理的保護作用相近。進一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達lncRNA TALNEC2可削弱木棉花提取物預處理對缺氧/復氧H9c2細胞凋亡和氧化應激損傷的影響，表明木棉花提取物通過下調(diào)lncRNA TALNEC2表達，對缺氧/復氧心肌細胞氧化損傷發(fā)揮保護作用。

總之，木棉花提取物可減輕缺氧/復氧誘導的心肌細胞氧化應激損傷，其機制是通過下調(diào)lncRNA TALNEC2表達實現(xiàn)的，初步揭示了木棉花提取物的心肌保護機制，為木棉花提取物防治心肌I/R損傷提供了實驗依據(jù)。