丹參酮IIA 通過抑制RIP3/FUNDC1 信號通路減輕LPS 誘導(dǎo)的小鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡

張 舒，蘇保林，王亮亮，湯水福，陳剛毅

廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科，廣東 廣州 510405

膿毒血癥是危重患者發(fā)生AKI的主要病因之一，盡管目前診療水平不斷提高，但膿毒血癥AKI在危重患者中的患病率及死亡率仍較高［1］。因此積極探索膿毒血癥AKI的發(fā)病機(jī)制，對尋找有效的診治方案具有重要的臨床意義。

腎小管上皮細(xì)胞（RTECs）損傷是AKI發(fā)病的重要原因［2,3］，內(nèi)毒素通過受體相互作用蛋白激酶（RIP）3導(dǎo)致RTECs死亡是AKI的重要機(jī)制。一方面，RIP3可介導(dǎo)RTEC發(fā)生凋亡性壞死［4-6］；另一方面，它可以通過介導(dǎo)FUN14結(jié)構(gòu)域蛋白1（FUNDC 1）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［7］。FUNDC1是一種線粒體受體蛋白，參與線粒體自噬、細(xì)胞凋亡及線粒體Ca2+穩(wěn)態(tài)的調(diào)控，近年來研究發(fā)現(xiàn)FUNDC1在腎臟疾病中發(fā)揮重要作用［7-9］。然而RIP3/FUNDC1信號通路在膿毒血癥AKI中的作用，目前尚無報(bào)道。

丹參作為臨床常用中藥，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩等功效，丹參酮IIA是從丹參中提取的脂溶性化合物，具有廣泛的生理活性，包括抗氧化、抗凋亡、抗炎等［10,11］。近年來研究表明，丹參酮IIA對脂多糖所致的AKI動(dòng)物具有防治作用［12,13］，但其機(jī)制尚不清楚。

本研究分別建立LPS誘導(dǎo)的膿毒血癥AKI小鼠模型以及LPS刺激的HK-2細(xì)胞凋亡細(xì)胞模型，觀察丹參酮IIA 對膿毒血癥AKI 的保護(hù)作用以及其對RIP3/FUNDC1通路的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 丹參酮IIA，分子式C19H18O3，相對分子質(zhì)量：294.34（成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司），用DSMO 配制為1g/L 的原液，用時(shí)根據(jù)需要應(yīng)用培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。DMEM/F12培養(yǎng)基（CORNING）、二甲基亞砜（DMSO）(Sigma)、脂多糖（L-2880）（Sigma）、RIP3 siRNA（廣州銳博生物有限公司）、胎牛血清（FBS）（Hyclone）、Anti-RIP3（Cat No.17563-1-AP）（Proteintech）、Anti-cleaved-caspase3 抗 體（ab2302）（Abcam）、Anti-p-FUNDC 1（Tyr18）（Abgent）、TUNEL試劑盒（瑞士羅氏公司）、Scr、BUN試劑盒（美國博世生物技術(shù)有限公司）、糖原PAS染色試劑盒（Solarbio Life Sciences）。

1.1.2 細(xì)胞 人源性腎小管上皮細(xì)胞株HK-2細(xì)胞（廣州永諾生物科技有限公司）。

1.1.3 儀器 超凈工作臺（Thermo Fisher）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher）；電泳儀（Bio-Rad）；垂直電泳槽和Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽（Bio-Rad）；研究級正置熒光顯微鏡Eclipse Ni-E（Nikon）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物建模 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過廣州永諾生物動(dòng)物中心倫理審查（編號IACUC-AEWC-F2109012）。30只雄性C57BL/6小鼠飼養(yǎng)于廣州永諾生物科技有限公司，10只/組，飼養(yǎng)于SPF級的動(dòng)物房，小鼠自由進(jìn)水及進(jìn)食。造模前全部小鼠均禁食12 h，造模條件如下：對照組予以腹腔注射與LPS等體積的生理鹽水；LPS組小鼠腹腔注射10 mg/kg LPS，刺激24 h；LPS+丹參酮IIA 組預(yù)先腹腔注射10 mg/kg 丹參酮IIA 處理15 min 再給予10 mg/kg LPS作用24 h。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) HK-2細(xì)胞置于有10%胎牛血清的培養(yǎng)基（DMEM/F12）、5%CO237 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每1～2 d換液，細(xì)胞生長至密度約90%時(shí)即可傳代。實(shí)驗(yàn)分為5組：空白對照組、LPS組（LPS 10 μg/mL，24 h）、LPS+丹參酮IIA 組（丹參酮IIA 10 mg/L 預(yù)處理1 h后，再給予LPS 10 μg/mL 刺激24 h）、LPS+siNC 組（LPS 10 μg/mL+50 nmol/L siNC）、LPS+siRIP3組（LPS 10 μg/mL+50 nmol/L siRIP3）。

1.2.3 TUNEL染色 將約1×104細(xì)胞接種于無菌蓋玻片上，培養(yǎng)24～48 h，進(jìn)行相應(yīng)刺激后，PBS清洗細(xì)胞1次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，用0.1%Triton X-100透化2 min。按說明書配置TUNEL檢測液，將TUNEL檢測液滴加至各待檢測樣本中，37 ℃避光孵育60 min。PBS清洗3次后，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 siRNA干擾 去除細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞，加入適量無血清DMEM/F12 培養(yǎng)基。將已混勻的siRNA-Lipo2000混合液培養(yǎng)基中，使含有siRNA的混合液均勻分布于細(xì)胞表面，并將培養(yǎng)皿放入5%CO237 ℃培養(yǎng)箱中。6～8 h后觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況及細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞表面出現(xiàn)透亮的圓孔，提示轉(zhuǎn)染成功，即可更換10%FBS完全培養(yǎng)基。

1.2.5 Western blot檢測 去除細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞后，加入細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞，收集上清液，離心后取上清液，根據(jù)BCA法檢測蛋白濃度，各組樣本根據(jù)相同質(zhì)量配齊蛋白，加入Loading buffer后煮沸后加樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉，一抗孵育過夜，二抗孵育后顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析，各組間的兩兩比較采用Bonferroni多重比較法。當(dāng)P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮IIA改善小鼠膿毒血癥腎損傷

應(yīng)用LPS刺激小鼠建立膿毒血癥AKI小鼠模型，LPS 刺激小鼠24 h 后，Scr 及BUN 明顯高于對照組（P＜0.001，圖1C），腎組織PAS染色顯示，LPS組小鼠近段RTEC出現(xiàn)空泡變性，管腔狹窄，上皮細(xì)胞脫落，基底膜裸露，而對照組沒有這些改變（圖1A、B）。這些結(jié)果表明LPS刺激成功建立了膿毒血癥AKI模型，損傷部位主要為近段RTEC。應(yīng)用丹參酮IIA預(yù)處理后（LPS+丹參酮IIA組），小鼠Scr及BUN水平較LPS組下降（P＜0.001），腎組織病理顯示，和LPS組比較，近段RTEC空泡變性、上皮細(xì)胞脫落、基底膜裸露等損傷改變顯著減輕。

圖1 各組小鼠腎組織腎臟病理情況（PAS染色）及腎功能水平（Scr、BUN）Fig.1 Renal pathology and serum creatinine and blood urea nitrogen levels in the mice in different groups.A:Representative acid-Schiff-stained kidney sections in the three groups (PAS staining,original magnification: ×200).B:Quantification of tubular injury(10 fields for each kidney section).C:Serum creatinine and blood urea nitrogen levels in the 3 groups.*P＜0.001 vs control,#P＜0.001 vs LPS.

2.2 丹參酮IIA可抑制小鼠RIP3/FUNDC1信號通路及腎臟凋亡水平

應(yīng)用Western blot檢測腎組織中Cleaved-caspase3的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS組腎組織中Cleaved-caspase3表達(dá)上調(diào)，丹參酮IIA預(yù)處理后（LPS+丹參酮IIA 組），再給予LPS 刺激，小鼠腎組織中Cleaved-caspase3表達(dá)水平較LPS組明顯下降（圖2A、B）。

檢測腎組織中RIP3及p18-FUNDC1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示LPS刺激后，腎組織中RIP3、p18-FUNDC表達(dá)上調(diào)，而LPS+丹參酮IIA組，RIP3、p18-FUNDC表達(dá)水平較LPS組下降（圖2A、B）。

圖2 各組小鼠腎組織中p18-FUNDC1、C-caspase3、RIPK3表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of p18-FUNDC1,cleaved caspase-3 and RIP3 in the kidney of the mice detected by Western blotting.A:Western blots of p18-FUNDC1,C-caspase-3 and RIP3.B:Quantification of p18-FUNDC1,C-caspase-3 and RIP3 protein expressions.*P＜0.001 vs control,#P＜0.001 vs LPS.

2.3 丹參酮IIA可減輕LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡水平

與對照組相比，LPS刺激HK-2細(xì)胞24 h后（LPS組），細(xì)胞凋亡水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。丹參酮IIA預(yù)處理后，LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞（LPS+丹參酮IIA組）凋亡水平明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3A、B）。

通過Western blot 檢測各組凋亡蛋白Cleavedcaspase3表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，LPS刺激后，HK-2細(xì)胞Cleaved-caspase3表達(dá)增加，丹參酮IIA預(yù)處理后，LPS刺激下的HK-2細(xì)胞表達(dá)Cleaved-caspase3表達(dá)較LPS組下降（圖4A、B）。

2.4 抑制RIP3/FUNDC1信號通路可減輕HK-2細(xì)胞凋亡水平

通過TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siRIP3后給予LPS刺激（LPS+siRIP3組），細(xì)胞凋亡水平明顯較LPS組減少（圖3A、B）。Westernblot檢測各組細(xì)胞Cleaved-caspase-3的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，LPS+siRIP3 組細(xì)胞蛋白Cleavedcaspase-3表達(dá)較LPS組明顯下調(diào)（圖4A、B，P＜0.05）。

圖3 LPS刺激下不同處理組細(xì)胞凋亡水平Fig.3 Apoptosis of HK-2 cells with LPS exposure in different treatment groups.A:TUNEL staining of the cells with different treatments (×200).B:Quantification of TUNEL-positive cells in each group.*P＜0.05 vs control,#P＜0.05 vs LPS.*P＜0.001 vs control,#P＜0.001 vs LPS.

通過Western blot各組細(xì)胞p18-FUNDC1表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siRIP3后給予LPS刺激（LPS+siRIP3組），而p18-FUNDC1的表達(dá)水平下降（P＜0.05）。

2.5 丹參酮IIA可抑制HK-2細(xì)胞RIP3/p18-FUNDC1信號通路

通過Western blot檢測各組RIP3及p18-FUNDC1的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，LPS組RIP3、p18-FUNDC1表達(dá)水平增加。丹參酮IIA預(yù)處理下，LPS刺激的HK-2細(xì)胞，RIP3、p18-FUNDC1表達(dá)水平下調(diào)（圖4A～C，P＜0.05）。

圖4 LPS刺激下不同處理組細(xì)胞RIP3、c-caspase3、p18-FUNDC1表達(dá)水平Fig.4 Expression of RIP3 and cleaved caspase-3 in HK-2 cells in different groups.A:Western blot of p18-FUNDC1,C-caspase-3 and RIP3 in HK-2 cells with different treatments.B:Quantification of p18-FUNDC1,C-caspase3 and RIP3 protein expressions.C:RIP3 mRNAexpression detected using qRT-PCR in HK-2 cells following different treatments.*P＜0.05 vs control,#P＜0.05 vs LPS.

3 討論

AKI是膿毒血癥最常見并發(fā)癥之一，膿毒血癥AKI在危重患者中具有較高的死亡率，其高死亡率與其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確有關(guān)。RTEC損傷是膿毒血癥AKI主要的發(fā)病基礎(chǔ)［14-16］，研究顯示，RTEC凋亡在膿毒血癥AKI的發(fā)病中起重要作用［17-20］。本研究分別用LPS注射小鼠和體外刺激RTEC 構(gòu)建了體內(nèi)及體外膿毒血癥AKI 模型。在這些模型中，丹參酮IIA 能抑制RIP3/FUNDC1信號通路，減少細(xì)胞凋亡，并改善LPS刺激小鼠的腎功能。

RIP3是受體相互作用蛋白家族成員，由N端激酶結(jié)構(gòu)域及C端RIP同型相互作用基序組成，具有磷酸化酶活性，在體內(nèi)廣泛分布，主要表達(dá)于腎臟、心臟、腦、脾臟等部位［21-26］。RIP3是凋亡性壞死通路中的關(guān)鍵因子，此外RIP3還可以通過介導(dǎo)FUNDC1參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生。有研究顯示膿毒血癥AKI患者血、尿中RIP3水平增加，進(jìn)一步動(dòng)物研究也發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)膿毒血癥AKI小鼠，腎組織中RIP3表達(dá)增加，并參與膿毒血癥AKI中RTEC凋亡的發(fā)生，然而機(jī)制尚不明確［27］。為驗(yàn)證RIP3是否通過調(diào)控FUNDC1介導(dǎo)RTEC凋亡的發(fā)生，本研究分別在體內(nèi)、體外模型中檢測RIP3、FUNDC1蛋白的表達(dá)情況。

在RIP3/FUNDC1信號通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中，RIP3 通過磷酸化FUNDC1 上的Tyr18 位點(diǎn)，使其失活，進(jìn)而FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬被抑制，引起Caspase 依賴的細(xì)胞凋亡的發(fā)生［7］。因此在RIP3/FUNDC1 信號通路凋亡通路中，RIP3 將介導(dǎo)p18-FUNDC1表達(dá)上調(diào)。本研究在LPS誘導(dǎo)的小鼠AKI模型及LPS刺激的HK-2細(xì)胞中檢測RIP3及p18-FUNDC1的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的AKI小鼠模型，腎組織中RIP3、p18-FUNDC1蛋白表達(dá)上調(diào)；LPS刺激下HK-2細(xì)胞中RIP3、p18-FUNDC1 表達(dá)同樣增加，提示RIP3、FUNDC1可能參與LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡損傷過程。在體外進(jìn)一步沉默RIP3后，LPS介導(dǎo)的RTEC凋亡顯著減少，p18-FUNDC1蛋白表達(dá)減少，表明RIP3/FUNDC1信號通路可能參與介導(dǎo)RTEC凋亡。

中藥單體丹參酮IIA是中藥丹參的主要成分，其分子結(jié)構(gòu)及相關(guān)藥理學(xué)功效都較為明確，具有抗凋亡、清除氧自由基、抗炎、抗腫瘤等作用。前期研究觀察到，丹參酮IIA具有潛在的腎臟保護(hù)效應(yīng)［28-30］，但目前還沒有關(guān)于丹參酮IIA對保護(hù)膿毒血癥AKI的效應(yīng)及機(jī)制研究。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)丹參酮IIA可減輕LPS誘導(dǎo)的RTEC凋亡損傷。我們首先證實(shí)了丹參酮IIA可下調(diào)LPS誘導(dǎo)的AKI小鼠腎組織中凋亡蛋白Cleaved-caspase3的表達(dá)；還可減少TUNEL染色的陽性細(xì)胞數(shù)及下調(diào)HK-2細(xì)胞中蛋白Cleaved-caspase-3的表達(dá)。進(jìn)一步，我們在體外模型中證實(shí)了丹參酮IIA的這一保護(hù)效應(yīng)。

丹參酮IIA是通過什么機(jī)制減輕RTEC損傷？我們首次發(fā)現(xiàn)丹參酮IIA可下調(diào)RIP3的表達(dá)水平，并通過抑制RIP3/p18-FUNDC1 信號通路改善RTEC 凋亡水平。這為這種單體中醫(yī)成分的腎保護(hù)提供了一種可能的機(jī)制假說。因此，我們提出丹參酮IIA一種新的RTEC保護(hù)途徑。本研究不足之處，所選丹參酮IIA的劑量單一，對AKI的具體保護(hù)機(jī)制尚不清楚，故仍需進(jìn)一步研究。綜上，丹參酮IIA可通過抑制RIP3/p18-FUNDC1信號通路來保護(hù)LPS誘導(dǎo)的RTEC損傷。丹參酮IIA作為中藥丹參的主要活性成分，其現(xiàn)代藥理作用豐富，毒副作用小，在臨床中具有較好的應(yīng)用價(jià)值。