鬼筆復(fù)膜孢酵母菌引起紅托竹蓀腐爛病的防治技術(shù)研究*

鞏玉輝，陳翠翠，郭 明，方 曄**，張 軍**，駱 衡，李 嬌

（1.貴州金蟾大山生物科技有限責(zé)任公司，貴州 畢節(jié) 553300；2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550014）

紅托竹蓀（Dictyophora rubrovolvata M.Zang，et al.）隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）蘑菇綱（A－garicomycetes）鬼筆亞綱（Phallomycetidae）鬼筆目（Phallales）鬼筆科（Phallaceae），主要分布在我國西南地區(qū)[1-3]。其子實(shí)體潔白、細(xì)嫩爽口，含有大量的氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，具有抗腫瘤、治療慢性氣管炎、降血壓、降膽固醇等多種藥用功能，素有“真菌之花”和“山珍”的美稱[3-7]。紅托竹蓀作為貴州省的特色珍稀食用菌，理應(yīng)迅速發(fā)展成為貴州地區(qū)最具市場潛力和競爭力的品種。但由于紅托竹蓀栽培周期長，栽培過程中常發(fā)生病蟲害而嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)，其中腐爛病是最嚴(yán)重的病害之一，因此栽培成功的關(guān)鍵就是腐爛病的防治[1，8-9]。

腐爛病病害常發(fā)生在紅托竹蓀菌蛋形成時(shí)期，一旦感染，整個(gè)栽培大棚均出現(xiàn)菌蛋爛皮至腐爛的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響產(chǎn)量[10]。貴州大學(xué)田風(fēng)華團(tuán)隊(duì)[11]通過研究發(fā)現(xiàn)，紅托竹蓀腐爛病是一種真菌性病害，主要由鬼筆復(fù)膜孢酵母菌（Saccharomycopsis phalli FH Tian，XX Yuan & KQ Peng）引起。初期癥狀為子實(shí)體表面分泌淡紅色小液滴，多發(fā)生在菌蛋交界處和近土側(cè)。隨后液滴逐漸變大，顏色加深，菌蛋滲出液滴處開始變紅，整體呈黃水狀，并由發(fā)病中心向外蔓延致使菌蛋全部潰爛。隨著病害的發(fā)生，液滴表面聚集大量的跳蟲，跳蟲通過吸食菌蛋分泌物將病原菌攜帶至鄰近的菌蛋上，從而擴(kuò)大感染范圍，并迅速傳播至整個(gè)菇床乃至菇棚。在此過程中常伴隨各種細(xì)菌、真菌、黏菌、線蟲、昆蟲、螨蟲等的滋生，引起二次腐生性病害的發(fā)生。發(fā)病部位表面呈現(xiàn)綠霉病癥狀，迅速蔓延至整個(gè)菇棚，導(dǎo)致菌蛋不能正常生長撒裙。該病害普遍發(fā)生于貴州省紅托竹蓀主產(chǎn)區(qū)，其中，連作大棚或者連作林區(qū)受害最嚴(yán)重，一般可使竹蓀減產(chǎn)50%左右，嚴(yán)重的可減產(chǎn)80%以上甚至絕收[10]。該病的發(fā)生具有蔓延快、致病性強(qiáng)、防控困難等特點(diǎn)，是限制紅托竹蓀產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素，一旦發(fā)生將造成極大的經(jīng)濟(jì)損失[12]。

鬼筆復(fù)膜孢酵母菌引起菌棒和子實(shí)體腐爛的情況詳見圖1。

圖1 鬼筆復(fù)膜孢酵母菌引起菌棒和子實(shí)體腐爛Fig.1 Rot of artificial bed-logs and fruit bodies caused by the Saccharomycopsis phalli

由圖1可看出，菌棒腐爛常發(fā)生在原基形成前，通常是菌棒覆土待菌絲長至土層表面時(shí)出現(xiàn)大面積菌棒腐爛，隨后滋生大量跳蟲、菇蚊、菇蠅，加快病害傳播；后期病害表現(xiàn)為菌蕾腐爛和蟲害大量爆發(fā)。在栽培過程中發(fā)現(xiàn)，爛棒和菌蕾腐爛常出現(xiàn)在同一批菌棒的不同階段。因爛棒后會(huì)吸引害蟲，造成蟲害滋生，因此防治更加困難。而子實(shí)體腐爛則發(fā)生在原基形成后子實(shí)體生長的過程中，此時(shí)使用化學(xué)藥物防治容易造成農(nóng)殘超標(biāo)。因此，尋求一種安全又高效的病害防治措施迫在眉睫。

通過鬼筆復(fù)膜孢酵母菌對(duì)菌棒和菌絲體的侵染試驗(yàn)，藥物、高溫對(duì)致病菌的抑制試驗(yàn)、不同pH條件下致病菌的生長試驗(yàn)，研究鬼復(fù)膜孢酵母菌在不同溫度下的致病力、適宜其生長的pH范圍、高溫耐受范圍以及最佳抑菌藥物，從而為腐爛病防治提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌

菌株：野生型強(qiáng)致病力的菌株（保藏號(hào)GUCC 2006），由貴州大學(xué)提供，保存于中國貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理學(xué)菌種保藏中心，其菌落特征如圖2所示。

圖2 鬼筆復(fù)膜孢酵母病原菌Fig.2 Saccharomycopsis phalli pathogen

如圖2所示，病原菌菌落淡黃色，顯微鏡下細(xì)胞呈卵圓形，頂端分裂出芽孢。

病原菌固體培養(yǎng)基配方：葡萄糖20 g、酵母膏5 g、蛋白胨10 g、瓊脂18 g，水1 000 mL。

病原菌液體培養(yǎng)基配方：葡萄糖20 g、酵母膏5 g、蛋白胨10 g，水1 000 mL。

1.2 供試藥劑

試驗(yàn)共選取12種殺菌藥，研究藥物對(duì)致病菌的抑制作用，各殺菌藥的有效成分及使用時(shí)的稀釋倍數(shù)詳見表1。

表1 不同殺菌藥及生產(chǎn)廠家Tab.1 Different fungicides and manufacturers

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 病原菌培養(yǎng)

將病原菌從冰箱取出后恢復(fù)至適溫，并用接種環(huán)劃線法接種到固體培養(yǎng)基上，于溫度為28℃下黑暗培養(yǎng)72 h。待菌落萌發(fā)后將其接種到液體培養(yǎng)基中，于溫度為28℃、轉(zhuǎn)速為150 r·min-1的條件下培養(yǎng)72 h，制作成液體病原菌。

1.3.2 病原菌侵染菌絲體試驗(yàn)

將1.3.1中培養(yǎng)好的液體病原菌接種到菌絲健壯的紅托竹蓀平皿上，接種點(diǎn)為菌絲尖端生長處。將完成接種的平皿分別置于10℃、15℃、20℃、25℃、28℃條件下培養(yǎng)，每隔24小時(shí)記錄1次菌絲生長情況以及病害程度，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)。

1.3.3 病原菌侵染菌棒試驗(yàn)

用無菌濾紙吸附1.3.1中培養(yǎng)好的病原菌發(fā)酵液，將其貼到菌棒上進(jìn)行菌絲侵染試驗(yàn)，以吸附無菌液體培養(yǎng)基的濾紙為對(duì)照，進(jìn)行相同的處理。在25℃條件下培養(yǎng)，每隔24小時(shí)觀察1次并記錄菌棒受侵害程度，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)。

1.3.4 不同藥物的抑菌試驗(yàn)

采用抑菌圈法測定各供試藥劑的抑菌效果[13]。將定量的固體培養(yǎng)基（pH自然）冷卻至48℃左右后倒入培養(yǎng)皿，待凝固后制成平板備用。取100 μL病原菌培養(yǎng)液滴入平板，用玻璃棒在平板培養(yǎng)基上均勻涂布。用滅菌蒸餾水將供試藥劑配制成對(duì)應(yīng)濃度，用經(jīng)過消毒的鑷子夾取濾紙片（直徑為6 mm，已滅菌），分別浸在配制好的藥液中，1 min后取出放在滅菌烘干的濾紙片上停留2 min，然后放在涂有病原菌的培養(yǎng)皿中。每皿4張濾紙片，每種藥物重復(fù)4個(gè)平皿，即重復(fù)16次，以無菌水為對(duì)照。處理完成之后，將培養(yǎng)皿倒置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)。

培養(yǎng)期間定時(shí)觀察致病菌生長情況，72 h時(shí)取出，測量抑菌圈直徑。采用新復(fù)極差法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定各藥劑的差異顯著性。

1.3.5 不同藥劑對(duì)紅托竹蓀菌絲生長的影響試驗(yàn)

1）培養(yǎng)基的制作

基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：土豆100 g（水煮過濾）、葡萄糖5 g、果糖25 g、蛋白胨5 g、硫酸銨2.5 g、雜木屑70 g（粒徑100目）、瓊脂粉18 g，水1 000 mL[13-14]。

含殺菌藥的培養(yǎng)基：在無菌條件下，將一定量的藥液加入至冷卻到48℃左右的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混勻后倒入培養(yǎng)皿中制成平板[13]。

2）菌絲體培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)接種，用打孔器（直徑5 mm）在母種平板接種塊周圍2 cm～3 cm區(qū)域打孔，將菌種塊接種于平板培養(yǎng)基中央[10]。后將培養(yǎng)皿置于23℃條件下恒溫培養(yǎng)，定期觀察菌絲的生長速度、生長狀態(tài)、均勻度等。

3）菌絲生長速度統(tǒng)計(jì)

接種后定期觀察菌絲的生長情況，并采用“十”字交叉法測定菌落直徑，以平均值代表菌落大小。以第7天的菌落直徑為依據(jù)計(jì)算菌絲生長速度，菌絲生長速度（V，mm·d-1）的計(jì)算公式為：

式中：D1為“十”字交叉法測量的第1個(gè)菌落直徑（mm）；D2為“十”字交叉法測量的第2個(gè)菌落直徑（mm）；d2為測量時(shí)的天數(shù)（d）；d1為初始天數(shù)（d）。

1.3.6 高溫對(duì)病原菌的影響試驗(yàn)

將培養(yǎng)好的液體病原菌分別靜置于40℃、45℃、50℃、55℃條件下，每隔1小時(shí)取100 μL樣品涂布于培養(yǎng)皿中，于28℃條件下培養(yǎng)72 h，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量，每個(gè)溫度處理做3次重復(fù)。

1.3.7 不同pH對(duì)病原菌的影響試驗(yàn)

液體培養(yǎng)基滅菌并冷卻后，使用HCl（濃度為0.1 mol·L-1）和NaOH（含量為1%）溶液調(diào)節(jié)pH為2.40、3.39、4.55、5.57、6.72、7.85、8.47、9.60、10.72、11.71共10個(gè)梯度。然后接入病原菌，于28℃、135 r·min-1條件下培養(yǎng)72 h，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)基搖勻，使用移液槍分別取1 mL培養(yǎng)液，并將其稀釋10 000倍，取100 μL培養(yǎng)液涂布于培養(yǎng)皿中，于28℃條件下培養(yǎng)72 h，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差和線性相關(guān)分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 病原菌侵染菌絲結(jié)果統(tǒng)計(jì)

不同溫度下病原菌侵染紅托竹蓀菌絲的結(jié)果詳見圖3。

圖3 不同溫度下病原菌侵染菌絲的時(shí)間Fig.3 Time of pathogen infected hyphae at different temperatures

如圖3所示，隨著溫度的升高病原菌對(duì)竹蓀菌絲的侵染時(shí)間縮短。在10℃條件下，病原菌以及紅托竹蓀菌絲生長都比較慢，腐爛病病原菌活力很弱，對(duì)菌絲生長不造成傷害，無致病性；15℃條件下，培養(yǎng)至第15天紅托竹蓀菌絲開始出現(xiàn)病癥，菌絲發(fā)黃，吐黃水；20℃條件下培養(yǎng)至第12天，25℃條件下培養(yǎng)至第11天，30℃條件下培養(yǎng)至第10天紅托竹蓀菌絲均出現(xiàn)病癥。說明培養(yǎng)溫度與病癥出現(xiàn)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。

不同溫度下病原菌侵染紅托竹蓀后，病斑出現(xiàn)時(shí)間及病斑大小情況詳見圖4和表2。

表2 不同處理組間病原菌的病斑大小Tab.2 Lesion size of pathogenic bacteria in different treatment groups

如表2和圖4所示，隨著溫度的升高，病原菌對(duì)菌絲的傷害程度逐漸加大，具體表現(xiàn)在發(fā)病時(shí)間早，且病斑直徑大?？梢姼邷赜欣诓≡纳L和擴(kuò)散。

圖4 不同處理組病斑大小Fig.4 Lesion size between different treatment groups

2.2 病原菌侵染菌棒結(jié)果統(tǒng)計(jì)

按照1.3.2中的方法用病原菌侵染菌棒，結(jié)果詳見表3。

如表3所示，溫度為10℃時(shí)病原菌不會(huì)侵害菌棒，未造成菌棒腐爛；在15℃條件下，菌棒培養(yǎng)至第21天出現(xiàn)輕微病斑；在20℃條件下，菌棒培養(yǎng)至第17天開始出現(xiàn)輕微病斑，至第24天菌棒完全腐爛；在25℃與30℃培養(yǎng)條件下，菌棒在第11天就出現(xiàn)病斑，至第20天菌棒完全腐爛。說明隨著溫度升高，病原菌對(duì)菌棒的致病作用逐漸增強(qiáng)，能快速侵染菌棒造成菌絲死亡。此時(shí)將菌棒菌絲體回接到無菌營養(yǎng)平皿中無法恢復(fù)生長。試驗(yàn)中菌棒的情況與連作大棚中栽培菌棒腐爛時(shí)間（16 d～20 d）基本一致。

表3 不同處理組菌棒腐爛程度Tab.3 The rot degree of artificial bed-logs between different treatment groups

通過上述試驗(yàn)可知，在溫度超過20℃時(shí)，鬼筆復(fù)膜孢酵母能夠有效侵染紅托竹蓀菌絲體；在溫度為20℃～30℃時(shí)，經(jīng)過16 d～20 d菌棒完全腐爛，嚴(yán)重影響紅托竹蓀的產(chǎn)量。

2.3 藥劑對(duì)病原菌的抑菌作用

按照1.3.4的試驗(yàn)方法測定殺菌藥對(duì)病原菌的抑菌作用，48 h后統(tǒng)計(jì)結(jié)果，詳見圖5和表4。

表4 藥劑對(duì)病原菌的抑菌作用Tab.4 Bacteriostatic effect of medicament on pathogenic bacteria

由圖5、表4可知，丙環(huán)唑?qū)Σ≡哂忻黠@的抑制作用，與其他藥劑相比差異顯著；其次是吡唑醚菌酯、苯甲嘧菌酯、咪鮮胺，抑菌圈直徑分別為13.06 mm、11.38 mm、12.00 mm，但3種藥劑的抑制作用差異不顯著；隨后是唑醚咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、氟菌·肟菌酯；再次是嘧菌酯、肟菌·戊唑醇；其中氟菌·霜霉威、溴菌腈、霜脲嘧菌酯抑菌圈最小，幾乎無抑制作用。

圖5 藥劑對(duì)病原菌的抑菌圈大小Fig.5 Size of bacteriostatic circle of medicament on pathogenic bacteria

2.4 藥劑對(duì)紅托竹蓀菌絲的影響結(jié)果

按照1.3.6的試驗(yàn)方法測定藥劑對(duì)紅托竹蓀菌絲的影響，持效期是在一定時(shí)間后重新接種后進(jìn)行測定，具體結(jié)果詳見表5。

從表5可以看出有8種藥物對(duì)紅托竹蓀菌絲具有比較大的影響，唑醚咪鮮胺、吡唑醚菌酯、肟菌·戊唑醇、丙環(huán)唑持效期大于30 d，即重新接種后培養(yǎng)30 d菌絲依然不萌發(fā)；咪鮮胺、溴菌腈、苯甲嘧菌酯、苯醚甲環(huán)唑剛開始接種不萌發(fā)，重新接種后菌種塊萌發(fā)，持效期在15 d以上；含有氟菌·霜霉威、氟菌·肟菌酯、霜脲嘧菌酯、嘧菌酯的培養(yǎng)基中的菌種塊可以萌發(fā)，但與對(duì)照組相比，生長速度明顯慢且差異顯著，菌絲的生長均勻程度也比對(duì)照組差。

表5 藥劑對(duì)紅托竹蓀生長的影響Tab.5 Effect of medicament on mycelial growth of Dictyophora rubrovolvata

2.5 高溫對(duì)病原菌的影響

高溫對(duì)病原菌菌落數(shù)量的影響情況詳見表6。

通過表6可知，病原菌在40℃條件下培養(yǎng)1 h～13 h依然存活，同時(shí)菌落數(shù)量和菌落大小與處理時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，即處理時(shí)間越長，菌落數(shù)量越少、菌落越小；病原菌在45℃條件下培養(yǎng)4 h生物活性還很強(qiáng)，培養(yǎng)5 h～6 h時(shí)極少存活，8 h之后完全失活；病原菌在50℃條件下培養(yǎng)2 h后生物活性還很強(qiáng)，培養(yǎng)3 h時(shí)極少存活，4 h之后完全失活；病原菌在55℃條件下培養(yǎng)1 h后生物活性還很強(qiáng)，培養(yǎng)2 h時(shí)極少存活，3 h之后則完全失活。

表6 不同處理組病原菌的菌落數(shù)Tab.6 Colonies number of pathogens in different treatment groups

2.6 不同pH對(duì)病原菌生長的影響

每個(gè)pH處理組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)液稀釋10 000倍后，病原菌菌落數(shù)量統(tǒng)計(jì)情況詳見表7和圖6。

表7 不同pH下病原菌菌的落情況Tab.7 Colony condition of pathogen under different pH

圖6 不同pH下病原菌菌落數(shù)量Fig.6 Colonies number of pathogen under different pH

通過表7和圖6可知，pH在4.55～7.85之間時(shí)，病原菌菌落數(shù)量較多，pH在9.6以上時(shí)病原菌不生長，在pH較低的條件下病原菌生長會(huì)減緩，說明過酸或者過堿的環(huán)境都會(huì)抑制病原菌的生長。

3 結(jié)論與討論

腐爛病是紅托竹蓀栽培中常見的一種災(zāi)難性病害，一旦發(fā)生，患病組織將迅速被大量腐生微生物定殖，并通過昆蟲等大量傳播病害。因此腐爛病的防治一直是紅托竹蓀栽培過程中的重點(diǎn)。通過本次試驗(yàn)得出結(jié)論：1）鬼筆復(fù)膜孢酵母菌隨著溫度的升高對(duì)紅托竹蓀的菌絲侵害作用加強(qiáng)，因此高溫是紅托竹蓀栽培過程中腐爛病發(fā)生的誘因。如果菌絲、菌蛋等長時(shí)間處于高溫條件下，將引起菌蛋表層免疫力低下，從而發(fā)生病害。在10℃～15℃條件下鬼筆復(fù)膜孢酵母菌的活力不強(qiáng)，致病力弱；在20℃～30℃條件下，平板中的菌絲10 d～12 d可發(fā)生病害，菌棒菌絲經(jīng)過16 d～20 d會(huì)完全腐爛，從而引發(fā)嚴(yán)重的病害和蟲害，嚴(yán)重影響后期的產(chǎn)量。2）鬼筆復(fù)膜孢酵母菌生長的適宜pH為4～8，該條件下病原菌生物活性強(qiáng)、繁殖快，高pH環(huán)境可使病原菌失活，能有效減少其傳播。因此在紅托竹蓀栽培前期，一定要做好環(huán)境消毒，對(duì)于發(fā)生腐爛病的區(qū)域可通過提高pH來減緩病害的傳播。3）對(duì)于鬼筆復(fù)膜孢酵母菌而言，環(huán)境溫度低于45℃并不能達(dá)到殺菌的效果。因此在紅托竹蓀栽培過程中，可根據(jù)實(shí)際情況采用巴氏殺菌、高溫蒸汽殺菌的方式，使環(huán)境溫度達(dá)到55℃并保持2 h以上，均可完成對(duì)病原微生物的消殺。4）通過藥劑的篩選可以看出，丙環(huán)唑?qū)砉P復(fù)膜孢酵母菌具有很好的抑制作用，但其對(duì)菌絲的傷害程度也較大，因此不能在紅托竹蓀菌絲體階段直接使用。栽培者可以在不同階段對(duì)土壤、環(huán)境、覆蓋物等用該藥物進(jìn)行消毒。

對(duì)于紅托竹蓀腐爛病，要以物理防治為主，化學(xué)防治為輔。主要措施包括：1）保持栽培設(shè)施、場地等的衛(wèi)生，避免連作。對(duì)栽培原料、土壤要合理消毒。在栽培中可以采用燜棚、高溫蒸汽等措施對(duì)栽培場所進(jìn)行消毒，預(yù)防病原菌的產(chǎn)生。2）栽培季節(jié)的合理規(guī)劃、栽培溫度的控制，無論是常規(guī)大棚栽培還是工廠化栽培都至關(guān)重要。在菌絲生長至土層期間，環(huán)境溫度不可過高，這樣既可以避開病原菌的最適生長溫度，同時(shí)偏低的溫度使紅托竹蓀菌絲生長健壯，有利于其子實(shí)體的形成。3）高pH對(duì)病原菌具有致死作用，對(duì)于產(chǎn)生病害的區(qū)域可以覆蓋石灰等強(qiáng)堿物質(zhì)阻斷病原菌的傳播，以減少病害的發(fā)生。4）該病原菌在10℃～15℃條件下生長緩慢，因此栽培時(shí)一旦發(fā)現(xiàn)病害，要進(jìn)行通風(fēng)、降溫，減少空氣濕度，以便抑制病原菌的生長和傳播。5）丙環(huán)唑?qū)τ谠摬≡纳L具有強(qiáng)抑制作用，但是濃度高時(shí)會(huì)抑制菌絲生長，因此在不同栽培階段可以配合著物理措施，用降低濃度的丙環(huán)唑溶液對(duì)栽培環(huán)境進(jìn)行消殺，這對(duì)病害的傳播也具有抑制作用。