顆粒酶B通過(guò)SRGN/NF-kappaB信號(hào)通路調(diào)節(jié)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的增殖和炎癥反應(yīng)

詹宇威，林書(shū)典，詹 鋒，黃艷艷，楊 舟

0 引 言

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見(jiàn)的慢性全身炎癥性疾病，其特點(diǎn)是關(guān)節(jié)疼痛和腫脹，是致殘的主要原因，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康和生活質(zhì)量[1-2]。該疾病的發(fā)病出現(xiàn)在任何年齡，但40～60歲是風(fēng)險(xiǎn)最大的年齡組[3]。目前，對(duì)RA的治療主要是為了緩解疼痛以及炎癥反應(yīng)，以提高RA患者的生活質(zhì)量[4]。研究顯示，靶向免疫療法和積極的治療策略極大地改善了臨床結(jié)果[5]，但目前仍無(wú)治愈方法。因此，闡明其潛在的分子機(jī)制對(duì)于開(kāi)發(fā)新的RA治療策略至關(guān)重要。

顆粒酶B(Granzyme B，GZMB)是一種絲氨酸蛋白酶, 在NK細(xì)胞或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表達(dá)[6]。目前，GZMB已被證明參與多種病理過(guò)程，包括抗腫瘤免疫以及病毒感染等[7-8]。例如，先前的研究表明，GZMB能夠通過(guò)直接水解致病所必需的病毒蛋白而抑制病毒復(fù)制，從而促進(jìn)抗病毒免疫[9]。更重要的是，多項(xiàng)研究報(bào)道GZMB在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中高表達(dá)，并且其表達(dá)水平和RA的發(fā)生進(jìn)展相關(guān)[10-11]。但其在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮作用的機(jī)制尚不完全清楚。

絲甘蛋白聚糖(serglycin，SRGN)作為一種造血細(xì)胞顆粒蛋白聚糖，是細(xì)胞內(nèi)唯一具有與多種生物分子相互作用能力的蛋白多糖，主要表達(dá)于血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞[12-13]。SRGN參與多種造血或非造血細(xì)胞中炎癥介質(zhì)的儲(chǔ)存和分泌[14-15]，因此，SRGN過(guò)量產(chǎn)生與炎癥機(jī)制的擴(kuò)大和進(jìn)展有關(guān)，例如，在人類造血和非造血腫瘤中，SRGN增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，其增加與預(yù)后不良相關(guān)[16]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中SRGN通過(guò)CD44/NF-kappaB/CLDN1軸促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[17]；SRGN直接參與調(diào)節(jié)非感染性軟骨細(xì)胞損害的機(jī)制，SRGN敲低細(xì)胞中，特異性炎癥標(biāo)志物和NF-kappaB激活顯著降低[18]，而NF-kappaB作為炎癥相關(guān)的重要通路能夠促進(jìn)GZMB表達(dá)[19]。因此，我們推測(cè)GZMB可能通過(guò)SRGN/NF-kappaB信號(hào)通路類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮作用。綜上所述，本研究旨在探究GZMB對(duì)RA-FLSs的增殖和炎癥反應(yīng)的影響以及其潛在的分子機(jī)制，為炎癥性關(guān)節(jié)炎的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑白細(xì)胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒(批號(hào)：PI330)，IL-1β ELISA試劑盒(批號(hào)：PI305)以及IL-8 ELISA試劑盒(批號(hào)：PI640)，均購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購(gòu)自Thermo Fisher(中國(guó))。TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒(中國(guó)Thermo Fisher公司)，cDNA合成試劑盒(日本TaKaRa公司)，LipofectamineTM 2000 (美國(guó)Invitrogen公司)。RIPA裂解緩沖液(中國(guó)Beyotime公司)，EdU檢測(cè)試劑盒(中國(guó)Beyotime公司)。GZMB兔單克隆抗體(abcam，批號(hào)：ab108531)，SRGN兔多克隆抗體(AtaGenix，批號(hào)：ATA37978)，P65兔單克隆抗體(abcam，批號(hào)：ab32536)。p-p65兔單克隆抗體(abcam，批號(hào)：ab183559)，P50兔多克隆抗體(abcam，批號(hào)：ab209795), GAPDH兔多克隆抗體(abcam，批號(hào)：ab9485)以及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔lgG二抗(abcam，批號(hào)：ab6721)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)正常人的滑膜細(xì)胞(NC-FLSs)以及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(RA-FLSs)，均購(gòu)自Jennio生物技術(shù)公司(中國(guó)廣州)。上述細(xì)胞置于含有20%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)以及1%的青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染為了使GAMB和SRGN過(guò)表達(dá)以及敲低GAMB的表達(dá)，GAMB過(guò)表達(dá)(Oe-TSHR)以及SRGN過(guò)表達(dá)(Oe-SRGN)和過(guò)表達(dá)陰性對(duì)照(Oe-NC)由上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司合成，si-GAMB干擾序列及其陰性對(duì)照(si-NC)購(gòu)自廣州銳博生物，并按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)分別轉(zhuǎn)染至對(duì)應(yīng)細(xì)胞分組中。qRT-PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.4CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力將處理后的各組細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞密度為5×103/孔。培養(yǎng)24 h、48 h以及72 h后，向每孔細(xì)胞中加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育4 h后，使用VarioskanTMLUX多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的細(xì)胞光密度值(A值)評(píng)估細(xì)胞活力。該實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖使用BeyoClickTMEdU-488細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒 (C0071S, 碧云天生物科技有限公司)，通過(guò)5-乙基-2'-脫氧尿苷(EdU)摻入檢測(cè)RA-FLSs細(xì)胞的增殖。在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍攝圖像，并獨(dú)立重復(fù)進(jìn)行3次。

1.6免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(COIP)使用RIPA裂解緩沖液分離細(xì)胞總蛋白，并使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。400 μg蛋白與2 μg SRGN抗體在4 ℃孵育過(guò)夜。隨后，加入30 μL Protein G/A瓊脂糖珠孵育細(xì)胞4 ℃下孵育1h。PBS洗滌3次后，將沉淀蛋白在5 × SDS-PAGE上樣緩沖液中重懸。最后，使用免疫印跡法(Western blot)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7逆轉(zhuǎn)錄定量PCR(RT-qPCR)使用Trizol(Invitrogen)按照制造商的方案從細(xì)胞中提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒(Invitrogen)合成cDNA。按照制造商的方案使用miScript SYBR Green PCR Kit(Qiagen，Germany)進(jìn)行RT-qPCR。以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行歸一化處理，結(jié)果用2-ΔΔCt值來(lái)比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的目的基因相對(duì)表達(dá)量的差異。獨(dú)立重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)所用引物見(jiàn)表1。

表 1 PCR引物序列信息

1.8蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)收集各個(gè)處理組細(xì)胞用預(yù)冷的RIPA細(xì)胞裂解緩冰上裂解10 min后，將等量蛋白于100V進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后，以60 V、120 min將蛋白遷移至PVDF膜，一抗4 ℃過(guò)夜孵育，TBST緩沖液洗膜3次，每次15 min后，加辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗山羊抗兔IgG，室溫下孵育120 min，之后用ECL試劑盒(Solarbio，Beijing，China)進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，拍照觀察蛋白印記。以GAPDH為內(nèi)參照，用ImageJ軟件分析條帶的灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

1.9酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)IL-1β、IL-6以及IL-8水平將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RA-FLSs細(xì)胞接種于24孔板中，收集各組細(xì)胞上清培養(yǎng)液，隨后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)促炎因子IL-1β、IL-6以及IL-8的水平，多功能酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，并使用Tukey檢驗(yàn)方法。以P≤0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GZMB在RA-FLSs 細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)首先，通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，獲取RA患者滑膜組織芯片數(shù)據(jù)(GSE153015)，以O(shè)A synovium large joint為對(duì)照，RA患者synovium large joint為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行GEO2R差異分析，獲得差異表達(dá)基因；隨后對(duì)差異表達(dá)基因?qū)脒M(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析篩選出HUB基因(CXXL10、GZMB、CCL5、CD27、CCR2、CD38、CD274、IRF4、CXCL9和CXCL11)；此外，采用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)RA-FLSs 細(xì)胞中GZMB的表達(dá)(圖1c-d)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常人的滑膜細(xì)胞(NC-FLSs)相比，GZMB在RA-FLSs 細(xì)胞中高表達(dá)(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

a：GEO2R分析獲得差異表達(dá)基因；b：PPI網(wǎng)絡(luò)分析篩選HUB基因；c：蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)GZMB蛋白表達(dá)；d：逆轉(zhuǎn)錄定量PCR檢測(cè)GZMB mRNA表達(dá)

2.2GZMB調(diào)節(jié)RA-FLSs的增殖和炎癥反應(yīng)構(gòu)建GZMB過(guò)表達(dá)和干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RA-FLSs細(xì)胞，采用Western blot和RT-qPCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)或干擾效率，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，GZMB在過(guò)表達(dá)后蛋白和mRNA水平顯著上調(diào)，反之，在干擾后，GZMB的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。CCK-8以及EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)GZMB顯著地促進(jìn)了細(xì)胞增殖，而干擾GZMB的表達(dá)后，細(xì)胞增殖受到抑制(P<0.01)。隨后，采用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)炎癥相關(guān)因子的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)GZMB顯著地上調(diào)了IL-1β、IL-6以及IL-8的水平(P<0.01)，同樣地，GZMB的敲除降低了上述炎癥因子的表達(dá)(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3GZMB與SRGN相結(jié)合通過(guò)GeneMANIA網(wǎng)站的分析獲得與GZMB相關(guān)基因。將其相關(guān)基因與deRNA取交集得到6個(gè)交集基因(GZMA、SRGN、HOPX、GZMH、BIRC3、GNLY。我們選擇SRGN進(jìn)行下一步研究。string數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果顯示GZMB和SRGN可能相結(jié)合。采用和Western blot和RT-qPCR檢測(cè)RA-FLSs 細(xì)胞中SRGN的表達(dá)，結(jié)果顯示與NC-FLSs組相比，在RA-FLSs 細(xì)胞中高表達(dá)(P<0.01)。Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證GZMB和SRGN之間的關(guān)系，結(jié)果如圖3f所示，與對(duì)照組相比，GZMB過(guò)表達(dá)增加了細(xì)胞中SRGN的表達(dá)，而在GZMB敲除的細(xì)胞中，SRGN的表達(dá)被明顯抑制(P<0.01)。免疫共沉淀的結(jié)果顯示，在利用IgG進(jìn)行沉淀實(shí)驗(yàn)時(shí)，SRGN與GZMB蛋白并未出現(xiàn)明顯沉淀，表明蛋白SRGN或GZMB不能與IgG結(jié)合，但使用GZMB或SRGN誘導(dǎo)沉淀時(shí)，對(duì)應(yīng)蛋白均出現(xiàn)了明顯的沉淀印跡，由此表明GZMB能夠與SRGN相結(jié)合。見(jiàn)圖3。

a：蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)GZMB蛋白表達(dá)水平；b：逆轉(zhuǎn)錄定量PCR檢測(cè)GZMB的mRNA表達(dá)；c：CCK-8用于檢測(cè)細(xì)胞活力；d：EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖；e：IL-1β表達(dá)水平；f：IL-6表達(dá)水平；g：IL-8表達(dá)水平

2.4GZMB調(diào)控SRGN參與NF-kappaB信號(hào)通路Western Blot檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4，與si-NC + oe-NC組相比，干擾GZMB顯著降低了GZMB、SRGN、P65、p-p65和p50蛋白的表達(dá)水平(P<0.01)，然而，進(jìn)一步過(guò)表達(dá)SRGN也逆轉(zhuǎn)了GZMB敲除對(duì)NF-kappaB信號(hào)通路相關(guān)蛋白(GZMB、SRGN、p65、p-p65和p50)的抑制作用(P<0.01)。見(jiàn)圖4。上述結(jié)果表明GZMB與SRGN互相作用并通過(guò)NF-kappaB信號(hào)通路調(diào)節(jié)RA-FLSs的增殖和炎癥反應(yīng)。

a：GeneMANIA網(wǎng)站中GZMB相關(guān)基因的分析；b：GZMB相關(guān)基因與deRNA的交集；c：String數(shù)據(jù)庫(kù)檢索GZMB和SRGN相關(guān)性；d：蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)SRGN蛋白表達(dá)水平；e：逆轉(zhuǎn)錄定量PCR檢測(cè)SRGND mRNA表達(dá)水平；f：過(guò)表達(dá)或干擾GZMB時(shí)，SRGN蛋白表達(dá)水平；g：免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GZMB和SRGN之間的相關(guān)性

a：蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)NF-kappaB信號(hào)代表?xiàng)l帶；b：GZMB表達(dá)水平；c：SRGN表達(dá)水平；d：p65表達(dá)水平；e：p-p65表達(dá)水平；f：p50表達(dá)水平

2.5SRGN過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)GZMB敲除對(duì)RA-FLSs增殖和炎癥反應(yīng)的促進(jìn)作用構(gòu)建SRGN過(guò)表達(dá)載體，Western blot和RT-qPCR分別檢測(cè)SRGN的過(guò)表達(dá)效率，與Oe-NC組相比，SRGN在Oe-SRGN組顯著上調(diào)(P<0.001)。CCK-8以及EdU實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，與si-NC +oe-NC組相比，干擾GZMB有效地抑制了細(xì)胞增殖(P<0.01)，而過(guò)表達(dá)SRGN后逆轉(zhuǎn)了GZMB敲除對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用(P<0.01)。同樣地，ELISA的結(jié)果也顯示SRGN過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了GZMB敲除對(duì)IL-1β、IL-6以及IL-8的表達(dá)的抑制作用(P<0.01)。見(jiàn)圖5。

a：蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)SRGN蛋白表達(dá)水平；b：逆轉(zhuǎn)錄定量PCR檢測(cè)SRGN mRNA表達(dá)；c：CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力；d：通過(guò)EdU測(cè)定檢查細(xì)胞增殖；e：IL-1β表達(dá)水平；f：IL-6表達(dá)水平；g：IL-8表達(dá)水平

3 討 論

目前RA仍是一種病因未明的慢性系統(tǒng)性疾病，主要伴有關(guān)節(jié)軟骨及周圍組織的破壞，以滑膜增生以及炎性滑膜炎為特征[20-21]。在本研究中，我們利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲取RA患者滑膜組織芯片數(shù)據(jù)并進(jìn)行GEO2R差異分析，將獲得的差異表達(dá)基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)GZMB與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病顯著相關(guān)。隨后，我們檢測(cè)GZMB在RA-FLSs細(xì)胞中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)GZMB在RA-FLSs 細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。通過(guò)構(gòu)建GZMB過(guò)表達(dá)和干擾質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)GZMB顯著地促進(jìn)了RA-FLSs細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)，而GZMB基因沉默有效地降低了RA-FLSs細(xì)胞中炎癥因子IL-6、IL-1β和IL-8水平，抑制RA-FLSs細(xì)胞異常增殖，我們的結(jié)果提示GZMB基因沉默可能在RA滑膜增生和關(guān)節(jié)軟骨損傷中發(fā)揮重要作用，這與Bao等[6]研究GZMB基因沉默對(duì)RA的影響的結(jié)果一致。

為進(jìn)一步探索GZMB在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮作用的機(jī)制，通過(guò)GeneMANIA在線分析(http://genemania.org/)，發(fā)現(xiàn)SRGN是GZMB相關(guān)基因，String數(shù)據(jù)庫(kù)的進(jìn)一步驗(yàn)證顯示GZMB和SRGN之間存在相互作用，隨后的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。SRGN是一種低分子量糖蛋白，主要在造血細(xì)胞中表達(dá)，分泌并整合到細(xì)胞外基質(zhì)中[22]。SRGN在許多細(xì)胞因子、趨化因子和蛋白酶的儲(chǔ)存和分泌中發(fā)揮重要作用，因此參與許多生理和病理過(guò)程[23]。研究證實(shí)，SRGN在結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、多發(fā)性骨髓瘤、鼻咽癌和乳腺癌中促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[17,24-25]。SRGN還通過(guò)調(diào)節(jié)TNF-α等多種炎癥介質(zhì)并激活NF-kappaB信號(hào)通路參與炎癥過(guò)程[18]。眾所周知，NF-kappaB是一個(gè)典型的炎癥信號(hào)通路，主要基于促炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素和腫瘤壞死因子對(duì)NF-kappaB的激活[26]，重要的是，NF-kappaB同時(shí)也是促進(jìn)GZMB的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子[19]。在本研究中，我們的結(jié)果顯示，SRGN在RA-FLSs 細(xì)胞中高表達(dá)，進(jìn)一步過(guò)表達(dá)SRGN逆轉(zhuǎn)了GZMB干擾對(duì)RA-FLSs細(xì)胞增殖，炎癥反應(yīng)以及NF-kappaB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的抑制作用，表明GZMB通過(guò)SRGN/NF-kappaB信號(hào)通路調(diào)節(jié)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的增殖和炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究首次揭示了GZMB與SRGN在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的相互作用關(guān)系，闡明了GZMB通過(guò)SRGN/NF-kappaB信號(hào)通路調(diào)節(jié)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的增殖和炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制，該研究為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床治療藥物提供了新的治療靶點(diǎn)和策略。