PKM2促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制研究*

孫麗麗，車曉霞，馮煒煒

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200025)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer，EC)是女性生殖系統(tǒng)常見的三大惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%，占女性惡性腫瘤的7%。最新流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，全球范圍內(nèi)每年有320000例新發(fā)病例及76000例死亡病例[1]。盡管近20年大多數(shù)癌癥患者的預(yù)后有所改善，但子宮體腫瘤的死亡率增加了20%以上[2]。因此，迫切需要開發(fā)有效策略來診斷和治療EC。

在腫瘤組織中，即使氧氣充足，惡性腫瘤細(xì)胞仍可進(jìn)行活躍的葡萄糖糖酵解，這種特殊的代謝特征被稱為Warburg效應(yīng)[3]。丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)作為糖酵解的關(guān)鍵酶之一，作用于其底物磷酸烯醇式丙酮酸形成丙酮酸[4]，包括四種不同的亞型：L，R，M1，M2[5]。其中PKM2廣泛分布于腦組織和肝組織[6]，且在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，表明PKM2有希望作為癌癥治療的靶點(diǎn)[7]。PKM2的低聚物存在高活性的四聚體和低活性的二聚體兩種形式，PKM2蛋白在健康組織中可以從高活性的四聚體切換至低活性的二聚體[8]。然而在腫瘤細(xì)胞中，PKM2通常以低活性的二聚體存在，調(diào)節(jié)糖酵解的限速步驟，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞通過磷酸戊糖途徑產(chǎn)生過多乳酸等分子，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)[9-10]。PKM2作為糖酵解途徑的關(guān)鍵酶之一，已在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)高表達(dá)，如直腸癌、乳腺癌、肺癌、肝癌和胃癌等[11]。PKM2在內(nèi)膜癌中的研究甚少，機(jī)制尚不明確。本文將通過TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)及瑞金樣本RNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)分析PKM2在內(nèi)膜癌及正常內(nèi)膜中的表達(dá)差異，在內(nèi)膜癌細(xì)胞株中通過慢病毒轉(zhuǎn)染干擾PKM2后，檢測(cè)內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖能力的變化及相關(guān)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床樣本 用于熒光定量PCR的15例正常內(nèi)膜組織(行宮腔鏡檢查的患者，術(shù)后病理提示：增殖期子宮內(nèi)膜)和40例內(nèi)膜癌組織及用于免疫組化的90例子宮內(nèi)膜樣腺癌的癌旁和癌組織芯片均來自于2013～2017年就診于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院的患者。用于RNA表達(dá)譜測(cè)定的5例正常內(nèi)膜組織來自于瑞金醫(yī)院婦產(chǎn)科行宮腔鏡檢查的患者，術(shù)后病理提示：增殖期子宮內(nèi)膜，21例內(nèi)膜癌組織(3例透明細(xì)胞癌，5例漿液性癌，13例子宮內(nèi)膜樣腺癌)來自于復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院。

1.2 內(nèi)膜癌細(xì)胞株和培養(yǎng)試劑 AN3-CA、ECC-1、Ishikawa、RL95-2、KLE、HEC-1A和HEC-1B 7株細(xì)胞株均購(gòu)于上海中科院。所有細(xì)胞均包含細(xì)胞鑒定報(bào)告，每6個(gè)月進(jìn)行支原體檢測(cè)，均提示陰性。所有細(xì)胞株均用添加100μg/mL青鏈霉素、含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2孵箱進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PKM2敲低穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建 RL95-2細(xì)胞PKM2敲低穩(wěn)轉(zhuǎn)株(RL95-2-NC，RL95-2-shPKM2-1，RL95-2-shPKM2-2)是通過亞克隆到 RNAi pLenti hU6-MCS-CMV-zsGreen1-PGK-Puro 載體中，基于慢病毒的穩(wěn)定 shRNA 建立的(中國(guó)上海領(lǐng)恪有限公司)。NC靶序列: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3' ; sh-PKM2-1靶序列： 5'-GGAAAGAACAUCAAGAUUAUC-3'; shPKM2-2靶序列：5'-UUGGUGAGGACGAUUAUGGTT-3'。

1.3.2 平板克隆實(shí)驗(yàn) 將RL95-2-NC、RL95-2-shPKM2-1、RL95-2-shPKM2-2按600細(xì)胞/孔接種于6孔板中培養(yǎng)12～14天。4%多聚甲醛固定30min，20%結(jié)晶紫染色15min，拍照，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.3 CCK-8實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株RL95-2-NC、RL95-2-shPKM2-1、RL95-2-shPKM2-2按5000細(xì)胞/孔分別接種于96孔板中培養(yǎng)6天。在特定的培養(yǎng)時(shí)間下，每孔加10μL CCK-8試劑孵育1h，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm的OD值。

1.3.4 實(shí)時(shí)定量PCR方法 TRIzol法提取7株細(xì)胞株、15例正常內(nèi)膜組織及40例內(nèi)膜癌組織的總RNA。應(yīng)用PrimeScriptTM試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒(Takara Bio Inc.,Shiga,Japan)將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物均購(gòu)自上海BioTNT公司。反應(yīng)條件：95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。引物序列：GAPDH上游為5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'；下游為5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'。PKM2上游為5'-ATTATTTGAGGAACTCCGCCGCCT-3'；下游為5'-GTTGAAGGTAGTTTCGTGGA-3'。

1.3.5 組織芯片染色法 90對(duì)福爾馬林固定石蠟包埋的內(nèi)膜癌和癌旁組織微陣列芯片均出自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院。將患者組織的載玻片與抗PKM2兔單克隆抗體(1∶100，ab210114)和Ki67(1∶100，GB13030-2，Goodbiotechnology，中國(guó)武漢)抗體進(jìn)行孵育。通過陽性染色細(xì)胞的百分比評(píng)估PKM2表達(dá)水平，并根據(jù)染色強(qiáng)度和免疫反應(yīng)細(xì)胞的百分比確定IHC指數(shù)。染色強(qiáng)度分為0分(陰性)、1分(弱陽性)、2分(中度陽性)或3分(強(qiáng)陽性)，染色百分比分為0分(0%)、1分(1%～25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)或4分(76%～100%)。IHS(免疫組化評(píng)分)計(jì)算方法是將數(shù)量和強(qiáng)度評(píng)分相乘，范圍從0到12分。如前所述，0～6分的IHS評(píng)分為低表達(dá)，7～12分的IHC評(píng)分為高表達(dá)。

1.3.6 免疫印跡法 7株細(xì)胞株沉淀應(yīng)用RIPA(50mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，1% NP-40，0.5% sodium deoxycholate和0.1% SDS)在冰上裂解30min。4℃，12000g離心20min。吸取蛋白上清至新的EP管，加5*loading buffer，100℃金屬浴蛋白變性10min。隨后進(jìn)行凝膠電泳，一抗4℃孵育過夜，PKM2，1∶1000(ab85555)；HIF-1α，1∶1000(ab216842)；GAPDH，1∶1000(ab8245)；二抗冰上孵育2h，顯像拍照。

1.3.7 RNA表達(dá)譜測(cè)定 RNA表達(dá)譜測(cè)定應(yīng)用NEBNext Ultra TM RNA Library Prep Kit for Illumina(NEB公司，美國(guó))生成的測(cè)序文庫(kù)。應(yīng)用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS系統(tǒng)進(jìn)行樣品聚類，并在Illumina NovaSeq平臺(tái)上對(duì)文庫(kù)制備物進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié) 果

2.1 PKM2在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)膜癌組織中表達(dá)顯著上調(diào) 下載并整合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cancergenome.nih.gov/)中內(nèi)膜癌RNA表達(dá)譜結(jié)果，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于24例內(nèi)膜癌癌旁組織，PKM2在177例內(nèi)膜癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001)，見圖1A；PKM2高表達(dá)與組織學(xué)級(jí)別呈正相關(guān)(P<0.05)，見圖1B；通過臨床數(shù)據(jù)分析，PKM2高表達(dá)的內(nèi)膜癌患者提示不良預(yù)后(P<0.05)，見圖1C。通過對(duì)瑞金樣本庫(kù)中5例正常內(nèi)膜組織及21例內(nèi)膜癌組織進(jìn)行RNA表達(dá)譜測(cè)定。結(jié)果顯示，相對(duì)于正常內(nèi)膜組織，PKM2在內(nèi)膜癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，圖1D。RT-PCR法測(cè)定15例正常內(nèi)膜組織和40例內(nèi)膜癌組織中PKM2 mRNA水平，結(jié)果顯示內(nèi)膜癌組織中PKM2 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001)，見圖1E。

2.2 內(nèi)膜癌組織中PKM2高表達(dá)的臨床病理學(xué)特征 免疫組化法結(jié)果顯示，相對(duì)于癌旁組織，PKM2表達(dá)在內(nèi)膜癌組織中明顯上調(diào)，并隨著組織學(xué)級(jí)別的升高而升高(圖2)。內(nèi)膜癌組織及癌旁組織中PKM2高表達(dá)率分別為68.4%和24.6%，提示PKM2在內(nèi)膜癌組織中表達(dá)升高。

2.3 敲低PKM2顯著抑制內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖 7株內(nèi)膜癌細(xì)胞株中，RL95-2細(xì)胞株中PKM2 mRNA及蛋白表達(dá)最高(圖3A、B)，選該細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)功能驗(yàn)證。在RL95-2細(xì)胞株中，通過慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建PKM2敲低穩(wěn)轉(zhuǎn)株，RL95-2-NC，RL95-2-shPKM2-1，RL95-2-shPKM2-2，PCR及免疫印跡驗(yàn)證PKM2干擾效率(圖3C、D)。CCK-8及平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于NC組，干擾PKM2后，細(xì)胞增殖能力及克隆形成能力顯著減弱(圖4A、B，P<0.01)。

圖1 內(nèi)膜癌組織中PKM2表達(dá)上調(diào)

圖2 免疫組化法

圖3 內(nèi)膜癌細(xì)胞株中PKM2表達(dá)及RL95-2細(xì)胞株中敲低PKM2表達(dá)效率驗(yàn)證

圖4 在RL95-2細(xì)胞株中，敲低PKM2表達(dá)后，抑制了細(xì)胞增殖

2.4 PKM2誘導(dǎo)HIF-1α蓄積并激活NF-κB信號(hào)通路 通過GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)數(shù)據(jù)庫(kù)分析網(wǎng)站，Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，HIF-1α與PKM2的mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)(圖5A)。RL95-2細(xì)胞中，干擾PKM2表達(dá)后，HIF-1α、p65及p-IKB-α蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(圖5B)。

圖5 PKM2誘導(dǎo)HIF-1α蓄積并激活NF-κB信號(hào)通路

3 討 論

腫瘤細(xì)胞在改變新陳代謝的情況下有效地將葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)整合到生物質(zhì)中以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的異常增殖。作為糖酵解的最終和限速反應(yīng)酶，與正常組織相比，PKM2在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、血液、宮頸癌、腎癌、膀胱癌、甲狀腺乳頭狀癌和結(jié)腸癌等多種人類腫瘤組織及細(xì)胞中表達(dá)顯著增加[12]，提示PKM2在多種腫瘤中作為治療靶點(diǎn)的可能性。本研究中，通過下載、整合、分析TCGA內(nèi)膜癌公共mRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于癌旁組織，PKM2在內(nèi)膜癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，其高表達(dá)的PKM2與內(nèi)膜癌組織學(xué)分級(jí)及不良預(yù)后相關(guān)。結(jié)合瑞金標(biāo)本庫(kù)RNA表達(dá)譜測(cè)定結(jié)果及RT-PCR驗(yàn)證顯示，相對(duì)于正常內(nèi)膜組織，PKM2 mRNA在內(nèi)膜癌組織中表達(dá)上調(diào)。通過組織芯片免疫組化法結(jié)果顯示，相對(duì)于癌旁組織，PKM2蛋白在內(nèi)膜癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，且隨著組織學(xué)級(jí)別升高，表達(dá)升高。

PKM2除了作為丙酮酸激酶的作用外，還具有蛋白激酶的作用，參與細(xì)胞增殖、遷移和凋亡基因的轉(zhuǎn)錄共激活因子的功能[13]。研究證實(shí)，宮頸癌、肝癌及腎癌細(xì)胞中，PKM2可轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核中，與HIF-1α結(jié)合，激活HIF-1α下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖活性[14-15]。本研究結(jié)果顯示，7株內(nèi)膜癌細(xì)胞株中，RL95-2細(xì)胞中PKM2 mRNA及蛋白表達(dá)最高。在RL95-2細(xì)胞中，干擾PKM2表達(dá)后，顯著抑制了細(xì)胞增殖。文獻(xiàn)報(bào)道，PKM2可參與調(diào)控HIF-1α表達(dá)及STAT3、NF-κB等經(jīng)典信號(hào)通路[16]。Western blot法結(jié)果顯示，在RL95-2細(xì)胞中，干擾PKM2后，HIF-1α、p65及p-IKB-α表達(dá)顯著下調(diào)。

綜上所述，子宮內(nèi)膜癌中，PKM2高表達(dá)可能通過上調(diào)HIF-1α表達(dá)，激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖。PKM2有望作為子宮內(nèi)膜癌診斷及治療的有效靶標(biāo)。