高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖相關(guān)子宮內(nèi)膜病變小鼠模型中circRNA表達(dá)譜分析及相關(guān)ceRNA構(gòu)建*

李艷輝，肖誠(chéng)瑀，趙 蓉，汪宏波

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430022)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer，EC)是全球女性中最常見(jiàn)的惡性生殖系統(tǒng)腫瘤之一，2020年最新的流行病數(shù)據(jù)顯示全球EC發(fā)病人數(shù)超過(guò)41萬(wàn)[1]。EC有兩種發(fā)病類(lèi)型：I型雌激素依賴(lài)型及II型非雌激素依賴(lài)型。肥胖與I型EC高度相關(guān)[2]。近幾十年來(lái)，隨著人類(lèi)飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的改變，全球范圍內(nèi)肥胖發(fā)病率顯著上升，尤其是在年輕女性中。近期研究顯示,1988年至2016年間，45歲以下女性肥胖率增加了16%以上，而同期該年齡段的女性EC發(fā)病率增加了14倍[3]。肥胖也是子宮內(nèi)膜不典型增生或癌變的最強(qiáng)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[4]。多種機(jī)制，包括肥胖導(dǎo)致的女性?xún)?nèi)分泌和代謝紊亂、胰島素抵抗及慢性炎癥反應(yīng)等，均被認(rèn)為與肥胖相關(guān)的I型EC發(fā)病相關(guān)[5]。但肥胖致腫瘤的發(fā)病機(jī)制可能是多方面的，且目前遠(yuǎn)未完全闡明。為了更好地闡明其中的分子機(jī)制和作用途徑，并對(duì)這些關(guān)系做出更有力的結(jié)論，需進(jìn)一步研究飲食攝入和飲食模式在子宮內(nèi)膜病變中的具體分子機(jī)制[6]。

競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)即長(zhǎng)鏈非編碼RNA(longnoncoding RNA，lncRNA)及環(huán)狀RNA(circRNA),與mRNA可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)相同的microRNA反應(yīng)元件(MicroRNA reaction elements，MREs)，從而調(diào)控相應(yīng)靶基因的表達(dá)[7]。研究發(fā)現(xiàn),circRNA的異常表達(dá)及其參與ceRNA網(wǎng)絡(luò)在多種人體疾病，包括腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和自身免疫性疾病等的發(fā)生發(fā)展中扮演關(guān)鍵性調(diào)控作用[7]。但在子宮內(nèi)膜不典型增生或癌變中，circRNA的作用目前仍知之甚少，特別是circRNA參與的ceRNA網(wǎng)絡(luò)是否在肥胖/代謝綜合征誘發(fā)的子宮內(nèi)膜病變中發(fā)揮作用,目前尚不完全清楚。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高脂飲食和(或)17β-雌二醇喂養(yǎng)CD-1(ICR)小鼠構(gòu)建子宮病變模型，采用高通量RNA-seq檢測(cè)lncRNA、circRNA、mRNA轉(zhuǎn)錄組譜改變，并利用生物信息學(xué)方法分析預(yù)測(cè)與子宮內(nèi)膜病變過(guò)程可能相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，為闡明子宮內(nèi)膜不典型增生或癌變的發(fā)生機(jī)制及潛在的治療靶點(diǎn)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 72只清潔級(jí)6周齡CD-1(ICR)雌鼠(北京維通利華公司)，18～25g，飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心無(wú)病原體(SPF)動(dòng)物房，每5只一籠，飼養(yǎng)溫度(25±2)℃，濕度(55±5)%，維持12h的光/暗循環(huán)。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)華中科技大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與利用委員會(huì)批準(zhǔn)許可。

1.1.2 標(biāo)本采集 收集2016年1月至2017年6月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院手術(shù)的子宮內(nèi)膜癌患者的癌組織標(biāo)本10例(年齡范圍42～65歲)。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)手術(shù)病理分期證實(shí)為I～I(xiàn)II期的子宮內(nèi)膜樣腺癌；術(shù)前未接受放化療，未服用激素類(lèi)藥物；臨床病例資料完備。收集同期因子宮肌瘤、卵巢良性囊腫行手術(shù)治療的患者的子宮內(nèi)膜標(biāo)本10例(年齡范圍38～53歲)作為對(duì)照。對(duì)照患者納入標(biāo)準(zhǔn)：月經(jīng)均規(guī)律，術(shù)前6個(gè)月內(nèi)未服用激素治療，且均處于子宮內(nèi)膜增殖期。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批同意【批準(zhǔn)號(hào)：IORG0003571】，患者術(shù)前均簽署知情同意書(shū)。兩組患者的基本臨床資料對(duì)比見(jiàn)表1。

表1 兩組患者的基礎(chǔ)臨床資料對(duì)比

1.1.3 主要試劑 生化級(jí)17β-雌二醇購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；小鼠喂養(yǎng)用高脂飼料(D19452，脂肪、糖水化合物及蛋白供能占比分別為60%、20%、20%)購(gòu)自北京華阜康有限公司；小鼠血清甘油三酯(TG)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；cDNA合成試劑盒及Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司。

1.2 方法

1.2.1 人體組織標(biāo)本的采集 人子宮內(nèi)膜癌組織采集于腹腔鏡手術(shù)切除標(biāo)本，而正常人子宮內(nèi)膜經(jīng)診斷性刮宮獲取。采集的標(biāo)本經(jīng)PBS溶液沖洗去除血液，2h內(nèi)轉(zhuǎn)入液氮罐內(nèi)保存，備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及干預(yù) 小鼠購(gòu)入后經(jīng)正常飲食喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為正常熱量飲食組(對(duì)照組，C組)、17β-雌二醇喂養(yǎng)組[E2組，每只小鼠經(jīng)口給予500μg/(kg·d)的17β-雌二醇。E2用量參照先前的實(shí)驗(yàn)研究[8-9]]、高脂飼料喂養(yǎng)組(HFD組)及高脂飼料+雌激素喂養(yǎng)組(HFD+E2組，17β-雌二醇經(jīng)口給藥量同E2組)，每組各18只。各小鼠干預(yù)后每周稱(chēng)重記錄體重變化。

1.2.3 標(biāo)本收集 于分組干預(yù)后的第13周各組取6只，及干預(yù)后第26周各組取12只，在小鼠子宮內(nèi)膜增殖期(通過(guò)陰道涂片觀察)將小鼠麻醉后取其眼靜脈血2mL。小鼠斷頸處死后，取下腹縱切口于子宮頸與子宮體交界部切下子宮，立即稱(chēng)重。稱(chēng)重后在體視顯微鏡下縱向剖開(kāi)子宮。于冰上切取部分小鼠子宮標(biāo)本用于組織學(xué)檢查，其余子宮標(biāo)本采用手術(shù)刀背刮下子宮內(nèi)膜組織，進(jìn)行RNA抽提。后續(xù)RNA實(shí)驗(yàn)分析的均是單只小鼠子宮內(nèi)膜組織。

1.2.4 子宮內(nèi)膜組織學(xué)檢查 子宮石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色。由兩名病理醫(yī)師各自獨(dú)立閱片，并根據(jù)2014年修訂的WHO子宮內(nèi)膜病變分類(lèi)，將子宮內(nèi)膜病變分為兩類(lèi)：子宮內(nèi)膜增生不伴不典型增生(EH)和子宮內(nèi)膜不典型增生(AH)[10]。

1.2.5 總RNA提取 Trizol法從各組大鼠子宮內(nèi)膜組織、人子宮內(nèi)膜癌組織及人正常對(duì)照子宮內(nèi)膜組織中提取總RNA，實(shí)驗(yàn)均在冰上及無(wú)RNA酶條件下進(jìn)行。Nanodrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度和純度。

1.2.6 高通量RNA測(cè)序 小RNA文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序由上海歐易生物科技有限公司進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按操作指南進(jìn)行，依次進(jìn)行核糖體核糖核酸(rRNA)的去除、RNase R消化、片段化、第一鏈cDNA合成、第二鏈cDNA合成、末端修復(fù)、3'末端加A、連接接頭、富集步驟，完成測(cè)序樣本文庫(kù)構(gòu)建。采用Illumina測(cè)序儀進(jìn)行雙端測(cè)序。測(cè)序過(guò)程在Illumina提供的數(shù)據(jù)收集軟件控制，并進(jìn)行實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)分析。

1.2.7 生物信息學(xué)分析 應(yīng)用R語(yǔ)言平臺(tái)edgeR程序包分析樣本間的差異表達(dá)基因，得到P-value后運(yùn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，通過(guò)控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)來(lái)確定P-value的閾值，校正后的P-value即Q-value；并計(jì)算樣本間差異表達(dá)mRNA、circRNA的差異表達(dá)倍數(shù)(Fold-change)。差異表達(dá)mRNA、circRNA的篩選標(biāo)準(zhǔn)均為干預(yù)組(HFD+E2、HFD及E2組)與對(duì)照組表達(dá)差異倍數(shù)≥2且q-value<0.05。應(yīng)用分層聚類(lèi)以顯示mRNA、circRNA表達(dá)模式的總體差異。對(duì)生物過(guò)程(biological process)，細(xì)胞成分(cellular component)，分子功能(molecular function)三個(gè)層次上以及各個(gè)pathway上對(duì)應(yīng)的差異基因數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P<0.05，F(xiàn)DR<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于circRNA則對(duì)其親本基因進(jìn)行GO分析和KEGG分析。使用miRanda工具預(yù)測(cè)microRNA與差異circRNA的靶向關(guān)系，應(yīng)用TargetScan、RegRNA和miRTarBase等數(shù)據(jù)庫(kù)，酌情計(jì)算miRNA與circRNA或mRNA之間的結(jié)合關(guān)系。TargetScan提供的上下文+得分用于miRNA的排名和交互對(duì)的映射。并使用Cytoscape繪制circRNA與miRNA的互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 確定高通量測(cè)序篩選出的差異表達(dá)mRNA、circRNA在人子宮內(nèi)膜癌組織及正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平。采用Trizol法從組織中提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA模板按實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃ 10min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，55℃ 60s，72℃ 30s，共35個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔。以磷酸甘油脫氫酶(GAPDH)基因作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt的方法對(duì)目標(biāo)mRNA、circRNA的表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量。各目的基因及內(nèi)參基因的引物序列見(jiàn)表2。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)的相關(guān)基因的引物序列

2 結(jié) 果

2.1 不同飲食干預(yù)過(guò)程中各組小鼠中體重、血清甘油三酯及子宮大小變化趨勢(shì) 飲食干預(yù)后,相較對(duì)照組和17β-雌二醇組(E2組)，HFD組和HFD+E2組小鼠的平均體重顯著增加(P<0.05)，但HFD與HFD+E2組小鼠無(wú)顯著差異(圖1A)。飲食干預(yù)后第13、26周，HFD組及HFD+E2組小鼠的血清TG水平均顯著高于對(duì)照組及E2組(P<0.05)，但HFD組與HFD+E2組無(wú)顯著差異(圖1B)。

飲食干預(yù)后第13、26周，相較對(duì)照組，HFD+E2組和E2組子宮體重顯著增大[(9.48±0.41)g，(8.81±0.60)g vs (7.06±0.31)g,P<0.01]；但HFD組小鼠子宮重量與對(duì)照組相比并無(wú)顯著差異[(7.46±0.33)g vs (7.06±0.31)g,P>0.05]。見(jiàn)圖1C。

2.2 高脂飲食和(或)雌激素暴露誘導(dǎo)小鼠子宮內(nèi)膜病變 飲食干預(yù)后第13周，100%(6/6)的HFD+E2組和66.7%(4/6)E2組小鼠子宮內(nèi)膜呈現(xiàn)不伴有不典型的子宮內(nèi)膜增生狀態(tài)，且子宮內(nèi)膜腺體/間質(zhì)比例明顯增加；但在HFD組和對(duì)照組小鼠子宮內(nèi)膜組織學(xué)檢查均為正常。飲食干預(yù)后第26周，100%(12/12)HFD+E2組、83.3%(10/12)的HFD組及91.7%(11/12)的E2組小鼠子宮內(nèi)膜均呈現(xiàn)增生狀態(tài)；并且25%(3/12)的HFD+E2組、25%(4/12)的HFD組及16.7%(2/12)的E2組小鼠的子宮內(nèi)膜出現(xiàn)腺體形狀不規(guī)則、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，腺上皮呈真復(fù)層結(jié)構(gòu)并向腺腔內(nèi)凸起、搭橋，且具有核異型性，提示出現(xiàn)子宮內(nèi)膜增生伴不典型。對(duì)照組小鼠子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)仍均正常。但持續(xù)26周的高脂飲食和(或)E2干預(yù)均未能誘導(dǎo)出子宮內(nèi)膜癌變。見(jiàn)圖2。

圖2 分組飲食干預(yù)26后各組小鼠子宮內(nèi)膜代表性組織學(xué)表現(xiàn)

2.3 高脂飲食和(或)雌激素誘導(dǎo)小鼠子宮內(nèi)膜組織差異表達(dá)的mRNA和circRNA的篩選 高通量RNA-seq結(jié)果顯示：上千個(gè)mRNA，LncRNA及circRNA在小鼠子宮內(nèi)膜組織內(nèi)表達(dá)。見(jiàn)圖3。干預(yù)第26周時(shí)HFD+E2、HFD、E2三組中相對(duì)于對(duì)照組的共同差異表達(dá)基因中差異倍數(shù)前十的基因見(jiàn)表3。其中5個(gè)基因(Cyp2f2、Hp、Angptl7、Ctla2a、Gpx3)在3組中均顯示下調(diào)，4個(gè)基因(Plat、Acta2、Tnc、Gstm7)在HFD+E2、HFD組中顯著上調(diào)，而Serpinb11基因在HFD、E2組中均上調(diào)。

高通量RNAseq結(jié)果還顯示：高脂飲食±E2干預(yù)后的第13周、第26周，HFD+E2組、HFD組及E2組小鼠子宮內(nèi)膜與對(duì)照組比較，存在大量差異表達(dá)的circRNA。表4列出的是干預(yù)第26周，HFD組相較對(duì)照組差異倍數(shù)排名前十且是已知的circRNA，并利用miRanda預(yù)測(cè)各circRNA的microRNA反應(yīng)元件(MREs)，并列出得分最高的四個(gè)MREs(表4)。

圖3 高通量RNAseq結(jié)果

表3 HFD+E2組、HFD組及E2組與對(duì)照組相比排名前十的共同差異表達(dá)mRNAs

2.4 高脂飲食和(或)雌二醇干預(yù)后小鼠子宮內(nèi)膜差異表達(dá)mRNA功能分析 GO富集提示，差異表達(dá)的mRNAs對(duì)脂代謝和(或)外源雌激素對(duì)免疫應(yīng)答、DNA復(fù)制調(diào)控及代謝途徑的影響較大。KEGG通路富集分析提示，高脂飲食和(或)E2干預(yù)后子宮內(nèi)膜組織mRNA轉(zhuǎn)錄譜在Wnt信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、細(xì)胞周期及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等信號(hào)通路中顯著富集。結(jié)合GO和KEGG分析的結(jié)果，雌激素和高脂飲食可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖及代謝過(guò)程誘發(fā)子宮內(nèi)膜病變。見(jiàn)圖4。

圖4 高脂飲食和(或)雌二醇干預(yù)后小鼠子宮內(nèi)膜差異表達(dá)mRNA的GO富集分析(A)和KEGG通路分析(B)

2.5 qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)mRNA及circRNA以人正常子宮內(nèi)膜組織作為對(duì)照，qRT-PCR驗(yàn)證測(cè)序篩選出的3個(gè)差異表達(dá)mRNA及3個(gè)差異表達(dá)circRNA(PLAT、Tnc、Slc16a14；mm9_circ_011137、mm9_circ_012214、mm9_circ_017142)在人EC組織內(nèi)的表達(dá)變化。結(jié)果顯示：上述6個(gè)RNAs均在人EC和子宮內(nèi)膜組織內(nèi)表達(dá)；除mm9_circ_012214外，其余2個(gè)circRNA及3個(gè)mRNA在人EC中的表達(dá)增降趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果一致。見(jiàn)圖5。

圖5 人EC樣品中的RNA-seq驗(yàn)證

表4 HFD組與對(duì)照組比較已知的排名前十差異表達(dá)circRNA及其預(yù)測(cè)的microRNA反應(yīng)元件(MREs)

2.6 ceRNA網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè) 使用miRanda等工具預(yù)測(cè)microRNA與差異circRNA的靶向關(guān)系，結(jié)合差異表達(dá)的mRNA結(jié)果進(jìn)一步對(duì)可能存在的circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖6)，RNA-seq顯示HFD+E2組和HFD組中差異表達(dá)的Ntrk3、Ltbp1、SLC16A14、Lgr6在子宮內(nèi)膜病變中可能通過(guò)ceRNA機(jī)制受到調(diào)控。ceRNA子網(wǎng)絡(luò)中mRNA和circRNA的RNA-seq差異表達(dá)情況，見(jiàn)表5。

圖6 circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)差異表達(dá)的circRNA(藍(lán)色圖標(biāo))與差異表達(dá)的靶向mRNA(綠色圖標(biāo))Ntrk3、Ltbp1、SLC16A14、Lgr6之間可能存在的miRNA(紅色圖標(biāo))，提示了子宮內(nèi)膜病變中ceRNA網(wǎng)絡(luò)的存在可能性

表5 ceRNA子網(wǎng)絡(luò)中mRNAs和circRNAs的RNA-seq差異表達(dá)

3 討 論

肥胖相關(guān)的致癌機(jī)制多年來(lái)一直是臨床、基礎(chǔ)研究中的熱點(diǎn)。闡明肥胖相關(guān)腫瘤的分子機(jī)制，被認(rèn)為是任何以減重作為預(yù)防或治療干預(yù)的公共衛(wèi)生措施得以實(shí)施的基礎(chǔ)。本研究中，通過(guò)長(zhǎng)達(dá)26周的高脂飲食干預(yù)ICR小鼠，構(gòu)建了肥胖及高脂血癥小鼠模型，組織學(xué)研究證實(shí)高脂飲食(肥胖)促進(jìn)小鼠子宮內(nèi)膜腺體增生；值得關(guān)注的是26周的高脂飲食干預(yù)下小鼠子宮內(nèi)膜出現(xiàn)了不典型增生，其發(fā)生率與持續(xù)的17β-雌二醇干預(yù)組相當(dāng)(25% vs 16.7%)。這一研究結(jié)果從動(dòng)物模型上揭示了高脂飲食攝入、肥胖與子宮內(nèi)膜病變的高度相關(guān)性。Cheng等[8]采用高脂飲食和(或)E2喂養(yǎng)C57BL/6小鼠12周后，發(fā)現(xiàn)高脂飲食促進(jìn)了小鼠子宮內(nèi)膜腺體的增殖；與本研究中第13周收集的小鼠子宮內(nèi)膜標(biāo)本組織學(xué)觀測(cè)結(jié)果一致，Cheng等[6]研究中各小鼠也未出現(xiàn)子宮內(nèi)膜不典型增生或癌變。Wilkinson等在BDII/Han大鼠(一種遺傳性易患子宮內(nèi)膜癌的大鼠)中分別給予高脂飲食與正常對(duì)照飲食喂養(yǎng)15個(gè)月后，9只正常飲食組大鼠及12只高脂飲食組大鼠內(nèi)均有4只大鼠出現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌變；雖然高脂飲食干預(yù)下的BDII/Han大鼠EC發(fā)病率并無(wú)顯著增加，但推測(cè)其原因可能主要與研究樣本量過(guò)少相關(guān)。目前的研究結(jié)果均認(rèn)為，高脂飲食(肥胖)與持續(xù)的雌激素刺激相似，可促進(jìn)子宮肥大，子宮內(nèi)膜腺體增生、不典型增生甚至癌變。

為進(jìn)一步探明高脂飲食下導(dǎo)致的肥胖與子宮內(nèi)膜病變的內(nèi)在分子機(jī)制，本研究對(duì)不同飲食干預(yù)下的小鼠子宮內(nèi)膜分別進(jìn)行高通量RNA-seq。結(jié)果證實(shí)，高脂飲食干預(yù)13周(此時(shí)小鼠子宮內(nèi)膜尚未出現(xiàn)增生改變)，就可誘導(dǎo)小鼠子宮內(nèi)膜RNA轉(zhuǎn)錄譜出現(xiàn)顯著改變。為探究差異表達(dá)mRNAs的潛在功能，本研究中進(jìn)一步采用生物信息學(xué)方法，GO富集分析顯示高脂飲食和(或)外源雌激素對(duì)免疫應(yīng)答、DNA復(fù)制調(diào)控及細(xì)胞能量代謝途徑等術(shù)語(yǔ)富集。KEGG通路分析表明，高脂飲食和(或)E2干預(yù)后子宮內(nèi)膜組織mRNA轉(zhuǎn)錄譜在Wnt信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、細(xì)胞周期及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等信號(hào)通路中顯著富集。這一研究結(jié)果與Cheng等[8]采用高脂飲食喂養(yǎng)C57BL/6小鼠后子宮內(nèi)膜差異轉(zhuǎn)錄本功能分析一致，在其研究中GO和KEGG分析顯示E2和(或)HFD調(diào)控的基因主要負(fù)責(zé)免疫應(yīng)答、炎癥應(yīng)答和代謝途徑。由于免疫反應(yīng)、代謝途徑、Wnt信號(hào)通路[11]、P53信號(hào)通路[12]等在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用已被眾多研究證實(shí)。因此本研究中小鼠子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)錄譜測(cè)序結(jié)果也提示：高脂飲食(肥胖)可能通過(guò)改變小鼠子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)錄譜，進(jìn)而促進(jìn)子宮內(nèi)膜病變。

本研究中通過(guò)進(jìn)一步延長(zhǎng)干預(yù)時(shí)間及深度測(cè)序分析circRNA、LncRNA表達(dá)譜的改變，探討了高脂飲食對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜cicrRNA、LncRNA、miRNA的影響，及通過(guò)構(gòu)建了ceRNA作用網(wǎng)絡(luò)探討了RNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。circRNA參與下的ceRNA網(wǎng)絡(luò)是RNA間相互作用新機(jī)制[7]，但在子宮內(nèi)膜癌中circRNA參與的ceRNA網(wǎng)絡(luò)分析目前尚少。本研究對(duì)差異表達(dá)的circRNA可能參與的ceRNA網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，通過(guò)限制circRNA與mRNA差異表達(dá)的一致性確定了4個(gè)潛在的ceRNA子網(wǎng)絡(luò)：Ntrk3、Ltbp1、SLC16A14、Lgr6。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白酪氨酸激酶受體3(Ntrk3)是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體基因，已經(jīng)在肺癌、乳腺癌和肝細(xì)胞癌中證明是潛在的致癌基因[13]，并在結(jié)直腸癌中高甲基化[14]。其3'UTR區(qū)域已被證明可與miR-509、miR-128[15]和miR-497直接結(jié)合[16]，并與LINC00978在胃癌中形成ceRNA網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖[16]。Ltbp1編碼潛在TGF-β結(jié)合蛋白(latent TGFβ binding protein)，通過(guò)與TGF-β的共價(jià)連接使其處于潛伏期，對(duì)TGF-β折疊、分泌、基質(zhì)定位和活化至關(guān)重要[17]。Ltbp1在食管癌中可通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)換，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[18]；SLC16A14又名MCT14，是細(xì)胞膜上單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(monocarboxylate transporter，MCT)家族的孤兒成員，MCT蛋白介導(dǎo)單羧酸鹽如乳酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，在腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解過(guò)程中避免了細(xì)胞內(nèi)乳酸水平過(guò)高、細(xì)胞酸化引起的反饋抑制[19]，SLC16A14在上皮性卵巢癌中證實(shí)可作為腫瘤進(jìn)展的標(biāo)志物[20]。Lgr6是富含亮氨酸的G蛋白偶聯(lián)受體，在人體組織中廣泛分布，作為糖蛋白激素受體家族的新成員，目前尚未發(fā)現(xiàn)其生理性配體，故又稱(chēng)Lgr6為孤兒受體[21]。Lgr6(G蛋白偶聯(lián)受體)表達(dá)陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞[22]和肺癌細(xì)胞顯示出自我更新和分化特性以及更高的致癌潛力，被認(rèn)為是具有惡性潛能的干細(xì)胞樣細(xì)胞群[23]。

本研究也有一些不足的地方：首先，研究終點(diǎn)設(shè)定在飲食干預(yù)后的第26周，進(jìn)一步延長(zhǎng)高脂飲食干預(yù)時(shí)間是否將誘導(dǎo)ICR小鼠子宮內(nèi)膜不典型增生率的升高，甚至癌變的發(fā)生尚不清楚。此外，主要關(guān)注了HFD±E2干預(yù)下各組小鼠子宮內(nèi)膜RNA表達(dá)譜的變化，并未對(duì)比各干預(yù)組內(nèi)有不典型增生和無(wú)不典型增生的小鼠子宮內(nèi)膜RNA表達(dá)譜的差異。而這種差異可能對(duì)了解子宮內(nèi)膜病變過(guò)程中RNA時(shí)空表達(dá)變化具有重要意義，因此值得在接下來(lái)的研究中進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究通過(guò)長(zhǎng)達(dá)26周的高脂飲食建立肥胖相關(guān)小鼠子宮內(nèi)膜病變模型，證實(shí)了高脂飲食導(dǎo)致的肥胖、高甘油三酯血癥與小鼠子宮內(nèi)膜病變高度相關(guān)。并通過(guò)對(duì)不同飲食干預(yù)組小鼠子宮內(nèi)膜的高通量RNA-seq發(fā)現(xiàn)高脂飲食、肥胖可誘導(dǎo)小鼠子宮內(nèi)膜組織mRNA、LncRNA、cicrRNA轉(zhuǎn)錄譜出現(xiàn)顯著改變，這些改變有可能改變了子宮內(nèi)膜的穩(wěn)態(tài)，而導(dǎo)致小鼠子宮內(nèi)膜病變。而差異表達(dá)cicrRNA的ceRNA作用機(jī)制與子宮內(nèi)膜病變或癌變的相關(guān)作用值得進(jìn)一步研究探討。本研究拓寬了我們對(duì)非編碼RNA參與高脂飲食、肥胖在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的理解，也為進(jìn)一步研究肥胖相關(guān)子宮內(nèi)膜病變的分子途徑提供了新思路。