大鼠外陰陰道假絲酵母菌病模型感染及治療后的透射電鏡和局部免疫研究*

李 婷，張 旭，白會會,范琳媛,張 展,王素霞,劉朝暉

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院 a.婦科;b.微生態(tài)實驗室，北京 100026；2.北京大學(xué)第一醫(yī)院電鏡室，北京 100034)

外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginalcandidiasis,VVC)是臨床常見婦科疾病，而機會性致病的白假絲酵母菌是其常見病原體。VVC具有頑固復(fù)發(fā)的特點，而VVC反復(fù)發(fā)作者往往療效不理想，導(dǎo)致生活質(zhì)量下降及相關(guān)醫(yī)療費用增加[1]。陰道微生態(tài)系統(tǒng)是人體四大生態(tài)系統(tǒng)中較為復(fù)雜的系統(tǒng)，在人類疾病的防御機制方面起著重要作用，由其解剖結(jié)構(gòu)、微生態(tài)菌群、局部免疫及機體的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能共同組成。中華醫(yī)學(xué)會婦產(chǎn)科分會感染協(xié)作組和中國醫(yī)師協(xié)會婦產(chǎn)科分會共同指出,陰道感染的終極治療目標(biāo)是恢復(fù)陰道微生態(tài)平衡，全面評價陰道感染及治療前后的陰道微生態(tài)系統(tǒng)，指導(dǎo)臨床達到恢復(fù)陰道微生態(tài)環(huán)境正常這一最終目標(biāo)。制霉菌素具有廣譜抗真菌作用，屬于多烯類抗真菌藥，通過破壞真菌的細胞膜,使其內(nèi)容物外漏而死亡,達到抗真菌的效果，常被用于治療VVC[2]。臨床上，中醫(yī)藥在VVC中的療效受到越來越多學(xué)者們的關(guān)注，其具有療效穩(wěn)定、毒副作用低、耐藥較少等優(yōu)點[3]?？鄥⒛z具有抗菌、抗炎、殺蟲止癢、解熱鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等的功效，可用于濕熱瘀滯所致的帶下病，對多種陰道感染有良好的治療效果[4-5]?，F(xiàn)建立大鼠陰道真菌感染的陰道炎模型以探討感染及治療后陰道超微結(jié)構(gòu)及局部免疫環(huán)境的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特殊病原體(SPF)級體重約180～200g雌性未孕Sprague-Dawley(SD)大鼠共40只，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證：SCXK(京)2016-0006。全部大鼠在恒溫、恒濕的清潔環(huán)境中喂養(yǎng)，光照12h明暗交替。本實驗經(jīng)動物管理與使用委員會(IACUC)批準(zhǔn)，全過程遵循倫理委員會關(guān)于動物實驗的相關(guān)規(guī)定。

1.2 實驗藥品 制霉菌素陰道泡騰片[中美上海施貴寶制藥有限公司，規(guī)格：100mg/片，H31022516]，每片含制霉菌素10萬IU。坤立舒?苦參凝膠[貴陽新天藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：5g/支(含苦參堿以氧化苦參堿計為100mg)，國藥準(zhǔn)字號：Z20050058]主要是由苦參總堿、卡波姆940等材料制成的棕色透明膠凍狀半固體水溶性凝膠?？瞻啄z為除去苦參總堿成分的基質(zhì)凝膠?？鄥⒛z及制霉菌素按大鼠給藥劑量根據(jù)人和動物間按體表面積折算的等效劑量換算分別為0.5/(kg·d)及1.0×104IU/(kg·d)。

1.3 致病菌及主要試劑 白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC-11006)轉(zhuǎn)種于沙保羅瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，挑取生長良好的菌種懸浮于生理鹽水中，調(diào)整濃度為1×109/mL，備用。兔抗大鼠IL-4、IL-17、IL-21、IFN-γ抗體購自美國cloud-clone公司。

1.4 方法

1.4.1 建模及給藥 大鼠檢疫合格后，隨機分為正常組、模型對照組、制霉菌素組、空白凝膠組以及中藥組，每組8只。造模動物進行卵巢切除手術(shù)，正常組僅切除卵巢周圍少量脂肪組織。術(shù)后第10天皮下注射10mg/kg β-雌二醇，造模后第15天陰道灌注真菌懸液連續(xù)11天，感染后第4天取無菌棉拭子插入動物陰道內(nèi)，陰道分泌物涂片行革蘭氏染色驗證模型造模成功。隨后按分組予以不同的藥物進行陰道灌注給藥，每天1次，連續(xù)14天，正常組與模型對照組予等量生理鹽水。停藥后第4天動物安樂死病理取材。

1.4.2 病原體轉(zhuǎn)陰率計算 停藥后第1天和第4天分別取大鼠陰道分泌物涂片并行革蘭染色鏡檢觀察，鏡檢未檢出芽繁殖的芽生孢子和假菌絲定為病原體轉(zhuǎn)陰。轉(zhuǎn)陰率=轉(zhuǎn)陰大鼠數(shù)/各組大鼠總數(shù)×100%。

1.4.3 蘇木精-伊紅染色 所有大鼠取陰道中段組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后垂直于管腔面切片，切片行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色，采用Case Viewer數(shù)字切片進行病理組織學(xué)檢查并測量陰道黏膜上皮層數(shù)和厚度。

1.4.4 透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu) 另取小塊陰道中段組織經(jīng)2.5%戊二醛固定液中固后制作電鏡切片。環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機切片后醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。日本JEM-1200EX透射電鏡下觀察陰道組織顯微結(jié)構(gòu)并拍照。

1.4.5 免疫組化 陰道組織切片后進行IL-4、IL-17、IL-21、IFN-γ免疫組化染色，結(jié)果采用免疫組化染色評分(Immunoreative score,IRS)進行評估[6]。IRS總分為陽性細胞百分比與染色強度的乘積。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠VVC模型造模成功 除正常組外，所有大鼠于感染后第4天取陰道分泌物涂片行革蘭氏染色鏡檢發(fā)現(xiàn)白假絲酵母菌假菌絲和(或)芽生孢子，VVC模型造模成功(圖1)。

圖1 大鼠VVC模型陰道涂片(×1000)

2.2 大鼠陰道分泌物病原體轉(zhuǎn)陰率檢測 停藥后第1天，模型對照組、制霉菌素組、空白凝膠組及中藥組的病原體轉(zhuǎn)陰率存在顯著差異(P<0.001)。其中制霉菌素的轉(zhuǎn)陰率最高為87.50%，其次為中藥組為75.00%，空白凝膠組為12.50%。模型對照組的轉(zhuǎn)陰率最低為0%。停藥第4天，制霉菌素組的病原體轉(zhuǎn)陰率最高為100.00%，其次為中藥組為87.50%，模型對照組及空白凝膠組的轉(zhuǎn)陰率為0%，見表1。

2.3 HE染色結(jié)果 HE染色下感染模型組及空白凝膠組的陰道黏膜中可見炎細胞浸潤，黏膜上皮完整性受到破壞，較正常組黏膜層數(shù)及厚度顯著降低(P=0.025及P=0.011)，見表2及圖2。制霉菌素及中藥苦參凝膠治療后，上皮內(nèi)可見炎細胞浸潤減少，上皮結(jié)構(gòu)未見明顯異常，而黏膜層數(shù)及厚度與模型組和空白凝膠組無顯著差異(P=0.066及P=0.088),見表2及圖2，幾乎未見間質(zhì)水腫。

表1 各組大鼠病原體轉(zhuǎn)陰率

表2 各組陰道黏膜組織學(xué)特征

圖2 各組大鼠陰道組織的HE染色(×200)藍色箭頭:被破壞的陰道黏膜上皮，藍色框內(nèi)可見炎細胞浸潤

2.4 透射電鏡結(jié)果 正常大鼠陰道組織中復(fù)層上皮細胞間連接緊密，細胞表面微絨毛樣結(jié)構(gòu)及糖萼完整(圖3A)。感染真菌后(模型對照組及空白凝膠組)部分表面被覆的鱗狀上皮缺損，上皮細胞變性、壞死脫落，管腔內(nèi)可見較多炎性滲出物及壞死組織，黏膜下固有層可見炎細胞浸潤；上皮層可見炎細胞浸潤，細胞間連接橋粒斷裂，細胞間隙增寬，細胞內(nèi)線粒體顯著腫脹變性、基質(zhì)密度下降，表層細胞表面光滑，未見微絨毛及糖萼(圖3B、D)。而經(jīng)制霉菌素和中藥苦參凝膠治療后，陰道組織中可見局灶線粒體輕度腫脹，細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)未見明確破壞，上皮細胞表面微絨毛及糖萼較模型組增多(圖3C、E)。

2.5 免疫組化染色結(jié)果 各組間IFN-γ(Th1類細胞因子)及IL-4(Th2類細胞因子)無顯著差異(P>0.05)。IL-17在正常對照組的表達較低，白假絲酵母菌感染后表達顯著上調(diào)(P=0.017)，與空白凝膠組無顯著差異(P=0.620)。采用制霉菌素及中藥苦參凝膠治療后,IL-17蛋白表達水平較模型組無明顯變化(P=0.620；P=0.324)，但顯著高于正常組(P=0.005；P=0.001)。IL-21在正常對照組的表達較低，白假絲酵母菌感染后稍升高但差異不具有顯著性(P=0.266)，與空白凝膠組無顯著差異(P=0.823)。采用制霉菌素及中藥苦參凝膠治療后,IL-21蛋白表達水平較模型組無明顯變化(P=0.123；P=0.123)，但顯著高于正常組(P=0.010；P=0.010)。見表3、圖4。

表3 各組間大鼠陰道組織中免疫活性因子的表達(n=8)

圖3 各組大鼠陰道組織的透射電鏡結(jié)果

圖4 各組間大鼠陰道組織中免疫活性因子的免疫組化結(jié)果A:正常組;B:模型對照組;C:制霉菌素組;D:空白凝膠組;E:中藥組

3 討 論

本研究采用VVC大鼠模型，雌性大鼠的生殖道與人類女性有很多相似的微環(huán)境[7]。大鼠是嚙齒類實驗動物，在正常情況下自然免疫能力較強，陰道內(nèi)不易感染致病菌。文獻報道,17-β-雌二醇注射可構(gòu)建免疫力低下模型，增加大鼠對真菌的易感性，保證VVC建模成功[8]。

本研究結(jié)果提示，模型對照組大鼠停藥第1天及第4天的病原體轉(zhuǎn)陰率均為0%，提示生理鹽水沖洗陰道無法有效清除真菌感染，如不及時治療真菌會持續(xù)感染。制霉菌素作為經(jīng)典的抗真菌藥物，其停藥后第4天病原體清除率為100%?？鄥⒛z的主要成分是苦參總堿，是目前臨床上常用于婦科炎癥的中成藥。本研究結(jié)果證實，苦參凝膠對白假絲酵母菌病原體的清除有一定的作用，但效果稍差于典型的抗真菌藥制霉菌素，提示苦參凝膠等中成藥可作為VVC治療的輔助用藥，但需與抗真菌藥物聯(lián)用。有體外研究報道，苦參堿有較強的抗真菌活性，能殺滅多種真菌，并且能抑制白假絲酵母菌生物膜的形成及代謝狀態(tài)，進一步支持本研究結(jié)果[9-10]。而不含苦參總堿的空白凝膠停藥第1天轉(zhuǎn)陰率為12.5%，而停藥第4天的轉(zhuǎn)陰率為0%，其原因可能為停藥早期因空白凝膠的沖刷作用出現(xiàn)個別轉(zhuǎn)陰，隨后殘余真菌復(fù)發(fā)導(dǎo)致轉(zhuǎn)陰率為0%。

陰道黏膜屏障是由上皮屏障、免疫屏障、微生物群屏障、化學(xué)屏障和黏液層等所構(gòu)成的一種復(fù)雜的防御體系，從而可有效地阻擋病原微生物侵入機體。其中糖萼是細胞表面富含多糖的結(jié)構(gòu)，是細胞表面的首要防線[11]。因此，治療下生殖道感染時，需對該黏膜屏障進行修復(fù)重建[12]。陰道組織病理HE染色研究結(jié)果證實，制霉菌素及中藥苦參凝膠在大鼠VVC模型的陰道黏膜組織病理學(xué)修復(fù)作用較弱。而在透射電鏡下觀察大鼠陰道超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，真菌感染后，細胞間連接橋粒斷裂及線粒體顯著腫脹變性，陰道上皮表層細胞表面糖萼的脫落消失，與其他學(xué)者研究結(jié)果一致，糖萼的損傷暴露出上皮細胞的黏附分子，伴有機體炎癥反應(yīng)，炎性因子可加劇黏膜上皮細胞糖萼的損傷，最終導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[13]。糖萼是覆蓋于上皮細胞及內(nèi)皮細胞表面的絨毛狀多糖-蛋白復(fù)合結(jié)構(gòu)，是上皮屏障的重要組成，同時也是炎癥反應(yīng)時最早被損傷的部位之一，廣泛參與血管、黏膜通透性及機體炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，在維持機體內(nèi)環(huán)境、上皮功能及免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[14]。而目前關(guān)于陰道上皮細胞表面糖萼功能的研究較少，糖萼的降解與越來越多的病理狀態(tài)相關(guān)，或許成為未來的黏膜修復(fù)治療目標(biāo)，還沒有確定的藥物可直接作用于糖萼的保護和再合成，目前對糖萼研究仍停留基礎(chǔ)階段[15]。本研究結(jié)果證實，制霉菌素能修復(fù)陰道上皮超微結(jié)構(gòu)，維持陰道上皮細胞良好形態(tài)，線粒體腫脹程度降低，減輕機體炎癥反應(yīng)，修復(fù)并維持上皮微絨毛及糖蕚穩(wěn)定，可改善陰道上皮的病理狀態(tài)。而苦參凝膠其主要活性成分為苦參堿類生物堿，有抗炎、抗菌、解熱鎮(zhèn)痛及加速黏膜修復(fù)作用[16]，其對陰道組織超微結(jié)構(gòu)的修復(fù)作用與制霉菌素類似。

越來越多的學(xué)者認識到陰道局部固有免疫應(yīng)答與VVC相關(guān)的炎癥反應(yīng)的重要性，認為VVC是一種免疫病理學(xué)疾病[17]。本研究結(jié)果提示，各組間Th1類細胞因子的代表因子IFN-γ水平及各組間Th2類細胞因子的代表因子IL-4水平均無顯著差異，Th1類細胞因子介導(dǎo)的細胞免疫應(yīng)及Th2類細胞因子介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答可能在制霉菌素及苦參凝膠作用中并未發(fā)揮關(guān)鍵抗真菌作用。IL-17及IL-21作為Th17類細胞因子的代表因子，Th17細胞因子能有效地介導(dǎo)中性粒細胞的動員和活化的過程，主要是抗細胞外病原體，在機體抗真菌中發(fā)揮著重要作用[18-20]。本研究結(jié)果提示，大鼠陰道內(nèi)接種白假絲酵母菌后，IL-17表達較正常大鼠顯著升高以清除致病真菌，與前期小鼠VVC模型研究結(jié)果類似[21]。加入制霉菌素或苦參凝膠治療后，IL-17蛋白稍升高但與模型組無顯著差異，兩種藥物在陰道黏膜免疫功能調(diào)節(jié)中的作用需增加樣本量進一步研究。

VVC的病因及發(fā)病機制較復(fù)雜、頑固難愈，已成為臨床醫(yī)學(xué)的研究熱點。目前，陰道黏膜屏障功能與陰道局部免疫調(diào)控在VVC致病機制中的作用越來越受到重視。本研究結(jié)果證實，真菌感染后大鼠陰道上皮組織被顯著破壞，而制霉菌素及苦參凝膠能在體內(nèi)發(fā)揮抗白假絲酵母菌活性，促進受損陰道上皮超微結(jié)構(gòu)尤其是糖萼的修復(fù)。而制霉菌素及苦參凝膠在陰道局部抗真菌免疫應(yīng)答中的作用還需進一步深入研究。