清肝化痰方對(duì)H型高血壓大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平及頸動(dòng)脈結(jié)構(gòu)的影響

蔣文波，黃 霞，金 玉，陳 昊，季海剛，徐俊偉，顧 寧

高血壓是心血管疾病發(fā)生的一種主要危險(xiǎn)因素[1]。H型高血壓是伴血同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平升高(血Hcy水平≥15 μmol/L)的高血壓疾病[2]。炎癥通常引發(fā)系列生物反應(yīng)事件，稱(chēng)為急性期反應(yīng)，其主要由早期反應(yīng)細(xì)胞因子的介導(dǎo)產(chǎn)生。實(shí)際上，Hcy通過(guò)從血管內(nèi)皮細(xì)胞如白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性細(xì)胞因子的釋放進(jìn)而誘導(dǎo)血管炎癥[3]。有研究報(bào)道，在肝部炎癥反應(yīng)加重的小鼠模型中，施藥后可降低模型小鼠炎性因子表達(dá)水平，改善肝組織炎癥反應(yīng)等[4]。

清肝化痰方是江蘇省名中醫(yī)顧寧教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方，主要功效為清肝瀉火、健脾化痰，適用于治療高血壓肝火亢盛夾痰證。方藥組成：冬桑葉10 g，白蒺藜10 g，姜半夏10 g，蒸陳皮10 g，決明子10 g，杭白菊15 g，白茯苓15 g，淡竹茹10 g，炒枳殼10 g，谷精草15 g，炙甘草5 g。清肝化痰方中的冬桑葉、白蒺藜、決明子、杭白菊為君藥，清肝瀉火；姜半夏、白茯苓、廣陳皮、淡竹茹、炒枳殼為臣藥，健脾化痰；谷精草為佐藥，疏散肝熱；炙甘草為使藥，調(diào)和諸藥。本研究旨在探討清肝化痰方對(duì)H型高血壓大鼠平均動(dòng)脈壓、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)水平和頸動(dòng)脈結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)雄性30只，鼠齡為9周，體質(zhì)量200～220 g；SPF級(jí)同源正常血壓大鼠(Wistar Kyoto rats，WKY)雄性10只，鼠齡9周，體質(zhì)量(230±10)g。所有大鼠均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 DL-蛋氨酸粉末購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，大鼠飼料購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，Hcy試劑盒購(gòu)自美國(guó)BG公司，馬來(lái)酸依那普利葉酸片(依葉)購(gòu)自深圳奧薩制藥有限公司(批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20103723)，清肝化痰方采用天江藥業(yè)生產(chǎn)的中藥配方顆粒。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 2%蛋氨酸水溶液：DL-蛋氨酸粉末2 g，加雙蒸水定容至100 mL；10%水合氯醛溶液：水合氯醛粉末10 g，加雙蒸水定容100 mL。

1.2 構(gòu)建H型高血壓大鼠模型

1.2.1 動(dòng)物模型制備 選用雄性SHR大鼠30只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，給予2%蛋氨酸溶液10 mL/100 g體質(zhì)量作為飲用水，連續(xù)4周后檢測(cè)大鼠血漿中Hcy水平，若血漿Hcy≥15 μmol/L，則符合H型高血壓大鼠模型的構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 血漿Hcy測(cè)定 先連續(xù)喂養(yǎng)4周，遵循0.3 mL/100 g體質(zhì)量的10%水合氯醛，腹腔注射麻醉。采集1 mL血依次注射于含有EDTA抗凝劑的試管中，再以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，收集上層血漿，全自動(dòng)生化分析儀Cabas 8000檢查Hcy濃度。

1.2.3 造模結(jié)果 實(shí)驗(yàn)選用SHR、WKY大鼠均無(wú)死亡發(fā)生。SHR大鼠造模后，若查血Hcy≥15 μmol/L，即符合H型高血壓大鼠模型的構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)，提示造模成功[5]。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將符合H型高血壓模型的30只SHR大鼠隨機(jī)分為模型組、依葉組、清肝化痰方組，每組10只。模型組：正常飼養(yǎng)8周。依葉組：正常飼養(yǎng)，加0.06%依那普利葉酸按10 mL/100 g灌胃，每日1次，連續(xù)干預(yù)8周。清肝化痰方組：在H型高血壓大鼠模型構(gòu)建基礎(chǔ)上，正常飼養(yǎng)，同時(shí)給予清肝化痰方灌胃，將清肝化痰方顆粒加水200 mL煎煮10 min，剩余藥液不足200 mL者加蒸餾水至200 mL備用，按成人體質(zhì)量200 mL/60 kg(0.003 mL/g)濃度，2倍濃度灌胃，每日1次，連續(xù)干預(yù)8周。另設(shè)對(duì)照組：健康飼養(yǎng)的同源正常血壓WKY雄性大鼠10只，給予雙蒸水作為飲用水，不進(jìn)行飼料添加處理，按正常飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行喂養(yǎng)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 檢測(cè)大鼠平均動(dòng)脈壓 為了減少測(cè)量血壓期間實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的精神壓力，本研究采用Muromachi尾套血壓測(cè)量?jī)x器(非侵入式)用于本實(shí)驗(yàn)。每周使用無(wú)創(chuàng)的智能血壓計(jì)鼠儀BP-2010A檢測(cè)各組大鼠的收縮壓、舒張壓。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，在08：00～09：00時(shí)，將大鼠稱(chēng)重后再將動(dòng)脈插管連接到壓力傳感器上，記錄基礎(chǔ)脈動(dòng)血壓30 min，每只記錄3次，取其平均數(shù)值作為測(cè)量的血壓值。計(jì)算大鼠白天的平均動(dòng)脈壓，平均動(dòng)脈壓=(收縮壓+2×舒張壓)/3。

1.4.2 免疫組化測(cè)量大鼠頸動(dòng)脈中膜厚度(CMT)、頸動(dòng)脈內(nèi)徑(CAID)、頸動(dòng)脈中膜橫截面面積(CAMT) 將大鼠麻醉后固定在手術(shù)臺(tái)上，頸部去毛后進(jìn)行切口，取出頸動(dòng)脈后用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗干凈，然后將這些片段充分浸沒(méi)在10%中性甲醛溶液中固定過(guò)夜，用切片機(jī)將樣品切成5 μm厚度的組織切片。測(cè)量每條頸動(dòng)脈上的特定區(qū)域(從分叉開(kāi)始)，并進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，拍照，各組大鼠頸動(dòng)脈切片編號(hào)并放進(jìn)盒子里。在Nikon Eclipse TE 2000-U顯微鏡上使用40倍放大率讀取載玻片，通過(guò)Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件采集圖像，測(cè)定分析各組大鼠的CMT、CAID、CAMT。

1.4.3 蛋白免疫印跡法分析大鼠主動(dòng)脈中TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表達(dá)情況 采用50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)提取4組大鼠主動(dòng)脈中的總細(xì)胞蛋白質(zhì)。在SDS-11%聚丙烯酰胺凝膠上分離含有30 μg總蛋白質(zhì)的樣品，將100 μL的細(xì)胞裂解液和1%苯甲基磺酰氟(PMSF)100 mmol/L和原釩酸鈉100 mmol/L加入到每個(gè)孔中，在冰上保持15 min。使用12%凝膠通過(guò)SDS-PAGE分離30 μg每種蛋白質(zhì)裂解物，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，用5%脫脂乳[5%牛血清白蛋白(BSA)封閉用于檢測(cè)磷酸化抗體]封閉非特異性相互作用2 h。用識(shí)別大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6(1∶500)的原代兔抗體探測(cè)硝酸纖維素，辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)綴合的二抗(稀釋比為1∶5 000)、New h-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)標(biāo)，ChemiDocTM MP成像系統(tǒng)收集圖像，Image Lab軟件通過(guò)光密度測(cè)定法定量免疫印跡上的條帶，并統(tǒng)計(jì)灰度值進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠平均動(dòng)脈壓、舒張壓及收縮壓比較 藥物干預(yù)第8周時(shí)，模型組、依葉組、清肝化痰方組平均動(dòng)脈壓、舒張壓、收縮壓均較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，清肝化痰方組、依葉組平均動(dòng)脈壓、舒張壓、收縮壓均較模型組降低(P<0.05或P<0.01)，且清肝化痰方組平均動(dòng)脈壓、舒張壓、收縮壓均較依葉組明顯降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)第8周平均動(dòng)脈壓、舒張壓及收縮壓比較(±s) 單位：mmHg

2.2 HE染色檢測(cè)大鼠血管纖維化 藥物干預(yù)第8周時(shí)，通過(guò)HE染色檢測(cè)大鼠血管纖維化，結(jié)果顯示：模型組較對(duì)照組血管纖維化程度明顯增加，依葉組和清肝化痰方組較模型組血管纖維化程度明顯降低；其中，與依葉組比較，清肝化痰方組血管纖維化程度明顯降低。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠血管纖維化HE染色結(jié)果(×400)

2.3 各組大鼠頸動(dòng)脈CMT、CAID及CAMT比較 藥物干預(yù)第8周時(shí)，顯微鏡觀(guān)察并測(cè)量各組大鼠頸動(dòng)脈CMT、CAID、CAMT，結(jié)果顯示：模型組CMT、CAMT較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，清肝化痰方組、依葉組CMT、CAMT較模型組明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且清肝化痰方組CMT、CAMT較依葉組明顯降低(P<0.05)。模型組CAID較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，清肝化痰方組、依葉組CAID較模型組明顯升高(P<0.05或P<0.01)，且清肝化痰方組CAID較依葉組明顯升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠頸動(dòng)脈CMT、CAID及CAMT比較(±s)

2.4 各組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表達(dá)水平比較 藥物干預(yù)第8周時(shí)，采用蛋白免疫印跡技術(shù)分析各組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：模型組TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組升高(P<0.05)，依葉組TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)水平較模型組降低(P<0.05)，清肝化痰方組TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)水平較模型組明顯降低(P<0.01)。詳見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 蛋白免疫印跡檢測(cè)各組炎性因子表達(dá)

與對(duì)照組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，△P<0.01。圖3 各組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表達(dá)水平比較(A為IL-1β；B為IL-6；C為T(mén)NF-α)

3 討 論

高Hcy誘導(dǎo)的動(dòng)脈通透性增加可能涉及由細(xì)胞因子TNF-α產(chǎn)生的氧化應(yīng)激。TNF-α是一種促炎細(xì)胞因子，可以提高內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞氧負(fù)離子[6-7]。Hcy可能促進(jìn)內(nèi)皮功能障礙，這可能與氧化應(yīng)激有關(guān)，可導(dǎo)致血管系統(tǒng)中促炎途徑的激活[8]。實(shí)驗(yàn)第8周測(cè)量各組大鼠的平均動(dòng)脈壓、舒張壓、收縮壓，模型組、依葉組較對(duì)照組明顯升高，依那普利葉酸、清肝化痰方組較模型組降低，其中，清肝化痰方組較模型組降低更明顯。H型高血壓病人表現(xiàn)出血管內(nèi)皮細(xì)胞的破壞，血管結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[9-11]。Hcy誘導(dǎo)的H型高血壓大鼠模型中，模型組CMT、CAMT較對(duì)照組升高，模型組CAID較對(duì)照組降低，說(shuō)明模型組大鼠的頸動(dòng)脈結(jié)構(gòu)發(fā)生了異常變形；而依葉組和清肝化痰方組CMT、CAID及CAMT均較模型組改善，其中清肝化痰方組改善較為明顯。

TNF-α是組織炎癥的中樞介質(zhì)之一，誘導(dǎo)其他炎性細(xì)胞因子的合成，而IL-6水平升高與心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)[12]。Hcy通過(guò)從血管內(nèi)皮細(xì)胞因子如IL-6、IL-1β和TNF-α釋放炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)血管炎癥等[13-14]。與對(duì)照組相比，模型組TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)均明顯升高，清肝化痰方組TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)水平均較模型組降低。Hcy能夠誘導(dǎo)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子IL-1β和單核細(xì)胞趨化蛋白-1的mRNA和蛋白表達(dá)[15-16]，因?yàn)镠cy和炎癥參數(shù)似乎與血管疾病的發(fā)生有關(guān)[17]。研究表明H型高血壓大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表達(dá)水平明顯升高，可能造成頸動(dòng)脈中膜厚度增加、頸動(dòng)脈內(nèi)徑減小、頸動(dòng)脈中膜橫截面面積增大。清肝化痰方通過(guò)降低H型高血壓大鼠的平均動(dòng)脈壓、收縮壓、舒張壓及TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表達(dá)水平，降低血管纖維化，從而很大程度上改善頸動(dòng)脈異常變形，為中醫(yī)藥治療H型高血壓提供了一定客觀(guān)證據(jù)。