基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討麝香通心滴丸治療心力衰竭的潛在機制

權(quán) 力，牛文豪，趙 健，張艷達，賀治青，梁 春

心力衰竭(heart failure，HF)指因各種心臟結(jié)構(gòu)或功能性疾病導(dǎo)致心室充盈和(或)射血能力受損而引起的一組綜合征，是各種器質(zhì)性心臟病的終末期表現(xiàn)，也是心血管疾病中最常見的類型[1]。流行病學(xué)調(diào)查表明，心力衰竭的發(fā)生率隨著老齡化的進展逐年上升，且該病的死亡率可達50%，一旦出現(xiàn)心力衰竭，大部分病人心力衰竭呈進行性惡化[2]。目前心力衰竭的臨床治療方法包括藥物干預(yù)、血運重建及心臟移植等，其中藥物干預(yù)主要有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素Ⅱ抑制劑(ARB)、醛固酮受體拮抗劑、β受體阻滯劑和利尿劑等[3-4]。但單純西藥干預(yù)存在一定不良反應(yīng)，尤其是對低血壓慢性收縮性心力衰竭，應(yīng)用ACEI、ARB、β受體阻滯劑等可導(dǎo)致基礎(chǔ)血壓進一步下降，引發(fā)機體各臟器低灌注表現(xiàn)，反而增加病人死亡率[5]。

近年來中醫(yī)對心力衰竭的研究逐漸深入。中醫(yī)學(xué)將心力衰竭歸為“怔忡”“喘證”“痰飲”“水腫”等范疇，認為心力衰竭屬本虛標(biāo)實之證，其中本虛以氣虛、陽虛、陰虛為主，而標(biāo)實則以血瘀、水飲、痰濁為主[6]，故中醫(yī)治療多采用益氣溫陽、活血利水的方法[7]。一些經(jīng)典的益氣活血藥物，如黃芪、丹參、人參、紅花、益母草、茯苓、葶藶子等，以及芪參益氣滴丸、芪藶強心膠囊、生脈注射液等溫陽利水藥物，已被證明能有效緩解心力衰竭癥狀并減少副作用[8]。一些研究著眼于尋找新的藥物治療心力衰竭，近年來麝香通心滴丸也越來越多地用于心力衰竭的治療中[9-10]。麝香通心滴丸的組方是依據(jù)《蘇沈良方》中的至寶丹和傳統(tǒng)名方六神丸加減化裁而來，其藥物組成主要包括人工麝香、牛黃、人參莖葉總皂苷、丹參、熊膽粉、冰片、蟾酥等[11]。已有研究證明，麝香通心滴丸可改善心力衰竭病人癥狀，提高心臟射血分數(shù)，延緩心臟重構(gòu)，并降低心力衰竭相關(guān)標(biāo)志物水平[10，12]。但麝香通心滴丸的成分較多，作用機制較復(fù)雜，目前因受各種條件限制未能完全明確，故本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究麝香通心滴丸治療心力衰竭的潛在機制。

1 資料與方法

1.1 藥物有效成分及其靶點篩選 應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)、中藥綜合數(shù)據(jù)庫(traditional Chinese medicine integrated database，TCMID，http://119.3.41.228:8000/tcmid/search)檢索麝香通心滴丸主要成分：麝香、牛黃、人參葉、丹參、熊膽、冰片、蟾酥。將化合物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)閾值設(shè)為≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)閾值設(shè)為≥0.18篩選有效成分，并使用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得這些化合物對應(yīng)的靶點。

1.2 疾病靶點收集 以“heart failure”為關(guān)鍵詞檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)，收集與心力衰竭相關(guān)的作用靶點。

1.3 篩選靶點并構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò) 將所篩選出的藥物成分對應(yīng)靶點與心力衰竭相關(guān)的全部靶點進行交集，輸入Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)，以明確疾病靶點與藥物靶點之間的關(guān)系。使用Cytoscape構(gòu)建的化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中，每個節(jié)點代表基因或分子，節(jié)點之間的連接代表這些生物分子與基因之間存在相互作用，節(jié)點的度值代表節(jié)點與節(jié)點相連的數(shù)目。

1.4 構(gòu)建蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò) 為進一步探究靶點之間的相互作用，將交集所得的共同靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(Version 11.0，https://www.string-db.org/)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。物種選擇為Homo sapiens，其余參數(shù)保持默認設(shè)置，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 分析潛在的生物過程與通路 利用R Project軟件及Bioconductor數(shù)據(jù)庫的org.Hs.eg.db程序包將共同靶點的基因symbols轉(zhuǎn)變?yōu)镋ntrez IDs，隨后利用ClusterProfiler程序包對網(wǎng)絡(luò)進行基因本體(gene ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析，以尋找潛在的生物過程與通路。設(shè)定P<0.05，并按照涉及靶點數(shù)目降序排序，獲取GO富集分析中分子功能(molecular function，MF)、細胞組成(cellular component，CC)和生物過程(biological process，BP)的前10個條目以及KEGG富集的前20條信號通路。

2 結(jié) 果

2.1 藥物有效成分篩選結(jié)果 通過TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫檢索到麝香、牛黃、人參葉、丹參、熊膽、冰片、蟾酥中的化合物共547個，其中麝香59個，牛黃19個，人參葉126個，丹參202個，熊膽28個，冰片32個，蟾酥81個。

以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)篩選出化合物92個，其中麝香5個，牛黃5個，人參葉9個，丹參65個，熊膽1個，冰片3個，蟾酥6個，其中膽固醇為麝香、蟾酥的共有成分，去氧膽酸為熊膽、牛黃共有成分。部分化合物情況見表1。

表1 麝香通心滴丸部分活性成分

(續(xù)表)

2.2 共同靶點篩選結(jié)果 通過檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫，得到與心力衰竭相關(guān)的作用靶點13 194個。使用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索藥物中各有效成分對應(yīng)的所有靶點，經(jīng)去重共得到靶點154個。將以上靶點進行交集，合并后得到靶點140個，對應(yīng)的藥物有效成分78個。2.3 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖(見圖1)。該網(wǎng)絡(luò)包含78個化合物節(jié)點、140個靶點節(jié)點和1 075條邊，其中紅色節(jié)點表示來自丹參的化合物，粉色節(jié)點表示來自蟾酥的化合物，紫色節(jié)點表示來自牛黃的化合物，深綠色節(jié)點表示來自麝香的化合物，藍色節(jié)點表示來自人參葉的化合物，黃色節(jié)點為多種藥物共有的化合物，綠色節(jié)點表示靶點。

圖1 麝香通心滴丸主要成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)性質(zhì)可知，化合物或藥物靶點擁有的節(jié)點越多，在整個網(wǎng)絡(luò)中所起到的作用就越關(guān)鍵，因此，本研究篩選節(jié)點度較大的節(jié)點進行分析。化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中的部分關(guān)鍵節(jié)點及其拓撲學(xué)性質(zhì)見表2。

表2 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中的部分關(guān)鍵節(jié)點及其拓撲學(xué)性質(zhì)

通過分析化合物節(jié)點度值，可見排名前5位的化合物分別為槲皮素、木犀草素、山奈酚、丹參酮-ⅡA、鼠尾草酚酮，他們分別能與68個、54個、42個、39個、37個靶點蛋白發(fā)生作用，其化學(xué)結(jié)構(gòu)圖詳見圖2。觀察靶點度值可見，排名前5位的靶點有前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)、核受體共激活因子1(nuclear receptor coactivator 1，NCOA1)、電壓門控鈉通道5α亞基(sodium voltage-gated channel alpha subunit 5，SCN5A)、β2腎上腺素能受體(adrenoceptor beta 2，ADRB2)、核受體共激活因子2(nuclear receptor coactivator 1，NCOA2)，他們分別能與55個、35個、31個、31個和31個化合物發(fā)生相互作用，這一結(jié)果體現(xiàn)了中藥多靶點的特性。

圖2 化合物節(jié)點度值前5位化合物結(jié)構(gòu)圖(A：槲皮素；B：木犀草素；C：山奈酚；D：丹參酮-ⅡA；E：鼠尾草酚酮)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，并采用Cytoscape 3.6.0軟件可視化(見圖3)，其中線段顏色越深代表其互作評分越高。PPI網(wǎng)絡(luò)圖中包含139個節(jié)點、1 905條邊，同時得到網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵靶點的頻次。根據(jù)“度值>均值”篩選出關(guān)鍵節(jié)點19個， 包括：AKT1、CASP3、AR、EGFR、BCL2L1、CCND1、APP、FOS、CASP8、ERBB2、IL6、CASP9、ESR1、EDN1、ACHE、JUN、MAPK1、CCNB1、CDK4。度值最高的是AKT1，度值為82；其次為CASP3，度值為55；AR、EGFR度值均為47；BCL2L1度值為45。度值大的靶點通常在網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，很可能是麝香通心滴丸治療心力衰竭的關(guān)鍵靶點。

圖3 麝香通心滴丸靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO富集分析與KEGG富集分析 GO 富集分析結(jié)果(見圖4)中，生物過程主要包括細胞對藥物的反應(yīng)(cellular response to drug)、循環(huán)系統(tǒng)血管過程(vascular process in circulatory system)、對類固醇激素的反應(yīng)(response to steroid hormone)、管徑的調(diào)節(jié)(regulation of tube diameter)、血管直徑的調(diào)節(jié)(regulation of blood vessel diameter)等；分子功能主要包括神經(jīng)遞質(zhì)受體活性(neurotransmitter receptor activity)、G蛋白偶聯(lián)氨受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性(postsynaptic neurotransmitter receptor activity)、腎上腺素能受體活性(adrenergic receptor activity)等，參與了細胞中膜筏(membrane raft)、膜微結(jié)構(gòu)域(membrane microdomain)、膜區(qū)(membrane region)、突觸后膜(postsynaptic membrane)等區(qū)域組成。KEGG富集信號通路(見圖5、圖6)主要包括：神經(jīng)活動配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、人巨細胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)等。

圖4 麝香通心滴丸治療心力衰竭的GO富集分析

圖5 麝香通心滴丸治療心力衰竭的KEGG富集分析柱狀圖

圖6 麝香通心滴丸治療心力衰竭的KEGG富集分析氣泡圖

3 討 論

經(jīng)過篩選，可見麝香通心滴丸主要活性物質(zhì)包括槲皮素、木犀草素、山奈酚、丹參酮-ⅡA、鼠尾草酚酮等。槲皮素、山奈酚主要來源于人參葉，木犀草、丹參酮-ⅡA、鼠尾草酚酮主要來源于丹參等。先前一些研究發(fā)現(xiàn)，人參的主要成分人參莖葉總皂苷能夠通過清除體內(nèi)自由基和抗氧化的作用，減輕缺血心肌的再灌注損傷，進一步改善心肌功能[13]；丹參具有活血化瘀、抗凝、擴血管、改善微循環(huán)、通脈養(yǎng)血等作用，并能夠防止和減輕缺氧心肌超微結(jié)構(gòu)的變化，對缺氧心肌有保護作用，還可改變血液流變學(xué)性質(zhì)，降低血液黏稠度，并能增加心肌收縮力，使心排血量增加，擴張血管，同時使腎動脈血流量增加，尿量增多，從而減輕心臟前后負荷，發(fā)揮良好的抗心力衰竭作用[14-15]。此外，麝香通心滴丸中的其他成分，如麝香能夠改善血管內(nèi)皮細胞功能，促進受損心肌細胞代謝水平恢復(fù)，拮抗腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活，延緩心室重構(gòu)進程[16]；蟾酥在抗炎、增強心肌收縮力、擴張冠狀動脈等方面也具有一定的作用[17]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為心臟能量代謝障礙、心肌纖維化、心室重構(gòu)及神經(jīng)內(nèi)分泌因子改變等是促進心力衰竭的重要因素[18]。麝香通心滴丸具有芳香益氣通脈、活血化瘀止痛之功效，通過GO富集分析，可見麝香通心滴丸治療心力衰竭的主要過程有調(diào)節(jié)血管直徑、改變激素作用、改善代謝等。通過KEGG富集分析可見其涉及的主要通路有神經(jīng)活動配體-受體相互作用、PI3K-Akt信號通路、人巨細胞病毒感染通路等。

神經(jīng)活動配體-受體相互作用通路是神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如抑郁、焦慮、帕金森病中起重要作用的通路[19-20]。神經(jīng)活性類固醇是神經(jīng)組織中具有活性的類固醇，可通過與細胞內(nèi)受體結(jié)合而實現(xiàn)其基因作用，增強或抑制神經(jīng)元的活性[21]。有研究發(fā)現(xiàn)該通路在心臟疾病中也起作用，Wang等[22]發(fā)現(xiàn)在冠狀動脈搭橋手術(shù)中，應(yīng)用七氟醚可通過調(diào)節(jié)該途徑影響γ-氨基丁酸(GABA)受體，實現(xiàn)對心臟的保護作用；Bai等[23]應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)-代謝組學(xué)綜合分析方法分析心肌梗死SD大鼠血液和左心組織，發(fā)現(xiàn)心肌梗死后心肌損傷與此通路密切相關(guān)，表明該通路在心臟損傷過程中也起重要作用。一些網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)使用芪參顆粒[24]、紅景天[25]等藥物治療心臟疾病時也涉及此通路，提示麝香通心滴丸治療心力衰竭時也可能通過此機制發(fā)揮作用。

PI3K/Akt通路可參與多種細胞功能調(diào)節(jié)，如細胞增殖、分化、凋亡、葡萄糖轉(zhuǎn)運等，也參與癌癥的發(fā)生進展，PI3K與生長因子受體[如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子受體-1(EGFR)、肝細胞生長因子(HGF)等]結(jié)合后，可改變Akt的蛋白結(jié)構(gòu)并使其活化，并以磷酸化作用激活或抑制下游一系列底物的活性，從而調(diào)節(jié)多種細胞功能[26]。近年來一些研究也發(fā)現(xiàn)，該通路在心血管系統(tǒng)中也起重要作用，Vega等[27]證明PI3K/Akt通路是心臟生理性生長最關(guān)鍵的分子機制，通過運動或基因?qū)用婕せ頟I3K，可產(chǎn)生心臟保護作用并直接對抗病理性心臟生長；Lv等[28]研究發(fā)現(xiàn)6-姜辣醇(6-Gingerol，6-G)可通過激活該通路并抑制凋亡改善心肌缺血再灌注損傷；Chen等[29]使用紅景天苷處理內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的大鼠體內(nèi)外心臟損傷模型，發(fā)現(xiàn)該藥物可通過抑制PI3K/Akt/mTOR途徑，對內(nèi)毒素大鼠產(chǎn)生心臟保護作用。以上研究提示PI3K/Akt通路也可能是麝香通心滴丸發(fā)揮心臟保護作用的重要途徑。

巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)是一種β-皰疹病毒，其感染可累及宿主機體各器官和系統(tǒng)，病變范圍可從輕微無癥狀感染直到嚴重缺陷或死亡[30]。CMV感染與冠心病密切相關(guān)。一項系統(tǒng)回顧研究表明，巨細胞病毒感染病人未來心血管疾病的相對風(fēng)險可增加22%，約13.4%的心血管疾病發(fā)病率可歸因于巨細胞病毒感染[31]；有研究發(fā)現(xiàn)CMV感染的內(nèi)皮細胞在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用：當(dāng)病毒在血管壁上傳播時，可觸發(fā)動脈粥樣硬化斑塊中免疫系統(tǒng)激活，并導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[32-33]。通過分析CMV感染的相關(guān)通路可見其對心臟疾病的發(fā)展起到重要作用，這也可能是麝香通心滴丸發(fā)揮治療作用的重要通路。

4 結(jié) 論

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析可見，麝香通心滴丸中的有效成分可能通過神經(jīng)活動配體-受體相互作用、PI3K/Akt信號通路、人巨細胞病毒感染等機制，對心力衰竭產(chǎn)生良好的治療作用，未來可通過基礎(chǔ)實驗研究進一步驗證。