稻田中dsRNA的殘留動(dòng)態(tài)模擬分析

彭月,張海南,韓召軍

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

RNA干擾(RNA interference,RNAi)已經(jīng)發(fā)展成為害蟲治理的新途徑和熱門研究領(lǐng)域。早期一般認(rèn)為,利用RNA干擾技術(shù)可以有效治理蟲害,不僅特異性強(qiáng),安全可靠,更為重要的是易于進(jìn)行抗性治理。因此相關(guān)的轉(zhuǎn)基因植物和dsRNA噴霧劑的研究蓬勃發(fā)展,目前,基于RNAi的轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)商品化應(yīng)用[1]。但基于RNAi的害蟲防治仍存在不少限制因素,如多種重要農(nóng)業(yè)害蟲對(duì)RNAi不敏感,很難研發(fā)有競爭力的dsRNA農(nóng)藥;dsRNA普遍存在脫靶效應(yīng)[2-3],使人們意識(shí)到dsRNA田間釋放可能會(huì)帶來生態(tài)安全風(fēng)險(xiǎn)。隨著研究的深入,人們已經(jīng)意識(shí)到,要推廣應(yīng)用RNAi害蟲防控技術(shù),就必須開發(fā)有效dsRNA和高效施用技術(shù),研究dsRNA的環(huán)境殘留、對(duì)非靶標(biāo)生物的毒性和環(huán)境歸宿等問題[4]。

dsRNA在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性直接影響施用效果和環(huán)境殘留。目前已有研究發(fā)現(xiàn),dsRNA農(nóng)藥在野外水土環(huán)境中很容易降解。裸露的外源dsRNA由于顆粒吸附和核酸酶降解的共同作用,在土壤中衰減迅速,半衰期一般為15～28 h,在32～48 h檢測不到[5-8]。不同濃度、不同序列長度、不同結(jié)構(gòu)(發(fā)夾和線形)dsRNA的降解動(dòng)力學(xué)沒有明顯變化[5-6]。在水生系統(tǒng)中,已有的研究也證實(shí)dsRNA不會(huì)持續(xù)存在,半衰期不到3 d,在4 d后低于檢測限[5-6,9-10]。雖然離體植物組織不會(huì)賦予核酸任何可測量的保護(hù)[11],但農(nóng)田施用dsRNA可以通過植物根系、葉片等器官進(jìn)入植物體內(nèi),且在全株傳遞[12-17]。關(guān)于莖葉處理dsRNA的穩(wěn)定性問題,目前研究較少,不過有報(bào)道顯示,dsRNA在植物上的殘留可能與水土環(huán)境不同。在溫室葉面噴施dsRNA,可以維持對(duì)馬鈴薯甲蟲的抗蟲效果至少4周[18];利用溶液進(jìn)行一次性澆灌,也能在柑橘植株體內(nèi)維持可測定的dsRNA濃度達(dá)7周[19]。然而田間應(yīng)用dsRNA對(duì)大豆進(jìn)行莖葉處理,葉面上施用的dsRNA濃度隨時(shí)間迅速減少,處理3 d后減少約95%[20]。用細(xì)菌表達(dá)的dsRNA噴施本氏煙或玉米植株時(shí),有效期僅有5 d[21-22]。由此可以看出,目前不同研究的結(jié)果差異較大,可能是測試指標(biāo)和環(huán)境因素不同所致,也可能因處理植物而異,這表明田間dsRNA的穩(wěn)定性需要進(jìn)一步研究。

水稻是我國的主要糧食作物,也是繼棉花之后抗藥性害蟲發(fā)生最為嚴(yán)重、用藥最多的作物。為了減少農(nóng)藥用量并進(jìn)行抗藥性治理,水稻害蟲的非化學(xué)防治得到了廣泛研究,包括基于RNAi的防控技術(shù),目前已報(bào)道了多個(gè)表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因水稻[23-26]。因此,本研究選用稻田生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行研究,通過分析dsRNA在稻田水中、水稻葉片和植株內(nèi)的殘留動(dòng)態(tài),弄清dsRNA的環(huán)境殘留,澄清大田應(yīng)用dsRNA農(nóng)藥的風(fēng)險(xiǎn)度,為風(fēng)險(xiǎn)管控以及設(shè)計(jì)合理的dsRNA施用技術(shù)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

為節(jié)省dsRNA用量(ng級(jí)),并避免可能的污染,利用培養(yǎng)箱模擬稻田,采用野外采樣結(jié)合室內(nèi)試驗(yàn)檢測的方法。稻田土壤及水樣采集于江蘇省南京市江寧區(qū)章村連年耕種水稻的農(nóng)田(118.862°E,31.979°N),采回的樣品放置在塑料培養(yǎng)箱(56 cm×41 cm×26 cm)內(nèi),土層為(18±1)cm,水層為(5±1)cm,模擬田間種植水稻,露天放置。水稻品種為‘南粳5055號(hào)’。

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備

dsRNA 體外合成試劑盒T7 RiboMAX system,美國Promega公司;GS201瓊脂糖,北京全式金生物科技有限公司;核酸染料溴化乙錠(EB),北京索萊寶科技有限公司;PCR 預(yù)混液 2×TaqMaster Mix DNA,南京諾唯贊生物科技有限公司;PCR引物合成和測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成;其他常規(guī)生化試劑為國產(chǎn)AR級(jí)或進(jìn)口分裝AR級(jí)產(chǎn)品。凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc2000和PCR 儀T100TMThermal cycler PCR,美國Bio-Rad公司;分光光度計(jì)ND-1000 spectrophotometer,美國Thermo Fisher Scientific公司;水平式核酸電泳儀,北京市六一儀器廠。

1.3 dsRNA的制備

為了試驗(yàn)的安全性和避免同源基因的干擾,利用大陸生物不具備的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因EGFP合成特異性dsRNA。該基因由NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索獲得,登錄號(hào)DQ389577.1。合成dsRNA使用的T7 DNA引物序列:EGFP-404-T7-F:5′-TAATACGACTCACTATAGGGTACGGCAAGCTGACCCTGAAGT-3′,EGFP-404-T7-R:5′-TAATACGACTCACTATAGGGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCT-3′(T7啟動(dòng)子序列用下劃線進(jìn)行標(biāo)注)。利用dsRNA 體外合成試劑盒合成特異性dsRNA(dsEGFP)。將純化的dsRNA溶于不含核酸酶的水中,-80 ℃保存?zhèn)溆?。采?5 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,檢查dsRNA純度;使用分光光度計(jì)測量dsRNA濃度,并在使用前按需要進(jìn)行調(diào)整。

1.4 痕量dsRNA簡易定量分析

利用TaqDNA 聚合酶直接從dsRNA模板中擴(kuò)增靶序列的方法[27],以及采用外參照式PCR進(jìn)行DNA定量的方法[28-29],使用Taq酶直接對(duì)dsRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物通過電泳掃描進(jìn)行定量。本研究所用的dsRNA即為定量的標(biāo)準(zhǔn)品模板,其擴(kuò)增引物:DsEGFP-216-F:5′-GTGACCACCCTGACCTACG-3′,DsEGFP-216-R:5′-CTCCTTGAAGTCGATGCCCTT-3′。通過預(yù)試驗(yàn)確定PCR體系:2×TaqMaster Mix 12.5 μL,模板 1 μL,上下游引物各1 μL,無菌去離子水加至25 μL。擴(kuò)增條件:95 ℃ 3 min,95 ℃ 30 s,57.1 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s;28個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸5 min。配制系列已知含量標(biāo)準(zhǔn)品模板樣品和待測樣品,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物也用同一塊15 g·L-1瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,溴化乙錠染色觀察,凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄,采用ImageJ軟件對(duì)目標(biāo)條帶灰度進(jìn)行計(jì)算,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品模板量與對(duì)應(yīng)目標(biāo)條帶的灰度值作標(biāo)準(zhǔn)曲線,在線性范圍內(nèi)擬合回歸方程。待測樣品依據(jù)其目標(biāo)條帶的灰度值,用此方程計(jì)算其中的模板dsRNA含量。

1.5 稻株點(diǎn)滴處理后的dsRNA殘留試驗(yàn)

1.5.1 方法取健壯且長勢(shì)一致的水稻幼苗,以無土栽培方式種植在鋪有海綿的不透明塑料杯(25 mL)中,1杯種植1株,用營養(yǎng)液水培(營養(yǎng)液參照國際水稻研究所的配方),每3 d更換1次營養(yǎng)液。植物在溫室培養(yǎng),相對(duì)濕度70%～85%,溫度(26±1)℃,光/暗時(shí)間為16 h/8 h。定期觀察,剔除病株、弱株,保留健株備用。待水稻長至3葉1心期,取1 500 pg·μL-1dsRNA溶液(內(nèi)含0.01% swilet 408)2 μL點(diǎn)滴在水稻植株第3片完全葉中部,自然晾干,正常水培觀察。

1.5.2 dsRNA在葉面上的殘留動(dòng)態(tài)測定分別于點(diǎn)滴處理后0(晾干后即取樣)、3、6、9 、12、15、20、25、30、35和40 d剪下處理葉片,放入含0.01% swilet 408的200 μL無核酸酶水中,浸泡1 min后,搖床振蕩 5 min,取2 μL洗脫液作為模板樣品進(jìn)行定量分析,觀察dsRNA在葉片上的殘留量變化。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)取樣3次,檢測的平均值×100即為每個(gè)葉片上殘留dsRNA 的量(pg)。

1.5.3 水稻植株內(nèi)的dsRNA含量檢測將上述每次洗脫處理后的葉片及剩余植株用去離子水沖洗 1 min,用吸水紙擦干水分,液氮冷凍,提取總RNA,檢測dsRNA量,驗(yàn)證dsRNA是否被水稻葉片吸收。為了進(jìn)一步弄清dsRNA被植物葉片吸收后的體內(nèi)傳導(dǎo)狀況,按1.5.1方法對(duì)3葉1心期水稻幼苗點(diǎn)滴處理,12 d 后沿根基部剪取須根、老葉(第2片)、新葉(第4片)和處理葉(第3片),按照上述方法洗脫、清洗后,將3株稻苗的相同部位一起剪碎,稱取(25±1)mg作為1個(gè)重復(fù),每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。不同樣品分別提取總RNA(可放于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)暫時(shí)保存),定量檢測其中的dsRNA含量(pg·mg-1)。

1.6 稻田水中dsRNA的降解試驗(yàn)

1.6.1 方法采用模擬稻田插管試驗(yàn),將長12 cm、內(nèi)徑10 mm的無底透明亞克力管垂直插入模擬稻田培養(yǎng)箱內(nèi),入土深度5 cm,水層深度5 cm。在管中添加dsRNA,使水層中dsRNA質(zhì)量濃度約為30 pg·μL-1,輕輕擾動(dòng)混勻,置溫室內(nèi)(溫、濕、光同上)定期取樣檢測,每次取樣50 μL(稻田水原位樣)。試驗(yàn)共設(shè)3組(3只培養(yǎng)箱),每組2個(gè)重復(fù)(2只插管)。

1.6.2 稻田水不同處理樣品的制備為了弄清稻田水不同組分對(duì)dsRNA衰減速度的影響,取稻田水處理后獲得如下樣品:a)稻田水原樣,在稻田表面用隨機(jī)取樣法取稻田表層水100 mL;b)稻田水濾樣,取a樣用定性濾紙過濾2遍,去除水中浮游生物(藻類、枝角類、橈足類和輪蟲等)和漂浮固體顆粒物;c)稻田水滅活樣,取b樣用0.2 μm針頭過濾器過濾,放入15 mL離心管中,121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。在水樣中加入蛋白酶K至最終濃度為50 μg·mL-1,58 ℃孵育2 h,再次高壓蒸汽滅菌,程序同前,使水中微生物、蛋白酶類物質(zhì)失活。d)純水,商品RNase-Free去離子水。

1.6.3 dsRNA的降解測定取1.6.2節(jié)的水樣,配制成30 pg·μL-1dsRNA溶液,置溫室內(nèi)(溫、濕、光同上)靜置,定時(shí)取樣檢測dsRNA含量變化,每個(gè)處理均重復(fù)3次。取稻田水原樣(a)和濾樣(b)各配制 10 mL,分別放入15 mL離心管中,每次每管取樣1 μL,技術(shù)重復(fù)2次。為防止污染,用稻田水滅活樣(c)和純水(d)溶解dsRNA,配制成30 pg·μL-1dsRNA溶液后,放入0.2 mL無核酸酶的PCR管中,每管 50 μL,用封口膜密封后靜置,定時(shí)取樣測定dsRNA濃度,每次取樣3管。

取樣時(shí)間:0(dsRNA溶液配制后即取樣)、1、2、4、8、12、24 h和2、3、8、13、18、23和28 d,當(dāng)檢測結(jié)果呈陰性后,即終止取樣。不同時(shí)間取樣后必須即時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物可以暫存于-80 ℃冰箱,與隨后樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物一同進(jìn)行電泳檢測。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

技術(shù)重復(fù)數(shù)據(jù)取平均值,生物學(xué)重復(fù)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用ImageJ軟件計(jì)算條帶灰度,用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和線性回歸擬合。利用GraphPad Prism 8.0軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 痕量dsRNA簡易定量分析方法的測試

依據(jù)預(yù)試驗(yàn)設(shè)置的PCR體系和條件,3倍稀釋配制系列濃度模板溶液(300、100、33.3、11.1、3.7、1.2、0.4和0.1 pg·μL-1),利用Taq酶直接對(duì)dsRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并通過產(chǎn)物的電泳掃描進(jìn)行定量,以檢測該方法的可行性。結(jié)果如圖1所示,PCR目標(biāo)產(chǎn)物條帶清晰,無雜帶,當(dāng)模板的量為1.2～33.3 pg時(shí),不僅肉眼可見PCR產(chǎn)物條帶差異(圖1-A),且條帶掃描灰度值與起始模板量呈線性相關(guān)(圖1-B),擬合的回歸方程表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系:y=0.006x+0.008(R2=0.992,P<0.05)。

圖1 痕量dsRNA簡易定量分析方法的測試結(jié)果Fig.1 Test results of quantitative analysis method for trace dsRNA A. 不同dsRNA模板含量的PCR產(chǎn)物電泳圖(M泳道. 2 kb DNA marker;泳道1～3模板量為300 pg,泳道4～6模板量為100 pg,泳道7～9模板量33.3 pg,泳道10～12模板量為11.1 pg,泳道13～15模板量為3.7 pg,泳道16～18模板量為1.2 pg,泳道19～21模板量為0.4 pg,泳道22～24模板量為0.1 pg)；B. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳目標(biāo)條帶灰度值與其模板dsRNA含量的相關(guān)關(guān)系圖(n=3)。A. The electrophoresis graph of the PCR products with different dsRNA template quantity(M lane. 2 kb DNA marker;lanes 1-3 are the product duplicated from 300 pg template dsRNA;lanes 4-6:100 pg;lanes 7-9:33.3 pg;lanes 10-12:11.1 pg;lanes 13-15:3.7 pg;lanes 16-18:1.2 pg;lanes 19-21:0.4 pg;lanes 22-24:0.1 pg);B. Diagram show the relations between dsRNA template quantity and Grayscales of the corresponding PCR products(n=3).

2.2 水稻植株dsRNA的殘留動(dòng)態(tài)

在水稻苗葉面點(diǎn)滴2 μL含3 000 pg的dsRNA,定時(shí)檢測水稻葉片上dsRNA的殘留動(dòng)態(tài),統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示(圖2-A):處理前期葉片上的dsRNA衰減較快,之后衰減變緩,基本符合指數(shù)衰減曲線(R2=0.716),半衰期為16 d,在40 d時(shí)仍能檢測到殘留dsRNA(為點(diǎn)滴量的20.6%)。將洗脫后的葉片和處理植株其他部分合并提取,檢測植株內(nèi)的dsRNA含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉片點(diǎn)滴處理后,植株內(nèi)的dsRNA含量逐漸上升,到 12 d 達(dá)到最高峰,為點(diǎn)滴處理量的20%,隨后又緩慢下降(圖2-B)。后期的下降表明植株吸收進(jìn)入體內(nèi)的dsRNA也逐步衰減消失。

將葉片表面殘留的dsRNA與植株內(nèi)吸收的dsRNA合并(圖2-C),從處理后0 h水稻植株內(nèi)外的dsRNA總量可以看出,點(diǎn)滴回收率為86.6%,總回收量隨時(shí)間延長逐步減少(半衰期為27 d),表明dsRNA施于水稻葉片后,會(huì)慢慢衰減消失。另外,圖2-C還顯示,雖然處理后40 d內(nèi),植株表面殘留量一直大于植株內(nèi)的含量,但植株表面dsRNA衰減的速度大于體內(nèi)的衰減速度。

從圖2-D可見,不同部位均有dsRNA存在,處理葉與根的含量無顯著差異,新葉的含量顯著低于其他部位的含量,可能與新葉組織生長快的稀釋作用有關(guān),而老葉中的含量最多,顯著高于其他部位,可能與組織老化、代謝下降有關(guān)。表明點(diǎn)滴在葉片表面的dsRNA會(huì)被吸收進(jìn)植株體內(nèi),并進(jìn)行系統(tǒng)性全株傳導(dǎo)。

圖2 點(diǎn)滴處理后水稻植株內(nèi)外dsRNA的殘留動(dòng)態(tài)Fig.2 Dynamics of residue dsRNA inside and outside of rice plants after topical treatment A. 水稻表面dsRNA的殘留動(dòng)態(tài);B. 水稻體內(nèi)dsRNA含量的動(dòng)態(tài)變化;C. 水稻植株內(nèi)外dsRNA總量的動(dòng)態(tài)變化;D. 處理12 d后每株水稻不同部位dsRNA的分布。不同字母表示在0.05水平差異顯著。A. Residue dynamics of dsRNA on the surface of rice plants;B. Content dynamics of dsRNA in rice plants;C. Dynamics of the total dsRNA amount on and in rice plants;D. Distribution of dsRNA in different parts of rice plants in 12 days after treatment. Different letters indicate the significant difference at 0.05 level.

2.3 稻田水中dsRNA的殘留動(dòng)態(tài)及影響因子分析

從圖3可以看出,在插管處理的稻田原位樣水中,dsRNA的半衰期在1 h內(nèi),24 h后就無法檢測到(低于1 pg·μL-1)。采集后未處理的稻田水原樣以及經(jīng)濾紙過濾后的稻田水濾樣中,dsRNA的衰減速度差異不大,半衰期均為15 h左右,且72 h后無法檢測到。而dsRNA在去除微生物和蛋白質(zhì)的稻田水滅活樣中,與在無核酸酶去離子水中類似,均相對(duì)穩(wěn)定,處理3 d后每5 d取一次樣進(jìn)行檢測,到28 d未發(fā)現(xiàn)有降解趨勢(shì)。表明稻田水中的微生物和蛋白因子是加速dsRNA衰減的關(guān)鍵因子,底泥有一定的促進(jìn)消減作用,而浮游生物、漂浮固體顆粒物和離子沒有明顯的直接作用。

圖3 不同處理稻田水中的dsRNA殘留動(dòng)態(tài)Fig.3 Residue dynamics of dsRNA in paddy field water of different treatments

3 討論

本研究借鑒已有的dsRNA擴(kuò)增技術(shù)和DNA電泳掃描定量技術(shù)[27-30],利用Taq酶既具有反轉(zhuǎn)錄酶活性又具有DNA聚合酶活性的特點(diǎn),直接以dsRNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物通過凝膠電泳進(jìn)行掃描定量,不僅省去了靶序列的反轉(zhuǎn)錄步驟,同樣節(jié)省了痕量dsRNA常規(guī)定量PCR檢測的昂貴試劑費(fèi)用。但與定量PCR檢測相比,電泳掃描定量的誤差較大。通過設(shè)置多個(gè)技術(shù)重復(fù)以消除PCR的重復(fù)誤差,并通過同時(shí)在同一塊膠上電泳測試樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品,來減小凝膠和染色對(duì)灰度的影響,由此將誤差控制在不影響殘留監(jiān)測的范圍內(nèi)。利用系列含量的標(biāo)準(zhǔn)品模板測試后發(fā)現(xiàn),這種簡化后的dsRNA定量方法的特異性和靈敏度均較高,模板dsRNA量與PCR產(chǎn)物條帶的灰度值在較大范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。本研究選擇循環(huán)數(shù)為28進(jìn)行擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)dsRNA模板量在1.2～33.3 pg時(shí),PCR產(chǎn)物條帶灰度值與模板dsRNA含量呈良好的線性相關(guān)(R2=0.992)。故可以檢測到1.2～33.3 pg的dsRNA樣品,靈敏度(1.2 pg)相當(dāng)于近期常用的最靈敏的痕量dsRNA定量PCR檢測方法和熒光定量檢測方法[6,8,31-33],可以用于dsRNA的田間殘留監(jiān)測。對(duì)dsRNA在水稻植株內(nèi)外以及不同水樣中殘留進(jìn)行測定,雖然每個(gè)監(jiān)測點(diǎn)的數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)誤稍大,但隨時(shí)間變化的動(dòng)態(tài)趨勢(shì)完全符合化合物的殘留規(guī)律,驗(yàn)證了該方法的有效性。

dsRNA在水稻葉表面的半衰期達(dá)16 d。葉表面消失的dsRNA部分被水稻植株吸收,并在體內(nèi)系統(tǒng)傳導(dǎo)。點(diǎn)滴處理后水稻體內(nèi)dsRNA含量升高,涉及葉片的吸收以及可能存在的體內(nèi)復(fù)制(植物體內(nèi)具有核酸依賴性核酸合成酶),而隨著體外dsRNA的衰減,吸收的量逐步下降,同時(shí)dsRNA在體內(nèi)也會(huì)被核酸酶切割降解,故點(diǎn)滴處理后一定時(shí)間植株體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)含量高峰。而高峰出現(xiàn)的時(shí)間主要與處理劑量、吸收速度、體內(nèi)降解和可能的體內(nèi)合成有關(guān)。點(diǎn)滴處理后水稻植株內(nèi)外的總dsRNA半衰期為27 d,表現(xiàn)出一定的穩(wěn)定性。這與在其他作物上的試驗(yàn)結(jié)果基本一致,如已有報(bào)道顯示,在大麥上噴霧施用綠色熒光染料(ATTO 488)標(biāo)記的dsRNA,在木質(zhì)部、質(zhì)外體、韌皮部薄壁細(xì)胞、伴隨細(xì)胞和葉肉細(xì)胞的共質(zhì)體等內(nèi)均檢測到綠色熒光信號(hào),并且禾谷鐮刀菌在局部和遠(yuǎn)端未噴霧葉片中的生長均受到抑制[34];在葉片上涂抹馬鈴薯甲蟲(CPB)肌動(dòng)蛋白dsRNA可以使馬鈴薯植株免受CPB幼蟲侵害至少4周[18];柑橘樹通過根部和韌皮部注射吸收的dsRNA至少可以在柑橘中穩(wěn)定保存57 d[19]。

必須指出,本研究為了節(jié)省有限的dsRNA材料,沒能進(jìn)行大田噴霧實(shí)驗(yàn)。葉片點(diǎn)滴與田間噴霧相比仍有明顯不同,田間噴霧時(shí)水稻植株不同部位均會(huì)暴露,另外用藥的濃度通常也是可變的。雖然有研究證實(shí),不同濃度、不同序列長度、不同結(jié)構(gòu)(發(fā)夾和線形)dsRNA的降解動(dòng)力學(xué)沒有明顯差異[5-6],但水稻葉片上dsRNA的衰減涉及植物的吸收,而植物體內(nèi)還存在核酸依賴性核酸合成酶,甚至還可能存在dsRNA的合成。另外,大田與溫室的明顯差異就是隨時(shí)面臨雨水沖刷。本研究發(fā)現(xiàn)葉面處理后,大量dsRNA長時(shí)間殘留葉面上,而水溶性的dsRNA很容易隨雨水沖刷進(jìn)入稻田水中,從而使植株內(nèi)外的殘留半衰期明顯縮短,這也可能是田間莖葉噴霧處理對(duì)害蟲防效期短的重要原因。因此,本研究雖然揭示了dsRNA在稻田殘留的動(dòng)態(tài)趨勢(shì),但確切的殘留參數(shù)仍有待利用dsRNA農(nóng)藥進(jìn)行田間試驗(yàn)進(jìn)一步研究,而dsRNA的高效應(yīng)用,必須考慮劑型的防沖刷流失和輔助吸收問題。

dsRNA在稻田水中的半衰期不到1 h。排除底泥的影響,采集稻田表層水進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)半衰期延長至15 h;過濾去除浮游生物和漂浮固態(tài)顆粒物(量較少)對(duì)稻田水中dsRNA的衰減沒有明顯影響;而dsRNA在滅活并去除微生物和蛋白質(zhì)的稻田表層水中非常穩(wěn)定,28 d無衰減趨勢(shì)。底泥的影響可能源自吸附作用,已有研究證實(shí)土壤顆粒物對(duì)核酸具有吸附作用[8]。而蛋白因子和微生物促使dsRNA快速衰減的實(shí)質(zhì)可能是核酸酶的降解,因?yàn)榭梢越到鈊sRNA的非專一性核酸酶分布廣泛,它們由不同生物合成后分泌或遺存在環(huán)境中[35],而稻田水環(huán)境生物豐富,且水體不易使核酸酶變性。dsRNA在河流湖泊水的水環(huán)境中也迅速降解,半衰期為15～28 h,在96 h內(nèi)無法檢測到[5,9-10]。

綜上所述,稻田施用dsRNA,在沒有雨水沖刷的情況下可以在植株內(nèi)外殘留較長時(shí)間,一旦進(jìn)入稻田水中則會(huì)快速降解并消失。結(jié)合之前的研究報(bào)道,表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因植株也無法給體內(nèi)的dsRNA提供庇護(hù)作用,表達(dá)dsDvSnf7的玉米組織浸泡在含有沉淀物和水的微環(huán)境中時(shí),dsDvSnf7 也會(huì)迅速消散,3 d后無法在組織中檢測到[11],我們認(rèn)為,dsRNA在稻田中施用污染環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)較小,但要提高dsRNA農(nóng)藥的防效,延長其有效防治期,就必須考慮劑型的防雨水沖刷,甚至增加植株對(duì)dsRNA的吸收,降低稻田水的降解作用等。