殼寡糖/ZnO/凹凸棒石復(fù)合劑對(duì)湖羊瘤胃微生物區(qū)系和瘤胃液代謝組學(xué)的影響

王新玲,李書杰,林紅,裴明財(cái),朱靖,韓兆玉

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院乳?？茖W(xué)研究所,江蘇 南京 210095)

反芻動(dòng)物的瘤胃中棲息著繁雜多樣的細(xì)菌、原蟲和厭氧真菌等,它們被統(tǒng)稱為瘤胃微生物。反芻動(dòng)物自身與瘤胃微生物之間存在著極其復(fù)雜的相互作用。一方面,宿主遺傳信息決定瘤胃微生物結(jié)構(gòu)并為其提供生存和繁衍的環(huán)境條件;而另一方面,瘤胃微生物又可以消化機(jī)體攝入的一些物質(zhì),保證反芻動(dòng)物個(gè)體獲取所需的營(yíng)養(yǎng)[1]。宿主的健康和胃腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持很大一部分原因得益于瘤胃微生物群落的穩(wěn)定性,也就意味著微生物群的紊亂會(huì)導(dǎo)致瘤胃代謝異常進(jìn)而誘發(fā)胃腸道疾病,如瘤胃酸中毒和腸道炎癥[2-3]。以往的研究表明,瘤胃中的某些微生物(如Prevotella和Ruminococcus等)與反芻動(dòng)物飼料的利用率有著很強(qiáng)的相關(guān)性[4-5]。飼料利用率的提高不但減少了動(dòng)物生產(chǎn)對(duì)環(huán)境的負(fù)面影響,而且大大提高了經(jīng)濟(jì)效益。因此,維持瘤胃微生物菌群穩(wěn)態(tài)是保障反芻動(dòng)物宿主健康和高效生產(chǎn)的關(guān)鍵。

凹凸棒石是一種具有棒晶形貌及孔道結(jié)構(gòu)的鎂鋁硅酸鹽礦物。凹凸棒石由于其優(yōu)異的吸附能力被作為一種飼料添加物,其可吸附腸道致病菌、霉菌毒素等有毒有害物質(zhì),對(duì)動(dòng)物機(jī)體的腹瀉以及胃腸疾病的防治起到關(guān)鍵作用[6-8]。在養(yǎng)殖業(yè)抗生素濫用導(dǎo)致耐藥病原菌增多、腸道微生物多樣性降低、動(dòng)物免疫機(jī)能下降和藥物殘留等一系列安全問(wèn)題的背景下,凹凸棒石可作為一種安全、便捷的飼料抗生素替代品。2013年,凹凸棒石已被我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部納入飼料原料[9]。已有研究者對(duì)凹凸棒石進(jìn)行了大量改性研究,以進(jìn)一步優(yōu)化其抗菌性能,便于更好地應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)中[10]。常見改性方式有酸改性、熱改性和有機(jī)化改性等[10]。作為功能性飼料添加劑,凹凸棒石被廣泛應(yīng)用于豬、雞等單胃動(dòng)物飼料生產(chǎn)中。Zhang等[11]報(bào)道,日糧添加凹凸棒石(2 000 mg·kg-1)可以增加斷奶仔豬的腸道絨毛高度,提高腸道完整性和屏障功能。Chen等[12]發(fā)現(xiàn)在日糧中添加凹凸棒石能夠改善肉雞早期腸道免疫功能和增強(qiáng)抗氧化機(jī)能。我們先前的體外研究結(jié)果顯示,熱改性的凹凸棒石和載鋅凹凸棒石可以改善瘤胃微生物的發(fā)酵,提高細(xì)菌多樣性,促進(jìn)揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的形成和氮的利用[13-14]。然而,凹凸棒石在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的研究還鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)利用在凹凸棒石棒狀形貌表面擔(dān)載具有較強(qiáng)抗菌活性的ZnO和季銨化改性的殼寡糖,進(jìn)而制備得到一種安全、高效、廣譜和生物相容性好的殼寡糖/ZnO/凹凸棒石納米復(fù)合劑(又稱改性坡縷石modified palygorskite,MPal)[15]。先前研究結(jié)果已經(jīng)表明,飼糧中添加該復(fù)合劑有提高湖羊生長(zhǎng)性能和屠宰性能的趨勢(shì),并且能夠改善肉品質(zhì)[16]。在本試驗(yàn)中,以湖羊作為研究對(duì)象,在日糧中添加此復(fù)合劑(500 mg·kg-1),再結(jié)合16S高通量測(cè)序和代謝組學(xué),分析研究殼寡糖/ZnO/凹凸棒石復(fù)合劑對(duì)湖羊瘤胃微生物菌群組成和代謝產(chǎn)物的影響,旨在為養(yǎng)殖業(yè)提供高效、安全的飼料添加劑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用殼寡糖/ZnO/凹凸棒石復(fù)合劑從江蘇神力特生物科技股份有限公司獲得,是以天然凹凸棒石為原料,采用“表面改性—電荷—抗菌因子—組裝—表面交聯(lián)”的綜合工藝制備而成。該復(fù)合劑的主要成分:凹凸棒石73%、氧化鋅10%、月桂酸甘油酯8%、殼寡糖9%。

1.2 動(dòng)物飼養(yǎng)與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于江蘇省宿遷康喜肉羊養(yǎng)殖公司開展,選取48只60～70日齡的健康湖羊[(15±5)kg],隨機(jī)分為2組,每組24只,公母各半,6個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)4只。羊飼養(yǎng)在獨(dú)立的圍欄內(nèi),每天08:00和18:00喂養(yǎng)2次,自由飲水。其中對(duì)照組(Con)飼喂全混合配方顆粒料,復(fù)合劑組(MPal)于日糧中添加復(fù)合劑(500 mg·kg-1),預(yù)飼期7 d,正式試驗(yàn)期80 d。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取1只試驗(yàn)湖羊,即最終對(duì)照組與復(fù)合劑組各隨機(jī)選取6只湖羊(公母各半)屠宰采樣。湖羊飼喂日糧的具體成分見表1。

表1 湖羊全混合日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diet(dry matter basis)

1.3 樣品采集與制備

湖羊屠宰后,采集瘤胃液,用4層紗布過(guò)濾后于-80 ℃保存,用于后續(xù)微生物測(cè)序和代謝組學(xué)分析。

1.4 瘤胃液總菌DNA提取及Illumina MiSeq 16S rDNA微生物測(cè)序

利用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit(D4015,Omega,USA)按照說(shuō)明書進(jìn)行提取瘤胃液中基因組總DNA。

為了進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析,以瘤胃液DNA樣本為模板,通過(guò)應(yīng)用引物對(duì)343F(5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′)/798R(5′-AGGGTATCTAATCCT-3′)擴(kuò)增16SrRNA基因V3—V4區(qū)域。用凝膠電泳觀察擴(kuò)增子的質(zhì)量,經(jīng)純化后進(jìn)行另一輪PCR擴(kuò)增,然后進(jìn)行定量分析。后續(xù)高通量測(cè)序工作由上海歐易生物科技有限公司完成。

使用Trimmomatic軟件對(duì)原始雙端序列去雜,并采用滑窗法檢查平均堿基質(zhì)量,當(dāng)質(zhì)量低于20時(shí),截取前面高質(zhì)序列。去雜后的雙端序列利用FLASH軟件進(jìn)行拼接。拼接參數(shù):overlap最小為10 bp、最大為200 bp、最大錯(cuò)配率為20%。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性,可進(jìn)行精準(zhǔn)去雜,去除含有模糊堿基(ambiguous)、單堿基高重復(fù)區(qū)(homologous)的序列以及長(zhǎng)度過(guò)短的序列。精準(zhǔn)去雜參數(shù):去掉含有模糊堿基的序列,保留堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)(Q20)≥75%的序列。同時(shí)利用UCHIME檢測(cè)并去除序列中的嵌合體序列。測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理生成優(yōu)質(zhì)序列之后,采用Vsearch軟件分析序列的相似度,序列相似度大于或等于97%被歸為一個(gè)OTU單元(主操作分類單元)。使用QIIME軟件包挑選出各個(gè)OTU的代表序列,并將所有代表序列與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋。通過(guò)數(shù)據(jù)平臺(tái)網(wǎng)站(https://www.microbiomeanalyst.ca/)對(duì)微生物數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。

1.5 瘤胃液代謝組學(xué)分析

將10 μL溶于甲醇中的2-氯-L-苯丙氨酸(0.3 mg·mL-1)作為內(nèi)標(biāo)物和80 μL樣品共同加入1.5 mL離心管中,然后在冷凍干燥器中干燥。向每個(gè)樣品中加入240 μL甲醇/乙腈混合物,冰水浴超聲波處理 5 min,然后4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min。取上清液轉(zhuǎn)移到玻璃取樣瓶中,室溫真空干燥。在吡啶中添加80 μL 15 mg·mL-1甲氧基胺鹽酸鹽后渦旋2 min,37 ℃培養(yǎng)1.5 h。

瘤胃液的代謝物由上海鹿明生物技術(shù)有限公司采用GC/MS方法鑒定。樣品在安捷倫7890B氣相色譜系統(tǒng)和安捷倫5977A MSD系統(tǒng)(Agilent Technologies Inc.,USA)上進(jìn)行分析。采用DB-5MS熔融石英毛細(xì)管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm,Agilent J & W Scientific,USA)分離衍生物。氦氣(>99.999%)作為載氣,以1 mL·min-1的恒定流速通過(guò)色譜柱。注射器溫度260 ℃,柱溫箱最終溫度305 ℃。質(zhì)譜條件:電子轟擊離子源(EI),離子源溫度230 ℃,四級(jí)桿溫度150 ℃,電子能量70 eV。掃描方式為全掃描模式(SCAN),質(zhì)量(m/z)掃描范圍50～500。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

微生物數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析,使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析瘤胃液菌群多樣性指數(shù),使用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)微生物門、屬水平相對(duì)豐度的變化。利用PICRUSt軟件預(yù)測(cè)微生物的功能,通過(guò)iPath 3.0(https://pathways.embl.de)對(duì)預(yù)測(cè)的 KEGG orthology groups(KO)進(jìn)行匯總分析,并將預(yù)測(cè)的功能可視化地呈現(xiàn)于代謝通路中。代謝組學(xué)數(shù)據(jù)經(jīng)MetaboAnalyst 在線網(wǎng)站(https://www.metaboanalyst.ca/)進(jìn)行偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和差異代謝物篩選,以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05 和變量權(quán)重重要性排序(VIP)>1為篩選標(biāo)準(zhǔn)。Pearson相關(guān)性分析使用 Graphpad Prism 7.00(Graphpad Software,USA),分析0.05水平的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼寡糖/ZnO/凹凸棒石復(fù)合劑對(duì)湖羊瘤胃菌群豐富度和多樣性的影響

如圖1-A所示,與對(duì)照組(Con)湖羊相比,復(fù)合劑組(MPal)湖羊的豐富度指數(shù)Chao1、Ace和多樣性指數(shù)Shannon均顯著升高(P<0.05)。此外,主坐標(biāo)分析(PCoA)結(jié)果也顯示,對(duì)照組與復(fù)合劑組微生物菌群明顯分開(P<0.05)(圖1-B)。

圖1 復(fù)合劑對(duì)湖羊瘤胃細(xì)菌多樣性的影響(A)及主坐標(biāo)分析(B)Fig.1 Effects of MPal supplementation on the diversity of ruminal bacterial communities(A) and principle-coordinate analysis(B)Con:對(duì)照組 Control group;MPal:殼寡糖/ZnO/凹凸棒石復(fù)合劑組Modified palygorskite group. *P<0.05. 下同The same as follows.

2.2 殼寡糖/ZnO/凹凸棒石復(fù)合劑對(duì)湖羊瘤胃微生物門、屬水平相對(duì)豐度的影響

如圖2所示,在門水平上,擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)和軟壁菌門(Tenericutes)是瘤胃微生物的優(yōu)勢(shì)菌門,復(fù)合劑飼喂后,瘤胃中厚壁菌門和纖維桿菌門的相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05),擬桿菌門豐度有下調(diào)趨勢(shì)(P=0.065),而其他優(yōu)勢(shì)菌門均沒(méi)有發(fā)生變化。

圖2 MPal對(duì)湖羊瘤胃微生物門水平上的組成(A)和差異(B)影響Fig.2 Effects of MPal supplementation on the composition(A)and difference(B) of the bacterial phylum level in rumen of Hu sheep

在細(xì)菌聚類屬水平上,我們重點(diǎn)分析了豐度在前30的細(xì)菌屬(圖3)。其中,與對(duì)照組相比,復(fù)合劑組理研菌科RC9菌屬(Rikenellaceae RC9 gut group)、Ambiguoustaxa、纖維桿菌屬(Fibrobacter)、瘤胃球菌科UCG-002(Ruminococcaceae UCG-002)和瘤胃球菌科UCG-014(Ruminococcaceae UCG-014)的相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05);而普雷沃氏菌屬1(Prevotella1)、新月形單胞菌屬1(Selenomonas1)、普雷沃氏菌科YAB2003菌屬(Prevotellaceae YAB 2003 group)和Eubacteriumruminantiumgroup的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)。

圖3 MPal對(duì)湖羊瘤胃相對(duì)豐度Top30細(xì)菌屬水平的影響Fig.3 Effects of MPal supplementation on ruminal microbial community of the genus level(Top30)

2.3 湖羊瘤胃微生物PICRUSt功能預(yù)測(cè)

通過(guò)PICRUSt預(yù)測(cè)瘤胃菌群代謝功能,并利用iPath數(shù)據(jù)庫(kù)將分析的結(jié)果進(jìn)行整合(圖4)。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,復(fù)合劑提高了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)運(yùn)催化和分泌系統(tǒng)等相關(guān)途徑的豐度,同時(shí)降低了核酸代謝和感染性疾病等相關(guān)途徑的豐度(P<0.05)。

圖4 湖羊瘤胃微生物基因富集KEGG通路PICRUSt功能預(yù)測(cè)Fig.4 The KEGG enrichment analysis on PICRUSt-predicted metabolic pathways of ruminal microbiota in Hu sheep

2.4 殼寡糖/ZnO/凹凸棒石復(fù)合劑對(duì)湖羊瘤胃代謝產(chǎn)物的影響

我們進(jìn)一步通過(guò)代謝組學(xué)分析試驗(yàn)組與對(duì)照組瘤胃液代謝產(chǎn)物的差異。結(jié)果顯示:瘤胃液中共檢測(cè)出288種代謝物,主要分為氨基酸類、有機(jī)酸類、脂肪酸類、胺類、脂類、糖類等。如圖5所示,偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)結(jié)果顯示:2組間代謝產(chǎn)物可以被顯著區(qū)分開,說(shuō)明2組間代謝產(chǎn)物存在差異。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析及PLS-DA獲得VIP值,以FDR<0.05和VIP>1為篩選標(biāo)準(zhǔn),共篩選出73種差異代謝產(chǎn)物。表2所示為排名前30的差異代謝物,主要是脂肪酸類、有機(jī)酸類、糖類、固醇類等。與對(duì)照組湖羊相比,復(fù)合劑組湖羊瘤胃中丙酸、磷酸葡萄糖酸、白藜蘆醇和丁香酸等含量顯著升高,而與脂質(zhì)代謝有關(guān)的亞油酸、花生四烯酸、膽固醇、膽汁酸、棕櫚酸、2-單硬脂酸酯、1-單十七烷基甘油酯等含量顯著降低(FDR<0.05)。這表明飼喂復(fù)合劑對(duì)瘤胃脂質(zhì)代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用。

圖5 湖羊瘤胃代謝物的偏最小二乘判別分析(PLS-DA)Fig.5 Partial least squares discriminant analysis(PLS-DA) of ruminal metabolites of Hu sheep

表2 湖羊瘤胃差異代謝物Top30Table 2 List of ruminal fluid metabolites that showed Top30 significant difference between Con and MPal groups

2.5 瘤胃液差異微生物菌屬與差異代謝物相關(guān)性分析

對(duì)瘤胃變化的微生物菌屬與差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行了皮爾森相關(guān)性分析(圖6)。結(jié)果顯示,纖維桿菌屬(Fibrobacter)、理研菌科RC9菌屬(Rikenellaceae RC9 gut group)和瘤胃球菌科UCG-014(Ruminococcaceae UCG-014)與瘤胃丙酸含量均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(P<0.05)。亞油酸、花生四烯酸、膽固醇等代謝物與普雷沃氏菌屬1(Prevotella1)呈顯著正相關(guān),而其與瘤胃球菌科 UCG-014(Ruminococcaceae UCG-014)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

圖6 湖羊瘤胃差異菌屬與差異代謝物相關(guān)性分析Fig.6 Pearson correlation analysis of significantly changed bacterial genera and metabolites in rumen 紅色、綠色和白色分別代表顯著正相關(guān)(P<0.05)、顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)和不相關(guān)(P>0.05)。The red,green and white color represent significant positive correlation(P<0.05),significant negative correlation(P<0.05),and no correlation(P>0.05),respectively.

3 討論

3.1 殼寡糖/ZnO/凹凸棒石復(fù)合劑對(duì)湖羊瘤胃微生物區(qū)系的影響

瘤胃微生物中的細(xì)菌種類繁多,各種細(xì)菌協(xié)同作用將飼料降解轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物,為宿主提供充足的能量和養(yǎng)分。腸道菌群的多樣性是保障其完善功能的前提。腸道菌群多樣性與宿主對(duì)病原微生物的抵御能力成正相關(guān)[17]。在本試驗(yàn)中,2組微生物菌群顯著不同,這表明飼喂復(fù)合劑改變了湖羊瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)。與對(duì)照組相比,復(fù)合劑組瘤胃微生物的豐富度指數(shù)(Chao1、Ace)和多樣性指數(shù)(Shannon)均顯著升高。這表明飼喂復(fù)合劑增加了湖羊瘤胃微生物多樣性。湖羊瘤胃微生物主要以擬桿菌門和厚壁菌門為主[18]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,湖羊瘤胃中相對(duì)豐度大于1%的菌門主要有擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、纖維桿菌門和軟壁菌門。與對(duì)照組相比,復(fù)合劑組瘤胃中厚壁菌門和纖維桿菌門的相對(duì)豐度顯著升高,擬桿菌門相對(duì)豐度有下調(diào)趨勢(shì)。厚壁菌門和纖維桿菌門的主要作用為分解纖維類物質(zhì),對(duì)植物性纖維轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸(乙酸、丙酸等)發(fā)揮重要作用[19-20]。而擬桿菌門主要參與瘤胃中的蛋白質(zhì)和非纖維植物多糖的降解[21]。

在本試驗(yàn)中,普雷沃氏菌屬1是瘤胃液中豐度最高的屬,與先前的研究相一致[22]。分析Top30的屬水平相對(duì)豐度發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,復(fù)合劑組瘤胃中理研菌科RC9菌屬、纖維桿菌屬、瘤胃球菌科UCG-002和瘤胃球菌科UCG-014的相對(duì)豐度顯著升高;而普雷沃氏菌屬1、新月形單胞菌屬1和普雷沃氏菌科YAB2003菌屬的相對(duì)豐度顯著降低。理研菌科RC9菌屬能夠促進(jìn)纖維素的降解,其豐度與日糧纖維含量呈正相關(guān)[23]。瘤胃球菌科UCG-002和瘤胃球菌科UCG-014都屬于瘤胃球菌科。已有研究指出,瘤胃菌科與瘤胃中纖維素類物質(zhì)的降解密切聯(lián)系,當(dāng)飼喂高纖維飼糧時(shí)其豐度會(huì)大大提高[24-25]。同樣,纖維桿菌屬也是一種重要的纖維降解菌。普雷沃氏菌屬1能夠參與飼糧蛋白質(zhì)的降解,其相對(duì)豐度與飼糧蛋白質(zhì)水平相關(guān)[26]。這些結(jié)果表明,殼寡糖/ZnO/凹凸棒石復(fù)合劑增加了湖羊瘤胃中纖維降解菌的豐度,而降低了蛋白降解菌的豐度。

3.2 殼寡糖/ZnO/凹凸棒石復(fù)合劑對(duì)湖羊瘤胃代謝組學(xué)的影響

胃腸道微生物結(jié)構(gòu)與其代謝產(chǎn)物直接關(guān)聯(lián)。本試驗(yàn)中,我們通過(guò)代謝組學(xué)分析了復(fù)合劑對(duì)湖羊瘤胃內(nèi)容物代謝組學(xué)的影響。主成分分析結(jié)果顯示,對(duì)照組與復(fù)合劑組的代謝物組成明顯區(qū)分開,表明復(fù)合劑顯著改變了瘤胃代謝產(chǎn)物組成。差異代謝物結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,復(fù)合劑組湖羊瘤胃中丙酸和磷酸葡萄糖酸含量顯著升高。瘤胃微生物通過(guò)將宿主自身不能消化的植物性飼料降解,產(chǎn)生大量的VFA為宿主提供養(yǎng)分。成年反芻動(dòng)物大約70%的能量來(lái)源于VFA提供,而相較于乙酸和丁酸,瘤胃丙酸發(fā)酵對(duì)機(jī)體的供能效率最高[27]。因此,促進(jìn)瘤胃中丙酸的發(fā)酵有助于提高反芻動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化利用率。Zeng等[14]通過(guò)體外發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),熱改性凹凸棒石處理能夠促進(jìn)瘤胃中乙酸和丙酸的產(chǎn)生。張心壯等[28]研究發(fā)現(xiàn),飼糧添加丙酸鹽能夠促進(jìn)犢牛瘤胃發(fā)酵,提高瘤胃內(nèi)丙酸的含量,并且能夠促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞發(fā)育和提高犢牛生長(zhǎng)性能。對(duì)瘤胃差異菌屬和差異代謝物進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),纖維桿菌屬、理研菌科RC9菌屬和瘤胃球菌科UCG-014與瘤胃丙酸含量均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)。這些結(jié)果表明,飼喂復(fù)合劑改變了瘤胃微生物組成,從而促進(jìn)了纖維類物質(zhì)的分解和丙酸的生成。

此外,飼喂復(fù)合劑顯著降低了湖羊瘤胃中與脂質(zhì)代謝相關(guān)的代謝物含量,包括亞油酸、花生四烯酸、膽固醇、膽汁酸、棕櫚酸、2-單硬脂酸酯、1-單十七烷基甘油酯等。高濃度的多不飽和脂肪酸具有毒性,其與瘤胃微生物的細(xì)胞壁形成復(fù)合物從而抑制瘤胃微生物的生長(zhǎng)[29]。瘤胃微生物能夠通過(guò)氫化作用將不飽和脂肪酸降解脫毒,瘤胃球菌科和纖維桿菌屬等細(xì)菌與氫化產(chǎn)物存在關(guān)聯(lián)[25,30-31]。Hu等[32]研究發(fā)現(xiàn)腸道中普氏菌屬的含量與甘油三酯和總膽固醇的含量成正相關(guān)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),亞油酸、花生四烯酸、膽固醇等代謝物與普雷沃氏菌屬1顯著正相關(guān),而其與瘤胃球菌科UCG-014顯著負(fù)相關(guān)。因此,日糧添加復(fù)合劑影響了湖羊瘤胃脂質(zhì)代謝,但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上,日糧中添加殼寡糖/ZnO/凹凸棒石復(fù)合劑能夠提高瘤胃菌群豐富度和多樣性水平,有利于湖羊的胃腸道健康,同時(shí)對(duì)瘤胃菌群豐度具有調(diào)節(jié)作用。復(fù)合劑促進(jìn)了瘤胃中丙酸的生成,并降低了瘤胃中多種不飽和脂肪酸的含量,對(duì)湖羊瘤胃脂質(zhì)代謝起到重要的調(diào)節(jié)作用。湖羊瘤胃差異微生物與差異代謝產(chǎn)物具有較強(qiáng)的正/負(fù)相關(guān)關(guān)系。