即食果蔬中金黃色葡萄球菌選擇增菌培養(yǎng)基的研究

沈宇飛,周海波,萬佳佳,陸兆新,孔梁宇,胡安妥,呂鳳霞,別小妹

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

金黃色葡萄球菌在自然界中分布廣泛,且適應(yīng)不同環(huán)境的能力較強(qiáng),在含有150 g·L-1氯化鈉的液體培養(yǎng)基中仍可存活[1],在氯化鈉質(zhì)量濃度達(dá)到130 g·L-1的TSB瓊脂中生長(zhǎng)仍不受影響[2]。金黃色葡萄球菌是引發(fā)細(xì)菌性食物中毒的主要致病菌之一[3-5],對(duì)人類及動(dòng)物生命健康、食品安全和公共衛(wèi)生造成潛在威脅[6],還可以引起多種人體感染[7-8],主要為皮膚或黏膜感染以及敗血性感染[9]。因此對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)十分重要。

即食果蔬中污染的致病菌細(xì)胞可能有3種群體形態(tài),即未受損狀態(tài)、亞致死狀態(tài)和死亡狀態(tài)。在細(xì)菌細(xì)胞受到較緩和的外界脅迫時(shí),細(xì)胞不再正常生長(zhǎng),但也沒有受到不可逆的損傷,一旦處于亞致死狀態(tài)的致病菌重新回到適宜的生長(zhǎng)環(huán)境,細(xì)菌細(xì)胞便能迅速進(jìn)行自我修復(fù)與生長(zhǎng)[10]。因此,在即食果蔬檢測(cè)中,使用常規(guī)的選擇性培養(yǎng)基增菌極容易造成亞致死狀態(tài)細(xì)菌的漏檢,因而給食品安全留下嚴(yán)重的安全隱患。對(duì)于金黃色葡萄球菌等微生物來說,細(xì)胞快速分裂的指數(shù)生長(zhǎng)期比停止分裂的平臺(tái)期更容易受到處理過程的影響[11]。即食果蔬加工過程中,多種處理方式都可能導(dǎo)致細(xì)菌進(jìn)入亞致死狀態(tài),例如低熱殺菌、紫外處理[12-13]、酸性電解水[14]等。目前我國(guó)的檢測(cè)主要按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn):GB 4789.10—2016》進(jìn)行,非選擇性增菌培養(yǎng)基與選擇性培養(yǎng)基的結(jié)合被認(rèn)為是食源性細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法,但這些方法耗時(shí)、耗力且成本高。即食果蔬樣品中成分復(fù)雜,植物來源的抗菌化合物以及相關(guān)的競(jìng)爭(zhēng)性菌群的存在,導(dǎo)致金黃色葡萄球菌的富集時(shí)間延長(zhǎng)[15],且受損的細(xì)胞無法適應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)[16-19]。

本試驗(yàn)以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,篩選3種促進(jìn)劑與6種抑制劑,促進(jìn)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的同時(shí)抑制非目標(biāo)菌生長(zhǎng),使用響應(yīng)曲面分析中的星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化出最適添加量。建立的新型選擇性增菌培養(yǎng)基(SSA),不僅能高效培養(yǎng)金黃色葡萄球菌,抑制即食果蔬中常見的非目標(biāo)菌生長(zhǎng),而且還可以恢復(fù)受到亞致死損傷的金黃色葡萄球菌細(xì)胞。此外,SSA培養(yǎng)基還縮短了檢測(cè)時(shí)間,提高了檢測(cè)準(zhǔn)確度,為即食果蔬的安全快速檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株本試驗(yàn)使用的菌株包括金黃色葡萄球菌CICC 21600、ATCC 43300、CICC 10786、CICC 10788、CICC 22942,單增李斯特菌CICC 21662,熒光假單胞菌CICC 21620,蠟樣芽胞桿菌CMCC 63301,志賀氏菌CMCC 51571,鼠傷寒沙門氏菌CICC 21483,出血性大腸埃希氏菌O157:H7 CICC 21530,創(chuàng)傷弧菌CICC 21615和副溶血性弧菌ATCC 33847,均保藏于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程研究室。

1.1.2 主要培養(yǎng)基與試劑Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基:胰蛋白胨10.0 g,酵母提取物5.0 g,氯化鈉10.0 g,pH7.4,加蒸餾水定容至1 L;胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基:胰蛋白胨17.0 g,大豆蛋白胨3.0 g,氯化鈉5.0 g,磷酸氫二鉀2.5 g,葡萄糖2.5 g,加蒸餾水定容至1 L;腦心浸液肉湯(BHI)培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g,脫水小牛腦浸粉12.5 g,脫水牛心浸粉5.0 g,氯化鈉5.0 g,葡萄糖2.0 g,磷酸氫二鈉2.5 g,pH7.4,加蒸餾水定容至1 L;營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g,牛肉膏3.0 g,氯化鈉5.0 g,加蒸餾水定容至1 L;75 g·L-1氯化鈉肉湯(NaCl+NB)培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g,牛肉膏5.0 g,氯化鈉75.0 g,加蒸餾水定容至1 L。以上培養(yǎng)基配制后經(jīng)高壓蒸汽(115 ℃、20 min)滅菌備用。無水葡萄糖、氯化鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;丙酮酸鈉、亞碲酸鉀購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;萘啶酮酸購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;苯乙醇、吖啶黃購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;甘氨酸購(gòu)自廣州賽國(guó)生物科技有限公司;甘露醇購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌亞致死損傷模型的建立取1 mL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌菌懸液,稀釋至108CFU·mL-1,55 ℃ 熱處理150～270 s,80 ℃熱處理35～55 s,6 000 r·min-1離心5 min。用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋,選取合適的稀釋梯度涂布于LB平板和選擇性平板(NaCl+NB瓊脂)中,37 ℃倒置培養(yǎng)24～48 h后計(jì)數(shù)。3次平行試驗(yàn),計(jì)算致死率[20]和亞致死率[21]篩選最佳金黃色葡萄球菌亞致死條件。

1.2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選細(xì)菌培養(yǎng):將金黃色葡萄球菌菌懸液稀釋至D600值為0.4,按1∶100的體積比接種至20 mL LB、BHI、NB、TSB、NaCl+NB 5種培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)10 h,測(cè)定D600值;同時(shí)取培養(yǎng)后菌液1 mL,用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋;選擇適宜的稀釋度,吸取0.1 mL接種到LB瓊脂平板上,置于37 ℃培養(yǎng)12 h進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。3次平行試驗(yàn),計(jì)算平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

亞致死態(tài)細(xì)菌的恢復(fù):取1 mL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌菌懸液,稀釋至108CFU·mL-1,55 ℃熱處理220 s,80 ℃熱處理43 s,6 000 r·min-1離心5 min。用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋,選取合適的稀釋梯度,涂布于LB平板和選擇性平板(NaCl+NB瓊脂),37 ℃倒置培養(yǎng)24～48 h后計(jì)數(shù),計(jì)算亞致死率和致死率。同時(shí)將稀釋液重懸于LB、TSB和BHI培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r·min-1分別振蕩培養(yǎng)40～180 min,涂布于選擇性平板,37 ℃倒置培養(yǎng)24～48 h后計(jì)數(shù)。

1.2.3 抑制劑和促進(jìn)劑的選擇單因素試驗(yàn)在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行,促進(jìn)劑與抑制劑及添加量如表1所示。選取5株金黃色葡萄球菌和6株非目標(biāo)菌(鼠傷寒沙門氏菌CICC 21483、蠟樣芽胞桿菌CMCC 63301、志賀氏菌CMCC 51571、熒光假單胞菌CICC 21620、單增李斯特菌CICC 21662和大腸埃希氏菌O157:H7 CICC 21530)作為試驗(yàn)菌株,菌懸液調(diào)至D600為0.4左右,接種至含有不同添加物成分的LB培養(yǎng)基中。以未添加試劑的LB液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照,接種后于37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)10 h,根據(jù)菌液濃度適當(dāng)稀釋,測(cè)定D600。3次平行試驗(yàn),按如下公式計(jì)算相應(yīng)的促進(jìn)率與抑制率。

表1 促進(jìn)劑和抑制劑的添加量Table 1 Added level of promoters and inhibitors

促進(jìn)率=(D600 添加促進(jìn)劑/D600 原始LB-1)×100%;抑制率=(1-D600 添加抑制劑/D600 原始LB)×100%。

1.2.4 選擇性增菌培養(yǎng)基(SSA)優(yōu)化在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,運(yùn)用Design-Expert.V8.0.6軟件,根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)(Central Composite Design)原理,對(duì)金黃色葡萄球菌選擇性增菌培養(yǎng)基中的葡萄糖(A)、丙酮酸鈉(B)、萘啶酮酸(C)、苯乙醇(D)添加量組合進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表2)。以培養(yǎng)后菌液的D600值為響應(yīng)值,進(jìn)行四因素五水平共30組的響應(yīng)面設(shè)計(jì),包括24組因素試驗(yàn)和6組中心點(diǎn)試驗(yàn),確定金黃色葡萄球菌特異性增菌培養(yǎng)基中4種因素的最優(yōu)添加量。由于志賀氏菌CMCC 51571在單因素試驗(yàn)中顯示出較難被完全抑制的特點(diǎn),故將其加入響應(yīng)面設(shè)計(jì)中。將金黃色葡萄球菌CICC 22942與志賀氏菌CMCC 51571分別接種到每組試驗(yàn)中,使得試驗(yàn)的初始細(xì)菌濃度約為102CFU·mL-1,在37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)10 h后,測(cè)定并記錄培養(yǎng)基的D600值。

表2 各因素水平設(shè)計(jì)Table 2 Level design of each factor

1.2.5 SSA對(duì)亞致死損傷金黃色葡萄球菌的修復(fù)效果將經(jīng)熱處理(55 ℃、220 s)的金黃色葡萄球菌分別接種到20 mL SSA、LB 和NaCl+NB中,37 ℃分別培養(yǎng)60、90和120 min;用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋,分別涂布于LB瓊脂平板計(jì)數(shù),37 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),對(duì)比3種培養(yǎng)基對(duì)亞致死狀態(tài)金黃色葡萄球菌修復(fù)狀態(tài)。3次平行試驗(yàn),計(jì)算平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.6 SSA對(duì)細(xì)菌的增菌效果將細(xì)菌培養(yǎng)后的菌懸液D600調(diào)至0.4左右,取3 μL分別接種到含有300 μL LB、SSA和NaCl+NB的孔板中,置于細(xì)菌自動(dòng)生長(zhǎng)檢測(cè)儀37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)24 h。每隔30 min測(cè)定各個(gè)菌液的D600值,繪制菌株生長(zhǎng)曲線,驗(yàn)證SSA對(duì)金黃色葡萄球菌及非金黃色葡萄球菌的增菌效果。3次平行試驗(yàn),計(jì)算平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.7 SSA培養(yǎng)人工污染即食果蔬樣品使用常見的5種水果(獼猴桃、火龍果、梨、香蕉和芒果)與5種蔬菜(黃瓜、甘藍(lán)、胡蘿卜、生菜和西紅柿)作為即食果蔬樣品,進(jìn)行培養(yǎng)基的人工污染驗(yàn)證。用清水清洗即食果蔬樣品,將塊狀樣品加工為0.5～1 g的小塊,將葉菜類樣品均勻切片,樣品規(guī)格約2 cm2,每份樣品質(zhì)量控制為(25±0.2)g。使用75%乙醇對(duì)果蔬樣品表面進(jìn)行消毒,置于生物安全柜中吹干表面剩余的乙醇。將消毒后的樣品加入225 mL SSA培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)6 h,使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行分子檢測(cè)。同時(shí)參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn):GB 4789.10—2016》的方法進(jìn)行傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌亞致死損傷模型的建立

由圖1可見:金黃色葡萄球菌在55 ℃低熱殺菌時(shí),隨著處理時(shí)間增加,致死率不斷升高,在處理時(shí)間達(dá)到220 s后,致死率達(dá)到50%以上;亞致死率也隨處理時(shí)間增加而上升,處理時(shí)長(zhǎng)為240 s時(shí)超過90%,其后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在80 ℃熱處理時(shí),致死率與亞致死率的變化趨勢(shì)與前者相同,在熱處理43 s時(shí)亞致死率達(dá)到最高,接近60%,熱處理50 s后致死率達(dá)到100%。為獲得更大的培養(yǎng)后亞致死恢復(fù)生長(zhǎng)空間,傾向選擇相對(duì)較低的致死率與較高的亞致死率,因此,將55 ℃熱處理220 s與80 ℃熱處理43 s作為亞致死恢復(fù)能力研究的處理?xiàng)l件。

圖1 金黃色葡萄球菌在低熱殺菌條件的致死率與亞致死率Fig.1 Lethal rate and sub-lethal rate of Staphylococcus aureus in low thermal sterilization 不同大、小寫字母分別表示不同熱處理時(shí)間致死率和亞致死率差異顯著(P<0.05)。下同。 Different capital and lowercase letters indicate significant difference of lethal rate and sub-lethal rate on different low-thermally process time(P<0.05). The same as follows.

2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選

2.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)如圖2所示:5株金黃色葡萄球菌接種至5種培養(yǎng)基中培養(yǎng)后,4株金黃色葡萄球菌在LB中的富集能力顯著高于其余4種培養(yǎng)基(P<0.05),LB對(duì)菌株ATCC 43300的生長(zhǎng)促進(jìn)作用也均高于其他培養(yǎng)基。75 g·L-1氯化鈉肉湯(NaCl+NB)的高氯化鈉含量使其具有金黃色葡萄球菌選擇性,根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn):GB 4789.10—2016》,18～24 h的增菌培養(yǎng)才能使金黃色葡萄球菌在其中呈渾濁生長(zhǎng),因此培養(yǎng)12 h后尚未見渾濁。

圖2 金黃色葡萄球菌在5種非選擇性增菌培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)Fig.2 Growth effectiveness of S.aureus in five enrichment broths TSB:胰蛋白胨大豆肉湯 Tryptic soy broth;LB:Luria-Bertani肉湯 Luria-Bertani broth;BHI:腦心浸出液肉湯 Brain heart infusion broth;NB:營(yíng)養(yǎng)肉湯 Nutrient broth;NaCl+NB:75 g·L-1氯化鈉肉湯75 g·L-1 Sodium chloride broth. 下同The same as follows.

2.2.2 亞致死態(tài)細(xì)菌的恢復(fù)由圖3可見:在55 ℃熱處理220 s與80 ℃熱處理43 s條件下的亞致死狀態(tài)金黃色葡萄球菌恢復(fù)生長(zhǎng)情況中,LB培養(yǎng)基均表現(xiàn)出比TSB與BHI培養(yǎng)基更好的恢復(fù)能力。在恢復(fù)培養(yǎng)180 min后,活菌濃度便恢復(fù)到108CFU·mL-1以上,在55 ℃、220 s熱處理組尤為明顯。因此,將LB培養(yǎng)基選作基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行因素優(yōu)化。

圖3 亞致死金黃色葡萄球菌在3種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的恢復(fù)生長(zhǎng)情況Fig.3 Recovery growth situation of S.aureus in three enrichment broths A. 55 ℃熱處理220 s后修復(fù)效果Recovery effect after 220 s of heat treatment at 55 ℃;B. 80 ℃熱處理43 s后修復(fù)效果Recovery effect after 43 s of heat treatment at 80 ℃.

2.3 促進(jìn)劑和抑制劑的選擇

由圖4可見:丙酮酸鈉和葡萄糖均能較好促進(jìn)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng),當(dāng)丙酮酸鈉質(zhì)量濃度為12～16 g·L-1時(shí),對(duì)金黃色葡萄球菌的促進(jìn)率相比其他濃度顯著提高(P<0.05),除菌株ATCC 43300為25.9%外,其余4株菌的促進(jìn)率均超過57%。與其他添加量相比,添加2 g·L-1的葡萄糖相比其他濃度能較好地促進(jìn)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng),除菌株ATCC 43300為11.2%外,其余4株菌的促進(jìn)率均超過24%。甘露醇對(duì)不同金黃色葡萄球菌的增菌效果差異較大,當(dāng)質(zhì)量濃度為6 g·L-1時(shí),培養(yǎng)基對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的促進(jìn)率相對(duì)更高。不同菌株的促進(jìn)率存在差異,菌株ATCC 43300的促進(jìn)率偏低,甚至有被抑制的現(xiàn)象。葡萄糖與丙酮酸鈉對(duì)不同金黃色葡萄球菌菌株促進(jìn)作用更穩(wěn)定,選作繼續(xù)優(yōu)化的因素。

圖4 不同質(zhì)量濃度的促進(jìn)劑對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響Fig.4 Impact of the different concentrations promoters on the cultivation of S.aureus

由圖5和圖6可見:35 g·L-1氯化鈉可以完全抑制大腸埃希氏菌O157:H7 CICC 21530的生長(zhǎng),另5株非目標(biāo)菌的抑制率也均大于60%(圖6-A),20 g·L-1氯化鈉對(duì)6株非目標(biāo)菌均有抑制作用,同時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌抑制較小。10 mg·L-1吖啶黃對(duì)蠟樣芽胞桿菌CMCC 63301的抑制率達(dá)到89.9%,但對(duì)其他非目標(biāo)菌抑制較弱或無抑制(圖6-B)。2.0 mL·L-1苯乙醇可完全抑制除志賀氏菌CMCC 51571外的5株非目標(biāo)菌,志賀氏菌的抑制率也達(dá)到87.8%(圖6-C),同時(shí)對(duì)4株金黃色葡萄球菌的抑制較弱,但CICC 10786的抑制率達(dá)到55.9%(圖5-C)。當(dāng)苯乙醇濃度為1.0 mL·L-1時(shí),6株非目標(biāo)菌的抑制率均超過50%,5株金黃色葡萄球菌的抑制率最高僅為5.3%,甚至在2個(gè)菌株中顯示出促進(jìn)作用。5 g·L-1甘氨酸對(duì)5株非目標(biāo)菌抑制率在10%左右,而對(duì)熒光假單胞菌CICC 21620無明顯抑制(圖6-D)。8 mg·L-1萘啶酮酸可以完全抑制全部非目標(biāo)菌的生長(zhǎng)(圖6-E),但對(duì)金黃色葡萄球菌CICC 21600的抑制率達(dá)到了68.4%(圖5-E)。當(dāng)萘啶酮酸濃度為4 mg·L-1時(shí),金黃色葡萄球菌抑制率最高為15.5%,同時(shí)可完全抑制熒光假單胞菌CICC 21620與單增李斯特菌CICC 21662,對(duì)大腸埃希氏菌O157:H7 CICC 21530、鼠傷寒沙門氏菌CICC 21483和蠟樣芽胞桿菌CMCC 63301的抑制率分別為98.2%、97.9%和84.5%,但對(duì)志賀氏菌CMCC 51571的抑制率僅為47.3%。當(dāng)亞碲酸鉀添加量為20 mg·L-1時(shí),5株金黃色葡萄球菌的抑制率都不超過20%(圖5-F),而對(duì)鼠傷寒沙門氏菌CICC 21483的抑制率達(dá)到100%,熒光假單胞菌CICC 21620和大腸埃希氏菌 O157:H7 CICC 21530的抑制率均達(dá)到85%以上,但其余3株非目標(biāo)菌的抑制率較低(圖6-F)。苯乙醇和萘啶酮酸兼具對(duì)非目標(biāo)菌抑制率高和對(duì)金黃色葡萄球菌抑制率低的特點(diǎn),因此將二者選作培養(yǎng)基的抑制劑。

圖5 不同濃度抑制劑對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響Fig.5 Impact of the different concentrations inhibitors on the cultivation of S.aureus A. 氯化鈉 Sodium chloride;B. 吖啶黃 Acriflavine;C. 苯乙醇 Phenylethyl alcohol;D. 甘氨酸 Glycine;E. 萘啶酮酸 Nalidixic acid;F. 亞碲酸鉀 Potassium tellurite.

圖6 不同濃度抑制劑對(duì)非金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響Fig.6 Impact of the different concentrations inhibitors on the cultivation of non-S.aureus A. 氯化鈉 Sodium chloride;B. 吖啶黃 Acriflavine;C. 苯乙醇 Phenylethyl alcohol;D. 甘氨酸 Glycine;E. 萘啶酮酸 Nalidixic acid;F. 亞碲酸鉀 Potassium tellurite.

2.4 選擇性增菌培養(yǎng)基配方優(yōu)化

2.4.1 響應(yīng)面星點(diǎn)設(shè)計(jì)如表3所示:響應(yīng)值R1為金黃色葡萄球菌CICC 22942生長(zhǎng)促進(jìn)率,R2為志賀氏菌CMCC 51571生長(zhǎng)抑制率。在第2組和第4組中,金黃色葡萄球菌的促進(jìn)率最高,均超過了93%。促進(jìn)劑質(zhì)量濃度處于高值時(shí),金黃色葡萄球菌促進(jìn)率較高;抑制劑質(zhì)量濃度處于高值時(shí),金黃色葡萄球菌促進(jìn)率較低或被抑制,這與單因素試驗(yàn)結(jié)果相似。30個(gè)試驗(yàn)組,志賀氏菌CMCC 51571的生長(zhǎng)均被抑制。

2.4.2 模型方程的建立與顯著性檢驗(yàn)根據(jù)表3的試驗(yàn)結(jié)果,使用 Design-Expert V8.0.6軟件對(duì)生長(zhǎng)促進(jìn)率和各因素進(jìn)行多元回歸分析,同時(shí)擬得金黃色葡萄球菌CICC 22942的多元二次回歸方程:R1=47.59-0.18A-7.04B-36.50C-44.92D+5.36AB-4.72AC-4.89AD-0.048BC-0.77BD-7.14CD-9.73A2-5.19B2-13.36C2-16.10D2。其中A、B、C、D分別表示葡萄糖、丙酮酸鈉、萘啶酮酸、苯乙醇。方程R2值為0.970 2,說明該回歸方程的擬合度較好,可通過回歸方程對(duì)實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。

表3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 3 Results of Central Composite Design test

2.4.3 培養(yǎng)基配方的確定為減少志賀氏菌CMCC 51571對(duì)金黃色葡萄球菌選擇性培養(yǎng)的干擾,使用軟件模型將其生長(zhǎng)抑制率控制在80%以上,依據(jù)此確定抑制劑的添加組合,并將其代入金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)模型。以苯乙醇濃度為自變量,計(jì)算出在此抑制劑條件下的最優(yōu)促進(jìn)劑組合,獲得金黃色葡萄球菌特異性快速增菌培養(yǎng)基的最終配方。結(jié)果如表4所示,在苯乙醇為1.60 mL·L-1時(shí),金黃色葡萄球菌CICC 22942生長(zhǎng)促進(jìn)率模型預(yù)測(cè)值達(dá)到最高值,促進(jìn)率為44.35%,同時(shí)對(duì)志賀氏菌CMCC 51571的抑制率達(dá)到80%。此時(shí)的葡萄糖、丙酮酸鈉和萘啶酮酸添加量分別為1.73 g·L-1、12.52 g·L-1和3.82 mg·L-1。

表4 培養(yǎng)基組合添加濃度優(yōu)化Table 4 Optimization of additional concentration to the broth

2.5 選擇性增菌培養(yǎng)基(SSA)重復(fù)性評(píng)價(jià)

由圖7可知:在模型預(yù)測(cè)的最佳培養(yǎng)條件下,4株金黃色葡萄球菌中平均生長(zhǎng)促進(jìn)率最大的是CICC 10788,促進(jìn)率為71.59%;生長(zhǎng)促進(jìn)最小的是CICC 10786,促進(jìn)率為20.60%。金黃色葡萄球菌 CICC 22942的平均生長(zhǎng)促進(jìn)率為45.14%,超過預(yù)測(cè)值的44.68%,預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的擬合性較好。4株金黃色葡萄球菌的平均生長(zhǎng)促進(jìn)率為37.20%,同時(shí)對(duì)志賀氏菌CMCC 51571的平均抑制率達(dá)到80.89%,優(yōu)化結(jié)果具有可行性。

圖7 金黃色葡萄球菌(A—D)和志賀氏菌(E)在選擇性增菌培養(yǎng)基(SSA)中培養(yǎng)的穩(wěn)定性Fig.7 Stability of S.aureus(A-D)and S.flexneri(E)cultivated in selective enrichment broth(SSA)

2.6 SSA對(duì)熱損傷金黃色葡萄球菌的修復(fù)效果

由圖8可知:SSA的亞致死修復(fù)效果相比LB培養(yǎng)基更好,經(jīng)亞致死處理后的金黃色葡萄球菌在SSA中培養(yǎng)90 min后修復(fù)率可達(dá)到94.6%,顯著高于LB培養(yǎng)基(73.7%);培養(yǎng)120 min后,SSA可達(dá)到100%修復(fù),而NaCl+NB培養(yǎng)基在培養(yǎng)180 min后僅能達(dá)到71.7%的修復(fù)率。因此,SSA對(duì)熱損傷金黃色葡萄球菌的修復(fù)相比LB與NaCl+NB培養(yǎng)基有顯著優(yōu)勢(shì)。

圖8 亞致死金黃色葡萄球菌在SSA 培養(yǎng)基中修復(fù)驗(yàn)證Fig.8 Verification of recovery ability of sub-lethal S.aureus in SSA

2.7 SSA對(duì)細(xì)菌的增菌效果

由圖9-A—D可知:金黃色葡萄球菌在LB培養(yǎng)基中最早到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,而在SSA培養(yǎng)基中可以得到最高的平臺(tái)期菌體濃度,在37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)10 h時(shí),SSA培養(yǎng)基中的D600值相比LB培養(yǎng)基高;在NaCl+NB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度與菌體終濃度均較前兩者低。8株非目標(biāo)菌中,有6株均僅在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng),在SSA與NaCl+NB培養(yǎng)基中均不能生長(zhǎng)(圖9-E、F)。志賀氏菌CMCC 51571在SSA培養(yǎng)基中的D600值更高,但與金黃色葡萄球菌相比,志賀氏菌在SSA培養(yǎng)基中到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期更慢。在培養(yǎng)10 h時(shí),在SSA培養(yǎng)基的吸光值顯著低于在LB培養(yǎng)基的,故SSA培養(yǎng)基在短時(shí)快速培養(yǎng)中對(duì)志賀氏菌CMCC 51571也有明顯抑制效果(圖9-G)。副溶血性弧菌ATCC 33847在LB與NaCl+NB培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng),而SSA培養(yǎng)基可以完全抑制其生長(zhǎng)(圖9-L)。故SSA培養(yǎng)基同時(shí)在促進(jìn)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)與抑制果蔬中常見其他致病菌中均有較好效果。

圖9 金黃色葡萄球菌(A—D)及非目標(biāo)菌(E—L)在LB、SSA和NaCl+NB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.9 Growth kinetics of S.aureus(A-D)and non-S.aureus(E-L)in LB,SSA and NaCl+NB broth

2.8 人工污染即食果蔬樣品的檢測(cè)

如表5所示:當(dāng)樣品在SSA培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h后,通過PCR法和涂布法對(duì)即食果蔬中金黃色葡萄球菌的檢出率分別為100%和90%,在NaCl+NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h后PCR法和涂布法的檢出率分別為90%和40%。因此,SSA培養(yǎng)基相較于NaCl+NB培養(yǎng)基在培養(yǎng)時(shí)間與檢出率上均有明顯的優(yōu)勢(shì)。

表5 通過SSA與NaCl+NB培養(yǎng)基檢測(cè)人工污染即食果蔬樣品中的金黃色葡萄球菌Table 5 Detection of S.aureus in artificially contaminated food samples cultured by SSA and NaCl+NB broth

3 討論

在即食果蔬類食品加工過程中,為保護(hù)食品品質(zhì)、外觀和口感等因素不受破壞,常使用較溫和的殺菌方法,如紫外照射、微波輻照、酸性電解水處理與低熱殺菌等。Lu等[22]使用功率為700 w的家用微波爐加熱圣女果40 s殺菌,菌落計(jì)數(shù)可下降101.5CFU·mL-1;Chen等[23]使用微酸性電解水和富馬酸同時(shí)處理水果樣品,單個(gè)水果的菌落計(jì)數(shù)可下降102.85～105.35CFU的降低。這些方法雖能在較短的時(shí)間內(nèi)殺滅大部分致病菌,但這些方法不能實(shí)現(xiàn)徹底滅菌。部分受到損傷但還沒有立即死亡的細(xì)菌細(xì)胞會(huì)停止生長(zhǎng),進(jìn)入自我保護(hù)的休眠狀態(tài),等待足夠的營(yíng)養(yǎng)條件繼續(xù)復(fù)蘇生長(zhǎng)。在即食果蔬類食品樣品優(yōu)沃的營(yíng)養(yǎng)條件下,這類細(xì)菌很容易重新生長(zhǎng)并產(chǎn)生毒素,在達(dá)到一定量的累積后便會(huì)對(duì)人體健康造成威脅。

關(guān)于金黃色葡萄球菌的增菌培養(yǎng),采用TSB培養(yǎng)基進(jìn)行增菌培養(yǎng)的實(shí)例最多[24]。LB、BHI和NB均為微生物培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中常選用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,75 g·L-1氯化鈉肉湯是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的金黃色葡萄球菌選擇性增菌培養(yǎng)基。本研究發(fā)現(xiàn),LB培養(yǎng)基對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)與亞致死細(xì)菌的恢復(fù)效果比其他培養(yǎng)基(BHI、NB、TSB和NaCl+NB)更好,故選擇LB培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基用于后續(xù)因素優(yōu)化。

單因素添加物的選擇對(duì)培養(yǎng)基的優(yōu)化過程至關(guān)重要。本研究采用葡萄糖與丙酮酸鈉作為金黃色葡萄球菌快速選擇培養(yǎng)的促進(jìn)劑,萘啶酮酸和苯乙醇作為抑制劑,在抑制即食果蔬中常見的雜菌生長(zhǎng)時(shí)還能夠促進(jìn)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。苯乙醇是一種具有令人愉悅的玫瑰風(fēng)味的芳香醇,在食品和藥品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[25]。苯乙醇在本研究中具有極好的篩選作用,對(duì)6株非目標(biāo)菌發(fā)揮強(qiáng)有力的抑制作用,僅需1 mL·L-1就能對(duì)6株非目標(biāo)菌造成50%以上的生長(zhǎng)抑制,2 mL·L-1苯乙醇就能完全抑制除志賀氏菌(抑制率87.8%)外的非目標(biāo)菌,但其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制則比較輕微。萘啶酮酸是常用的抑菌劑,朱敏等[26]研究發(fā)現(xiàn),20 mg·L-1萘啶酮酸對(duì)大腸桿菌和蠟樣芽胞桿菌的生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制性。本研究中,4 mg·L-1萘啶酮酸對(duì)沙門氏菌和大腸埃希氏菌O157:H7的抑制率分別達(dá)到97.9%和98.2%,大于Qu等[27]報(bào)道的93%的抑制率。葡萄糖是細(xì)菌培養(yǎng)中常見的碳源類物質(zhì),是TSB培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分之一。本研究中,僅需2 g·L-1葡萄糖即可將金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)率提高11.2%～33.9%。丙酮酸鈉是一種在科學(xué)研究和日常生活中被廣泛應(yīng)用的丙酮酸鹽,在食品科學(xué)領(lǐng)域可用作食品添加劑和膳食補(bǔ)充劑[28]。在微生物培養(yǎng)中,丙酮酸鈉是常用的促進(jìn)劑,同時(shí)有改善細(xì)胞損傷的作用。本研究中,添加12 g·L-1丙酮酸鈉對(duì)金黃色葡萄球菌有60%左右的促進(jìn)作用,這與Yoon等[29]的結(jié)果相似。

本研究采用四因素五水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì),對(duì)葡萄糖、丙酮酸鈉、萘啶酮酸和苯乙醇這4種添加物進(jìn)行多重組合試驗(yàn)。在抑制劑添加到適宜的濃度時(shí),促進(jìn)劑的濃度與金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)促進(jìn)率并非為完全的正相關(guān)關(guān)系。當(dāng)萘啶酮酸為3.82 mg·L-1,苯乙醇為1.60 mL·L-1時(shí),金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)促進(jìn)率均隨2種促進(jìn)劑試驗(yàn)范圍內(nèi)濃度的升高呈先升高后下降的趨勢(shì),這與單因素試驗(yàn)的結(jié)果不同,同時(shí)體現(xiàn)了多因素交互試驗(yàn)的價(jià)值。

綜上所述,本研究?jī)?yōu)化了1種金黃色葡萄球菌選擇性增菌培養(yǎng)基SSA,最佳培養(yǎng)基配方是胰蛋白胨10.00 g·L-1,酵母浸粉5.00 g·L-1,氯化鈉10.00 g·L-1,葡萄糖1.73 g·L-1,丙酮酸鈉12.52 g·L-1,萘啶酮酸3.82 mg·L-1,苯乙醇1.60 mL·L-1,可有效抑制即食果蔬中常見的非目標(biāo)菌,同時(shí)提高金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)效率及恢復(fù)熱損傷細(xì)菌生長(zhǎng)能力。SSA 培養(yǎng)基僅需6 h即可滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中即食果蔬中金黃色葡萄球菌檢測(cè)限的培養(yǎng)需要,相比于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)所使用的75 g·L-1氯化鈉肉湯所需的最短18 h的培養(yǎng)時(shí)間縮短2/3,結(jié)合分子檢測(cè)方法,從取樣起僅需不到10 h即能得到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果,為即食果蔬的安全控制提供了新方法。