基于質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）理念的滋腎通關(guān)膠囊醇提工藝質(zhì)量控制研究

管 敏，施 敏

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 制劑部，江蘇 南京 210029）

滋腎通關(guān)膠囊是江蘇省中醫(yī)院基于古方開發(fā)的醫(yī)院制劑，由黃柏、知母和肉桂三味常用中藥組成，用于治療腎虛濕熱淋證，療效明確[1-2]。同大部分中藥制劑一樣，滋腎通關(guān)膠囊目前的提取工藝是采用固定工藝參數(shù)的操作方式，提取工藝流程也存在一定的不合理性，從而影響制劑的質(zhì)量穩(wěn)定及工藝效率，影響臨床使用的安全性和有效性，限制了其進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用。為改善制劑均一性和穩(wěn)定性，提高制劑工藝效率，本研究突破傳統(tǒng)的以單一指標(biāo)優(yōu)選關(guān)鍵工藝參數(shù)點(diǎn)的制劑工藝研究模式，采用國(guó)際先進(jìn)的質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）理念優(yōu)化滋腎通關(guān)膠囊的提取工藝，運(yùn)用風(fēng)險(xiǎn)、統(tǒng)計(jì)分析，Box-Behnken 設(shè)計(jì)等方法建立工藝-質(zhì)量的關(guān)系模型，以“空間”代“點(diǎn)”，構(gòu)建設(shè)計(jì)空間，將提取全過程控制在該空間內(nèi)[3-4]，實(shí)現(xiàn)滋腎通關(guān)膠囊提取工藝靈活、穩(wěn)定、高效，中間體質(zhì)量可靠、可控，進(jìn)而建立一套整體、科學(xué)、合理的中藥制劑工藝研究方法，為中藥制劑研究模式的新改革提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260s 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；BP211D 型十萬分之一分析天平（德國(guó)Sartorius 公司）；1500L 型真空濃縮主罐（浙江溫兄機(jī)械閥業(yè)有限公司）；黃柏（批號(hào)：20190901、20191002、20201202，貴州同德藥業(yè)有限公司）；知母（批號(hào)：20020408、19012603、19030207，安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司）；所有飲片由江蘇省中醫(yī)院藥學(xué)部主任中藥師周琴妹鑒定，均符合 2020 年版《中國(guó)藥典》（一部）相關(guān)項(xiàng)下的要求；黃柏堿（批號(hào)：200616，南京聚康醫(yī)藥化工有限公司）；芒果苷（批號(hào)：111607-201704，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；鹽酸小檗堿（批號(hào)：100453-200501，中國(guó)食品藥品檢定研究院，小檗堿含量均以鹽酸小檗堿計(jì)），含量均大于98%；乙腈為色譜純，水為純凈水，甲醇為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 滋腎通關(guān)提取液的制備

稱取黃柏100 g，知母100 g，加入一定量的65%乙醇，浸泡適當(dāng)時(shí)間，加熱回流提取2 次，合并兩次濾液，定容至適宜體積即得。

2.2 提取工藝關(guān)鍵工藝參數(shù)的篩選

首先采用失效模型與影響分析（Failure mode and effects analysis，F(xiàn)MEA），根據(jù)筆者在中藥提取方面的經(jīng)驗(yàn)以及文獻(xiàn)資料的報(bào)道，對(duì)滋腎通關(guān)提取工藝在飲片、溶劑、提取操作、過濾操作方面所涉及的潛在關(guān)鍵工藝參數(shù)（Potential critical process parameters，pCPPs）進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)優(yōu)先度（Risk priority number，RPN），RPN ＝S × O × D，其中 ，S 為嚴(yán)重度，O 為失效發(fā)生頻度，D 為不可探測(cè)度[5]，結(jié)果見表 1。RPN 值越高風(fēng)險(xiǎn)越大，針對(duì)部分高風(fēng)險(xiǎn)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，最后選擇溶劑倍數(shù)、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間為 pCPPs。

表1 滋腎通關(guān)膠囊提取工藝中pCPPs 的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估Tab. 1 Risk assessment of pCPPs in the extraction process of Zishen Tongguan capsule

2.3 關(guān)鍵質(zhì)量屬性（Critical quality attributes，CQAs）的測(cè)定與分析方法

2.3.1 干浸膏得率的測(cè)定 精密量取滋腎通關(guān)提取液25 mL 至已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，于105℃干燥至恒定質(zhì)量（3 h），置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計(jì)算得到干浸膏得率。干浸膏得率（%）=（干膏重/飲片重）×倍數(shù)×100%。

2.3.2 黃柏堿、芒果苷和小檗堿的含量測(cè)定 （1）對(duì)照品溶液制備 精密稱取黃柏堿對(duì)照品10.20 mg，加甲醇制成1 mL 含0.204 0 mg 的對(duì)照品母液；取鹽酸小檗堿10.11 mg，加甲醇制成1 mL 含1.011 mg的對(duì)照品母液；取芒果苷對(duì)照品12.60 mg，加50%甲醇制成1 mL 含0.504 0 mg 的對(duì)照品母液。精密吸取黃柏堿母液5 mL、其余母液各1 mL 置于10 mL的容量瓶中，加甲醇稀釋，超聲15 min，放冷后定容，混勻，0.22 μm 濾膜過濾，進(jìn)樣5 μL。

（2） 供試品溶液制備 精密吸取提取液1 mL于100 mL 容量瓶中，加50%甲醇適量，超聲15 min，放冷后定容，混勻，0.22 μm 濾膜過濾，即得。

（3） 色譜條件 色譜柱：Inert Sustain TM C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；流速：1.0 mL/min，柱溫：30℃。流動(dòng)相：0.2%磷酸溶液（A）-乙腈（B）, 梯度洗脫見表2。

表2 洗脫梯度表Tab. 2 Gradient elution table

（4） 系統(tǒng)適應(yīng)性及專屬性考察 在“2.3.2（3）”項(xiàng)所述色譜條件下，供試品溶液中黃柏堿、芒果苷、小檗堿與相應(yīng)對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間一致，各色譜峰均能較好分離，供試品中其它成分對(duì)待測(cè)成分無干擾，見圖1。

圖1 滋腎通關(guān)提取液HPLC 色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram of Zishen Tongguan extract

（5） 線性關(guān)系考察 依法測(cè)定不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，以濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別得回歸方程：黃柏堿（5.876 ～188 μg/mL）：Y= 8.432X+ 4.972（R2= 0.999 9）；芒果苷（5.812 5 ～186 μg/mL）：Y=16.30X- 4.056（R2= 0.999 9）；小檗堿（15.625 ～500 μg/mL）：Y= 21.40X- 3.726 1（R2= 1）。結(jié)果表明黃柏堿、芒果苷、小檗堿在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

（6） 精密度試驗(yàn) 取“2.3.2（1）”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.3.2（3）”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積， 計(jì)算得到黃柏堿、芒果苷、小檗堿對(duì)照品峰面積的RSD 分別是0.79%、1.49%、0.34%（n= 6），表明儀器精密度良好。

（7） 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取滋腎通關(guān)提取液適量，按“2.3.2（2）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算得到供試品中黃柏堿、芒果苷、小檗堿峰面積RSD 分別為0.75%、0.88%、0.23%（n= 6），表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（8） 重復(fù)性試驗(yàn) 取滋腎通關(guān)提取液適量，按“2.3.2（2）”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算得到供試品中黃柏堿、芒果苷、小檗堿峰面積RSD 分別為0.48%、0.57%、0.07%（n= 6），表明該方法重復(fù)性良好。

（9） 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知各成分含量的滋腎通關(guān)提取液0.5 mL 于100 mL 容量瓶中，加入含有黃柏堿0.86 mg、芒果苷1.515 mg、小檗堿7.24 mg 的對(duì)照品溶液，按照供試品制備方法平行制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到供試品中黃柏堿、芒果苷、小檗堿的平均加樣回收率分別為103.46%、104.18%、103.93%，RSD 分別為0.95%、1.23%、0.57%（n= 6）。

（10） 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析由Microsoft Office Excel 2013（Microsoft, USA） 軟件完成；Box-Behnken 與設(shè)計(jì)空間的分析由Design-Expert 12 軟件完成。

2.4 pCPPs 與 CQAs 的相關(guān)性研究

為探討滋腎通關(guān)膠囊提取工藝中pCPPs（A：溶劑倍數(shù)、 B：浸泡時(shí)間、 C：提取時(shí)間）與CQAs（干浸膏得率、黃柏堿、芒果苷、小檗堿含量）的相關(guān)性，設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)[6-7]，Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值見表3。采用Box-Behnken 推薦的回歸類型對(duì)設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。由表4 可知，各工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)的分布范圍較寬，證明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)關(guān)鍵工藝參數(shù)的范圍設(shè)置較為合理。干浸膏得率二次項(xiàng)回歸總模型方差顯著（P＜0.01），失擬值差異不顯著（P＞0.05）；黃柏堿二次項(xiàng)回歸總模型方差顯著（P＜0.01），失擬值差異不顯著（P＞0.05）；芒果苷一次項(xiàng)和二次項(xiàng)回歸模型方差差異均不顯著（P＞0.05），失擬值差異顯著（P＜0.05）；小檗堿二次項(xiàng)回歸總模型方差顯著（P＜0.05），失擬值差異不顯著（P＞0.05）。以上結(jié)果表明干浸膏得率、黃柏堿、小檗堿的二次項(xiàng)回歸總模型擬合度好，誤差小，可用于預(yù)測(cè)和優(yōu)化。

表3 Box-Behnken 設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab. 3 Box-Behnken design and results

表4 Box-Behnken 設(shè)計(jì)方差分析Tab. 4 Box-Behnken design variance analysis

2.5 模型的建立及評(píng)價(jià)

采用二項(xiàng)式回歸對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)及關(guān)鍵工藝參數(shù)分別進(jìn)行擬合，回歸方程如下：干浸膏得率= 30.54 +0.902 5A+ 1.61B+ 1.28C+ 0.242 5AB- 0.967 5AC-0.450 0BC-0.832 0A2-1.60B2+ 2.45C2；黃柏堿= 0.150 6 +0.010 9A+ 0.008 1B+ 0.027 4C+ 0.010 0AB+ 0.008 9AC- 0.008 9BC+ 0.009 0A2- 0.011 20B2- 0.010 9C2；

小檗堿 = 1.518 + 0.089 7A+ 0.789 0B+ 1.803 1C+ 0.079 1

AB+ 0.016 6AC- 0.047 6BC+ 0.112A2- 0.127B2-0.143C2。

干浸膏得率、黃柏堿和小檗堿的擬合相關(guān)系數(shù)R2分別為0.924 9、0.905 9 和0.848 0，Radj2分別為0.828 3、0.784 9、0.652 5，表明該回歸模型具有較好的擬合度，該模型可接受。而芒果苷的擬合相關(guān)系數(shù)R2為0.398 5，表明該回歸模型的擬合度較差。

2.6 響應(yīng)面分析

根據(jù)各回歸方程進(jìn)行繪圖分析，三維響應(yīng)面圖見圖2，圖的顏色從藍(lán)色到紅色的變化表示評(píng)價(jià)指標(biāo)從少到多的變化，變化的越快表示坡度越大，即對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響更為明顯。由干浸膏得率的等高線圖可知，提取時(shí)間的兩幅圖顏色變化快，表明提取時(shí)間對(duì)干浸膏得率影響更明顯。黃柏堿和小檗堿的等高線圖顯示溶劑倍數(shù)對(duì)黃柏堿和小檗堿的含量影響更明顯。

圖2 干浸膏得率、黃柏堿、小檗堿的響應(yīng)面分析圖Fig. 2 Response surface diagram of dry extract yield phellodendine and berberine

2.7 設(shè)計(jì)空間的建立

根據(jù)醫(yī)院制劑大生產(chǎn)的經(jīng)驗(yàn)與需求，將優(yōu)化目標(biāo)設(shè)定為干浸膏得率在29% ～ 37%，黃柏堿含量≥0.14%，芒果苷含量≥0.22%，小檗堿含量≥1.2%，在設(shè)定的工藝參數(shù)空間內(nèi)選取符合條件的子集，構(gòu)建設(shè)計(jì)空間并以O(shè)verlay Plot 展示，結(jié)果見圖3。圖中灰色區(qū)域?yàn)椴环弦蟮目臻g，淺灰色區(qū)域?yàn)轱L(fēng)險(xiǎn)空間，有5%可能不符合要求，黃色部分為符合要求的空間，在此空間內(nèi)，滋腎通關(guān)提取物的評(píng)價(jià)指標(biāo)均能符合設(shè)定的目標(biāo)值。為進(jìn)一步確保制劑的質(zhì)量，結(jié)合生產(chǎn)情況，適當(dāng)?shù)目s小了設(shè)計(jì)空間，即為紅色虛線框部分：滋腎通關(guān)膠囊提取工藝操作空間為溶劑倍數(shù)為7 倍 ～ 9倍，浸泡時(shí)間為11 ～ 20 h，提取時(shí)間為2.1 ～ 2.5 h。

圖3 滋腎通關(guān)膠囊提取工藝的設(shè)計(jì)空間Fig. 3 Design space of extraction process of Zishen Tongguan Capsule

2.8 設(shè)計(jì)空間的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

取小試同一批次的飲片進(jìn)行設(shè)計(jì)空間的驗(yàn)證。在設(shè)計(jì)空間圖中選取5 個(gè)不同區(qū)域內(nèi)的點(diǎn)來進(jìn)行驗(yàn)證，5 點(diǎn)的選取及驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表5。結(jié)果顯示設(shè)計(jì)空間內(nèi)的點(diǎn)均滿足預(yù)設(shè)目標(biāo)：干浸膏得率在29% ～37%，黃柏堿含量≥0.14%，芒果苷含量≥0.22%，小檗堿含量≥1.2%，而空間外的點(diǎn)不能同時(shí)滿足這五個(gè)目標(biāo)，表明在設(shè)計(jì)空間內(nèi)操作能保證提取工藝達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。

表5 小試規(guī)模下設(shè)計(jì)空間驗(yàn)證結(jié)果Tab. 5 Verification results of design space in laboratory tests

分別取符合2020 年版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)的其它2個(gè)批次知母（19030207、19012603）、黃柏 （20201202、20191002）在小試條件下進(jìn)行工藝適應(yīng)性驗(yàn)證，試驗(yàn)結(jié)果見表6，空間內(nèi)的1、2 號(hào)的各指標(biāo)均在目標(biāo)值范圍內(nèi)；空間外3 號(hào)的干浸膏得率、黃柏堿低于目標(biāo)值的范圍。

表6 不同批次飲片設(shè)計(jì)空間驗(yàn)證結(jié)果Tab. 6 Verification results of design space using different batches of traditional Chinese medicine

分別取知母（19030207、19012603）、 黃柏（20201202、20191002）在中試條件（黃柏20 kg、知母20 kg、1 500 L 真空濃縮主罐）下按照表7 的條件進(jìn)行工藝適應(yīng)性驗(yàn)證。試驗(yàn)結(jié)果見表7，空間內(nèi)三批中試所得提取液各指標(biāo)均在目標(biāo)范圍內(nèi)。

表7 中試規(guī)模下的設(shè)計(jì)空間驗(yàn)證結(jié)果Tab. 7 Verification results of design space in pilot scale

3 討論

3.1 關(guān)鍵質(zhì)量屬性的選擇

干浸膏得率與中藥制劑的提取過程是直接相關(guān)的，能較好地反映提取效果。黃柏中小檗堿具有抗菌、抗炎、退熱等活性，黃柏堿具有抑制炎癥進(jìn)展的作用，知母中芒果苷、新芒果苷和知母皂苷是清熱瀉火的主要有效成分，還具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等作用[8-10]，以上各成分的藥理活性與滋腎通關(guān)膠囊治療腎虛濕熱淋癥（如：急性膀胱炎、腎盂腎炎等）的主要療效相一致，黃柏堿、小檗堿和芒果苷的含量也是2020年版《中國(guó)藥典》中“黃柏”“知母”項(xiàng)下的質(zhì)控項(xiàng)目。在建立HPLC 同時(shí)測(cè)定多種成分含量的方法時(shí)，知母皂苷類需要采用蒸發(fā)光檢測(cè)器檢測(cè)，無法與其它成分同時(shí)測(cè)定，新芒果苷因其穩(wěn)定性較差[11]，供試品中含量較低，無法滿足含量測(cè)定的要求。因此，最終以干浸膏得率，黃柏堿、芒果苷和小檗堿的含量作為關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

3.2 設(shè)計(jì)空間的確定

原料的質(zhì)量差異是造成中藥制劑質(zhì)量不穩(wěn)定的重要原因， 2020 年版《中國(guó)藥典》規(guī)定，黃柏飲片中黃柏堿含量不低于0.34%，小檗堿含量不低于3.0%，知母飲片中芒果苷含量不低于0.40%[12]?；诖藰?biāo)準(zhǔn)，結(jié)合醫(yī)院制劑大生產(chǎn)的經(jīng)驗(yàn)與需求，將優(yōu)化目標(biāo)設(shè)定為干浸膏得率在29% ～ 37%，黃柏堿含量≥0.14%，芒果苷含量≥0.22%，小檗堿含量≥1.2%。

3.3 Box-Behnken 響應(yīng)面結(jié)果分析

芒果苷擬合不顯著的原因：經(jīng)Box-Behnken 響應(yīng)面法發(fā)現(xiàn)芒果苷一次項(xiàng)回歸模型和二次項(xiàng)回歸模型擬合度均不顯著，表明預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的吻合程度較低，芒果苷含量與提取工藝參數(shù)變化關(guān)系不明確。查閱文獻(xiàn)[11]得知，知母中芒果苷含量較低且芒果苷在熱的稀乙醇中溶解度較好[13]，因此推測(cè)芒果苷在較少提取溶劑、較短提取時(shí)間內(nèi)即可基本提取完全，隨著提取溶劑體積和提取時(shí)間的增加，芒果苷含量增加不顯著。

3.4 設(shè)計(jì)空間的驗(yàn)證

本研究建立了滋腎通關(guān)膠囊的提取工藝空間，并進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證與完善。首先采用與小試同一批次的飲片進(jìn)行驗(yàn)證，分別選擇空間內(nèi)（上、下邊界處及中間）與空間外共五個(gè)點(diǎn)作為工藝條件，結(jié)果顯示：工藝參數(shù)在空間內(nèi)時(shí)，提取液的各指標(biāo)均能達(dá)到設(shè)定目標(biāo)；在空間外時(shí)，各指標(biāo)不能同時(shí)達(dá)到設(shè)定目標(biāo)。采用不同批次的飲片進(jìn)行工藝適應(yīng)性驗(yàn)證，結(jié)果表明，以符合2020 年版 《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)的飲片為原料，工藝參數(shù)在空間內(nèi)時(shí)，提取液各指標(biāo)均能達(dá)到預(yù)設(shè)目標(biāo)。最后進(jìn)行三批中試規(guī)模的驗(yàn)證，所得提取液干浸膏得率和各成分轉(zhuǎn)移率略高于小試，仍在預(yù)設(shè)目標(biāo)范圍內(nèi)。所有空間內(nèi)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：各批次提取液干浸膏得率及各成分含量的波動(dòng)范圍小于均值的10%。以上結(jié)果說明本研究建立的設(shè)計(jì)空間靈活、穩(wěn)定、高效，基于該空間所得的滋腎通關(guān)提取液質(zhì)量可靠、可控。

4 結(jié)論

本研究基于QbD 理念，采用失效模型與影響分析篩選關(guān)鍵工藝參數(shù)及關(guān)鍵質(zhì)量屬性，進(jìn)一步采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)優(yōu)化滋腎通關(guān)膠囊的提取工藝，并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際確定了最佳工藝空間，可實(shí)現(xiàn)工藝靈活、穩(wěn)定、高效，產(chǎn)品質(zhì)量可靠、可控。